UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN

VETERINAR CLUJ-NAPOCA
COALA DOCTORAL
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII

Biolog FURDUI EMILIA MARIA

CARACTERIZAREA UNOR RASE I HIBRIZI DE

VIERMI DE MTASE BOMBYX MORI L. PRIN
TEHNICI MOLECULARE
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

CONDUCTOR TIINIFIC

Prof. univ. dr. LIVIU ALEXANDRU MRGHITA

Cluj-Napoca
2011
1
 CUPRINS
Tez Rezumat
INTRODUCERE 1 6
PARTEA NTI: STUDIU DE LITERATUR 2 6
CAPITOLUL I. IMPORTANA SERICICULTURII I ISTORICUL CRETERII 3
VIERMILOR DE MTASE PE PLAN MONDIAL I N ARA NOASTR
1.1. IMPORTANA SERICICULTURII 3 6
1.2. ISTORICUL CRETERII VIERMILOR DE MTASE 6
1.3. STADIUL ACTUAL AL SERICICULTURII PE PLAN MONDIAL 8 6
1.4. STADIUL ACTUAL AL SERICICULTURII I AL CERCETRILOR 11 7
SERICICOLE N ROMNIA
1.5. IMPORTANA CERCETRII TIINIFICE A CRETERII 14 7
VIERMILOR DE MTASE
1.6. STUDIUL GENETIC AL VIERMELUI DE MTASE BOMBYX MORI 16
1.6.1. Aspectele citogenetice i moleculare la viermele de mtase Bombyx 17
mori
1.6.2. Cariotipul 18
1.6.3. Bazele cromozomale ale sexului 21
1.6.4. Studiul mutaiilor aprute la viermele de mtase 22
CAPITOLUL II. INCADRAREA TAXONOMIC I CICLUL EVOLUTIV AL 26 7
SPECIEI BOMBYX MORI L.
2.1. SISTEMATICA ZOOLOGIC A VIERMELUI DE MTASE 26 7
2.2. CICLUL EVOLUTIV AL VIERMELUI DE MTASE 28 8
CAPITOLUL III. METODE DE AMPRENTARE GENETIC 30 8
3.1. CLASIFICAREA MARKERILOR GENETICI 30
3.2. COMPARAREA DIFERITELOR TEHNICI DE MARCARE 32
MOLECULAR
3.3. EVIDENIEREA VARIABILITII GENETICE CU AJUTORUL 34 8
MARKERILOR MOLECULARI
3.3.1.Tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction) - Reacia n lan a 34
polimerazei
3.3.2. Generalitti privind tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic 36
DNA)-Amplificarea randomizat a ADN ului polimorfic
3.3.3. Generaliti privind tehnica microsateliilor: SSR-Simple Sequence 40
Repeats
PARTEA A DOUA: CERCETRI PROPRII 45
SCOPUL CERCETRILOR 46 5
OBIECTIVELE URMRITE 47 6
CAPITOLUL IV. ORGANIZAREA CRETERILOR EXPERIMENTALE DE 49 9
VIERMI DE MTASE
4.1. MATERIALUL BIOLOGIC 49 9
4.2. MATERIALE UTILIZATE LA ORGANIZAREA CRETERILOR 59 9
EXPERIMENTALE
4.3. METODE UTILIZATE LA ORGANIZAREA SERIILOR DE CRETERE 63 9
4.4. ANALIZA DATELOR 68 9

2
CAPITOLUL V- REZULTATE I DISCUII PRIVIND CRETERILE 70 10
EXPERIMENTALE
5.1. INCUBAIA OULOR I ECLOZIUNEA VIERMILOR DE MTASE 70 10
5.2. EVOLUIA STADIULUI LARVAR 76 10
5.3. INDICII BIOLOGICI AI LARVELOR 81 11
5.4. MASA GLANDELOR SERICIGENE 86
5.5. NGOGOAREA 88
5.6. INDICII BIOLOGICI AI GOGOILOR CRUDE 90 12
5.6.1. Masa gogoilor crude 90
5.6.2. Axul longitudinal i transversal al gogoilor crude 92
5.7. INDICII TEHNOLOGICI AI GOGOII USCATE 94 12
5.7.1. Masa gogoii uscate 94
5.7.2. Axul longitudinal i transversal al gogoilor uscate 96
5.7.3. Lungimea firului de mtase 97
5.8. CONCLUZII PARIALE 100 13
CAPITOLUL VI. MATERIALE I METODE UTILIZATE PENTRU 103 13
REALIZAREA ANALIZEI RAPD
6.1. MATERIALE UTILIZATE PENTRU EFECTUAREA ANALIZEI RAPD 103 13
6.1.1. Material biologic 103 13
6.1.2. Materiale chimice 103
6.1.3. Aparate electronice i instrumentar 104
6.2. METODE DE LUCRU 105 13
6.2.1. Protocolul extraciei de ADN 105 13
6.2.2. Cuantificarea ADN-ului 107 14
6.2.3. Protocolul de amplificare PCR 108
6.2.4. Componena reaciei PCR 110
6.2.5. Amplificarea PCR 112 14
6.2.6. Primerii RAPD utilizai n amplificarea ADN-ului 113
6.2.7. Electroforeza n gel de agaroz 114
6.2.8. Migrarea elecroforetic i pregtirea probelor de ADN 115 14
6.2.9. Preluarea imaginilor 117 14
6.3. ANALIZA DATELOR 117 14
CAPITOLUL VII. REZULTATE I DISCUII PRIVIND POLIMORFISMUL 123 14
OBINUT CU PRIMERII RAPD
7.1. REZULTATE PRIVIND EXTRACIA PROBELOR DE ADN 123
7.1.1. Rezultate privind extracia ADN-ului la rasele de viermi de mtase 123
7.1.2. Rezultate privind extracia ADN-ului la hibrizii de viermi de mtase 124
7.2. REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA I ELECTROFOREZA 126 15
PRODUILOR DE REACIE RAPD
7.2.1. Rezultate privind amplificarea i electroforeza produilor de reacie 126
RAPD la rasele de viermi de mtase
7.2.2. Rezultate privind amplificarea i electroforeza produilor de reacie 133
RAPD la hibrizii de viermi de mtase
7.3. CONCLUZII PARIALE 139 18
CAPITOLUL VIII. MATERIALE I METODE UTILIZATE PENTRU 141 19
REALIZAREA ANALIZEI SSR
8.1. MATERIALE UTILIZATE PENTRU REALIZAREA ANALIZEI SSR 143 19
8.1.1. Material biologic 143 19
8.1.2. Materiale chimice 143
8.1.3. Aparate electronice i instrumentar 144

3
 8.2. METODE DE LUCRU 144 19
8.2.1. Extracia ADN 144 19
8.2.2. Componena reaciei PCR 145
8.2.3. Amplificarea PCR 147 19
8.2.4. Electroforeza capilar 149
8.3. ANALIZA DATELOR 151 19
CAPITOLUL IX. REZULTATE PRIVIND POLIMORFISMUL OBINUT CU 155 19
PRIMERII SSR
9.1. REZULTATE OBINUTE CU PRIMERII SSR 155 19
9.1.1. Mrimea alelelor generate de primerii SSR 156 20
9.1.2. Structura alelic 159
9.1.3. Distribuia alelelor unice i fixe 160 20
9.2. ECHILIBRUL HARDY-WEINBERG 171
9.2.1. Rezultatele privind Echilibrul Hardy-Weinberg: locusul SAT 951 172
9.2.2. Rezultatele privind Echilibrul Hardy-Weinberg: locusul SAT 1423 174
9.2.3. Rezultatele privind Echilibrul Hardy-Weinberg: locusul TO1CTA07R 176
9.2.4. Rezultatele privind Echilibrul Hardy-Weinberg: locusul SAT 346 177
9.2.5. Rezultatele privind Echilibrul Hardy-Weinberg: locusul CA16G03R 178
9.3. INDICII DIVERSITII GENETICE 182
9.4. ANALIZA VARIAIEI GENETICE N CADRUL RASELOR I 196 21
HIBRIZILOR
9.5. CONCLUZII PARIALE 202 22
CAPITOLUL X. CONCLUZII GENERALE 205 22
ELEMENTE DE ORIGINALITATE 209 23
LISTA LUCRRILOR PUBLICATE 211
REFERINE BIBLIOGRAFIE 213 24
ANEXA 1 243
ANEXA 2 245
ANEXA 3 246
ANEXA 4 248

4
 SCOPUL CERCETRILOR
n cadrul prezentului studiu, teza de doctorat, scopul cercetrii a constat n
aprecierea unor rase i hibrizi de viermi de mtase Bombyx mori L., din Romnia prin
caracterizarea fenotipic (metode recunoscute internaional) i molecular (cu ajutorul
markerilor RAPD- Random Amplified Polymorphic DNA i SSR- Simple Sequence
Repeats). Cercetrile iniiate de noi, prin caracterizarea fenotipic i molecular a
viermilor de mtase, constituie primul studiu de acest gen n domeniu, din Romnia.

OBIECTIVELE URMRITE
Principalele obiective urmrite privind organizarea creterilor experimentale de viermi de
mtase au fost:
Inventarierea corect a unor rase i hibrizi de viermi de mtase din stocul
genetic local de Bombyx mori L. din Romnia prin controale morfologice asupra
raselor din stocul genetic, pe ou, larve, lundu-se n considerare aspectele fenotipice
conform standardelor rasei.
Indicii studiai pentru rasele parentale i hibrizi sunt:
- indicii biologici ai oului:
prolificitatea
procentul de ecloziune
- indicii biologici ai larvelor:
masa larvelor
lungimea larvelor
masa glandei sericigene
- indicii biologici ai gogoii crude:
masa gogoii crude
masa incartamentului mtsos
axul longitudinal al gogoii
axul transversal al gogoii
- indicii tehnologici ai gogoii uscate i ai fibrei:
masa gogoii uscate
masa deeului din gogoa
lungimea firului de mtase

Obiectivele cercetrilor privind caracterizarea molecular sunt:

Utilizarea tehnicilor moleculare (RAPD i SSR) n vederea identificrii
polimorfismului genetic la rasele i hibrizii luai n studiu;
Identificarea primerilor RAPD capabili s determine polimorfismul la
nivel molecular;
Stabilirea protocolului de extracii de ADN;
Depistarea gradului de nrudire ntre populaiile de viermi de mtase
Bombyx mori L. din Romnia.

5
 Alegerea primerilor SSR capabili de a diferenia rasele i hibrizii
analizai;
Extracia ADN-ului din viermii de mtase i evidenierea profilului
genetic al raselor i hibrizilor testai;
Caracterizarea molecular i diversitatea genetic a raselor i
hibrizilor de viermi de mtase luate n studiu cu ajutorul markerilor
SSR.

INTRODUCERE
Dintre toate speciile de viermi de mtase care es gogoi din fir de mtase, cea
mai mare pondere o deine viermele de mtase al dudului Bombyx mori L. (circa 90%),
urmat de viermele de mtase al ricinului i stejarului, aria de rspndire a acestor specii
fiind legat de zona de rspndire a speciilor vegetale furnizoare de hran.
ncepnd cu legenda coconului czut i metamorfozat n ceaca prinesei chineze
Xi Lingshi, acum 5000 de ani (Kurin, 2002), fluturele de mtase Bombyx mori, a fost
intim legat de umanitate. Chinezii au pstrat acest secret sute de ani, iar divulgarea
acestuia era pedepsit cu moartea.
Stnd la baza sericiculturii, fluturele de mtase a reprezentat supravieuirea
economic pentru fermierii i muncitorii din industria textil. Mtasea n sine i
comercializarea ei au mbogit activitatea uman prin art i cultur, contribuind la
crearea unei forme incipiente de globalizare timp de aproximativ 2000 de ani, pe
parcursul erei Drumului Mtsii (Kurin, 2002).
Bombyx mori fiind singura insect cu adevrat domesticit, este complet
dependent de om att pentru supravieuire ct i pentru reproducere (Hubbell, 2001).

CAPITOLUL I. IMPORTANA SERICICULTURII I ISTORICUL CRETERII

VIERMILOR DE MTASE PE PLAN MONDIAL I N ARA NOASTR

1.1. IMPORTANA SERICICULTURII

Prin creterea viermilor de mtase, se furnizeaz industriei prelucrtoare a mtsii,
materia prim, adic gogoi de mtase. Mtasea natural prezint rezisten ridicat,
finee mare (12-30 microni), luciu intens, tueu plcut i se ncarc electric mult mai
puin dect fibrele sintetice, astfel c datorit acestor nuiri este considerat fibra de
lux a industriei textile (Bura, 1992).
Patria mtsii naturale o reprezint China. Cercetrile istorice i arheologice
realizate aici au pus n eviden faptul c n jurul orelului chinez Schengze, din
regiunea Wuxion, provincia Jiangsu, locuitorii acestor meleaguri cultivau duzi, creteau
viermi de mtase i cunoteau meteugul obinerii firelor i al esturilor din mtase
natural, deoarece s-au gsit numeroase obiecte de ceramic neagr atribuite erei
neolitice, pe care figureaz viermele de mtase.

1.2. STADIUL ACTUAL AL SERICICULTURII PE PLAN MONDIAL

La ora actual, din datele raportate n anul 2009 de rile membre ale Asociaiei
Internaionale de Sericicultur (I.S.C. Website), producia mondial de gogoi
nregistrat este de 126.995 tone, primul loc n producia de mtase este deinut de China

6
(104.000 tone), urmat de India (19690 tone), Brazilia (811 tone), Uzbekistan (750 tone)
etc.

1.3. STADIUL ACTUAL AL SERICICULTURII I AL CERCETRILOR

La ora actual, sericicultura trece printr-o criz evident, producia de gogoi de
mtase fiind pe cale de dispariie. Ca potenial sericicol, Romnia deine locul al doilea n
Europa dup Frana, iar ca i producie n ara noastr se produc anual mai puin de 4 tone
de gogoi de mtase (Paca i colab., 2008b), figura 1.
Datorit condiiilor pedoclimatice favorabile cultivrii dudului, sericicultura s-a
dezvoltat foarte rapid n ara noastr.

4
3.5
3
to ne /to ns

2.5
2
1.5
1
0.5
0
2001 2002 2003 2004 2005 2006
Anul productiei/Production Year

Figura 1. Producia de gogoi ntre anii 2001-2006

1.4. IMPORTANA CERCETRII TIINIFICE A CRETERII VIERMILOR DE

MTASE
Studiul viermelui de mtase a fost iniiat in Japonia, sub impulsul dezvoltrii
sericiculturii i a industriei mtasii, dar rapid a fost promovat i ca un model valoros
pentru studiile fundamentale. Astzi viermele de mtase are un rol important n trei
domenii: cercetare, sericicultur i biotehnologii (Goldsmith i colab., 2005); n
cercetarea tiinific, viermii de mtase Bombyx mori au constituit un model privilegiat
pentru unele descoperiri n biologie, genetic i medicin, cum ar fi: analiza reglajului
genetic privind biosinteza proteinelor mtasii, dezvoltarea morfogenetic, studiul
reglrilor legate de poikiloterme, constituind premiere. Studii i cercetri au avut loc i n
alte domenii: endocrinologiei, toxicologiei, radiologiei, virusologiei i biotehnologiilor.

CAPITOLUL II. INCADRAREA TAXONOMIC I CICLUL EVOLUTIV AL

SPECIEI BOMBYX MORI L.

2.1. SISTEMATICA ZOOLOGIC A VIERMELUI DE MTASE

Viermele de mtase al dudului (Bombyx mori L.) face parte din:
ncrengtura Artropoda;
subncrengtura Mandibulata;
clasa Insecta;
subclasa Pterigota;
ordinul Lepidoptere;
seria Lepidoptere nocturne;

7
 familia Bombycidae;
genul Bombyx
specia Bombyx mori

2.2. CICLUL EVOLUTIV AL VIERMELUI DE MTASE

Viermele de mtase al dudului sau fluturele de mtase (Bombyx mori L.) face parte
din grupa insectelor care se dezvolt n cadrul unei metamorfoze complete, evolund prin
4 stadii diferite: ou (sau smna), larv (viermele de mtase), crisalid (nimf sau pup)
i fluture (adult). Dup fecundare, timp de trei zile au loc procese de embriogenez, apoi
ncepe diapauza care dureaz n funcie de ras, de factorii genetici i de mediu, la rasele
de la noi fiind de 9-10 luni, din iulie pn n aprilie. Dup diapauz, oule sunt puse n
condiii optime, incubeaz timp de 10-14 zile, proces care se ncheie cu ecloziunea
larvelor. Stadiul larvar variaz n funcie de ras, fiind cuprins ntre 25 i 35 de zile,
larvele evolund prin cinci vrste, delimitate de patru perioade de repaus, numite
somnuri, timp n care are loc schimbarea tegumentului n urma nprlirilor.

CAPITOLUL III. METODE DE AMPRENTARE GENETIC

3.1. EVIDENIEREA VARIABILITII GENETICE CU AJUTORUL

MARKERILOR MOLECULARI
Markerii RAPD (Random amplified polymorphic DNA - polimorfisme de ADN
amplificate aleator) sunt rezultai prin amplificarea PCR a unor segmente necunoscute de
ADN genomic cu ajutorul unei amorse decamere aleatoare (Williams i colab., 1990), a
fost utilizat intens n mai multe scopuri, de exemplu: identificarea genelor (Aufauvre i
colab., 1992; Ballinger-Crabtree, 1992), variabilitatea genetic a populailor (Lehmann,
1992; Chatterjee i colab., 2004;), hri cromozomale i relaii filogenetice (Kazan i
colab., 1993). Produii de amplificare se separ prin electroforez n gel de agaroz i se
evideniaz n lumin UV dup o colorare prealabil cu un colorant specific, imaginea
obinut numindu-se fingerprint.
Markerii RAPD se comport ca markeri dominani cnd sunt urmrii n
descenden. Diversitatea genetic i relaiile de nrudire dintre indivizi se evalueaz pe
baza prezenei sau absenei benzilor, rezultnd o amprent genetic specific.
Avantajele analizei RAPD: relevarea unui numr mare de polimorfisme, costuri
sczute, utilizarea metodelor de vizualizare prin fluorescente n local celor bazate pe
radioactivitate; analizarea unui numr mare de probe ntr-o zi; un implic un grad foarte
ridicat de pregtire al personalului din laborator;
Dezavantaje: comportamentul dominant al markerilor RAPD;
Microsateliii (ADN nalt repetitiv) sau SSR (Simple Sequence Repeats) sunt
secvene scurte nalt repetate, care conin de obicei 2 5 perechi de baze, repetate n
tandem, care flancheaz o secven unic de ADN (Field i colab., 1996).
Microsateliii au devenit foarte utilizai n multe aplicaii precum: cartografierea
genomului uman (Dib i colab., 1996), al cinilor (Ostander i colab., 1993), al oarecilor
(Dietrich i colab., 1996) al ginilor (Crooijmans i colab., 1996) al viermilor de mtase
Bombyx mori (Prasad i colab., 2005a) dar i a multor specii de plante (Akkaya i colab.,
1995), n filogenie (Morin i colab., 1994), a structurii genetice a populaiilor (Bruford i
colab., 1993), n conservarea genetic (Gotelli i colab., 1994) i n criminalistic (Jung,
1989; Jeffreys i colab., 1991).

8
 Polimorfismul apare datorit variaiei n numr a repetiiilor n tandem n urma
amplificrii PCR cu amorse complementare secvenelor ce flancheaz ADN-ul
microsatelit (secvene conservate n cadrul speciei, uneori i a genului). Avantajele
markerilor SSR sunt date de: polimorfismul ridicat, distribuia lor uniform n genom,
reproductibilitate mare i codominan. Dintre dezavantaje principalul impediment este
reprezentat de costul elaborrii primerilor i de necesitatea cunoaterii secvenei de ADN
de interes.
CAPITOLUL IV. ORGANIZAREA CRETERILOR EXPERIMENTALE
DE VIERMI DE MTASE

4.1. MATERIALUL BIOLOGIC

n cadrul experimentelor efectuate n anul 2009, materialul biologic a fost
constituit din:
-7 rase de viermi de mtase: RG 90; AC/T (Alb de Cislu); AB (Alb de
Bneasa); IBV; AC 29/T (Alb Chinezesc); B1 (Bneasa1); S8;
-8 din hibrizii consacrai: S8 X AC29/T (Ana 1); AC 29/T X S8 (Ana 2); AC x B1
(Cislu 1); B1 X AC (Cislu 2); B1 X SVILA2 (Bulgaria); B1 X HESA2 (Bulgaria);
B

HESA1 X SVILA 2 (Bulgaria); VRATZA 35 X SVILA 2 (Bulgaria);

4.2. MATERIALE UTILIZATE LA ORGANIZAREA CRETERILOR

EXPERIMENTALE
Dintre materialele utilizate la organizarea metodei de cretere a viermilor de
mtase se face referire la plantaia de duzi i frunzele de dud administrate, spaiul
destinat creterii seriilor experimentale i materialele de ngogoare utilizate.

4.3. METODE UTILIZATE LA ORGANIZAREA SERIILOR DE CRETERE

incubaia oulor viermilor de mtase-metoda ridicrii treptate a temperaturii;
Metodologia condiiilor de cretere i dezvoltare a larvelor; T: 26-27C, 25-26 C,
23-24 C; H: 80-85%, 75%, 65-70%;
ngogoarea: T-22 C, H-65%;
Etufarea gogoilor;
Devidarea gogoilor;

4.4. ANALIZA DATELOR

PAST 2.04; Coeficientul de variabilitate (V%);
Avnd n vedere obiectivele propuse s-au efectuat determinri astfel:
Numrul de indivizi studiai a fost diferit n funcie de nsuirile analizate. Astfel
pentru parametrii biologici ai pontelor (prolificitate, numr de ou eclozionate i procent
de ecloziune) rezultatele exprim media a 4 ponte diferite, att la rasele ct i la hibrizii
studiai;
Masa i lungimea larvelor a fost studiat pentru 20 de indivizi, masa glandei
sericigene a fost determinat prin cntrirea glandelor extrase de la 20 larve, au fost
efectuate determinri a masei gogoilor crude i uscate, a incartamentul mtsos, ale
axului longitudinal i transversal al gogoilor crude i uscate asupra unui numr de 20 de
gogoi, masa deeului i lungimea firului de mtase au fost determinate pe 10 gogoi.

9
 CAPITOLUL V- REZULTATE I DISCUII PRIVIND CRETERILE
EXPERIMENTALE

5.1. INCUBAIA OULOR I ECLOZIUNEA VIERMILOR DE MTASE

700
Number of eggs/ hatching

560

Number of eggs/ hatching

Numar de oua/ ponta

Numar de oua/ ponta

600 550 y = 18.129x - 1194.7
500 2
R = 0.3482
540
400
300 530
y = -19.814x + 2438.3 520
200 2
100 R = 0.1937 510
0 500
95 96 97 98 94 94.5 95 95.5 96
Procent de ecloziune (%) Procent de ecloziune (%)
Hatching percentage (%) Hatching percentage (%)

Rase Hibrizi
Figura 2. Curba de regresie liniar privind procentul de ecloziune i numrul de
ou/pont

Prin corelarea direct a procentului de ecloziune cu numrul de ou/ pont, (figura

2) att pentru rase ct i pentru hibrizi, s-a observat o legtur mult mai puternic n cazul
hibrizilor, apreciat prin coeficientul de regresie liniar (R2 = 0.3482), fa de (R2 =
0.1937) al raselor.

5.2. EVOLUIA STADIULUI LARVAR

n ceea ce privete durata stadiului larvar n cazul raselor, (figura 3), este cuprins
ntre 29 de zile la rasa B1 i 31 de zile la rasele AC29/T, AB i RG90.

31

30.5
E v o lu tia s ta d iu lu i la r v a r (z ile )

31
31

31
E v o lu tio n a r y s ta g e s o f

30
30
la r v a e (d a y s )

30
30

29.5

29
29

28.5

28
AC 29/T AC/T AB B1 RG 90 IBV S8

Rase/Races

Figura 3. Durata stadiului larvar la rasele luate n studiu

10
 30

30
29.5

29

E v o lu tio n a ry sta g e s o f la rv a e (d a y s)
E v o lu tia sta d iu lu i la r v a r (z ile )

29

29
29
28.5

28

28

28
28

28
27.5

27

V R A T Z A 35X S V IL A 2
H E S A 1X S V IL A 2

B 1X S V IL A 2

B1X H E SA 2
ACX B1
B1X A C

A C 2 9 /T X S 8

S 8 X A C 2 9 /T

Hibrizi/Hybrids

Figura 4. Durata stadiului larvar la hibrizii luai n studiu

Durata stadiului larvar n cazul hibrizilor, (figura 4), este cuprins ntre 28 de zile la
hibrizii B1 X AC, AC x B1, HESA1 x SVILA2, B1 x SVILA2 i 30 de zile la
B

VRATZA35 x SVILA2.

5.3. INDICII BIOLOGICI AI LARVELOR

6 5.2
5
Masa larvelor (g)
Larvae weigth (g)

Masa larvelor (g)

5
Larvae weigth (g)

4 4.8
3 4.6
y = 0.9643x - 2.5281
2 4.4
y = 2.3741x - 12.479 2
R = 0.2204
1 2 4.2
R = 0.9458
7.2 7.4 7.6 7.8 8
0
6 6.5 7 7.5 Lungimea larvelor (cm)
Larvae length (cm)
Lungimea larvelor (cm)
Larvae length (cm)

Rase Hibrizi

Figura 5. Curba de regresie liniar privind lungimea i masa larvelor la rase i hibrizi

n cazul raselor de viermi de mtase prin corelarea direct a lungimii i masei

larvelor, figura 5, se poate observa o corelaie pozitiv, apreciat prin coeficientul de
regresie liniar (R2=0.9458), ceea ce semnific faptul c lungimea larvelor se coreleaz
aproape perfect cu masa larvelor. n cazul hibrizilor, prin coeficientul de regresie liniar

11
(R2=0.2204), corelaia obinut este una pozitiv dar slab datorit valorilor prezentate la
hibridul B1x Svila2.

5.4. INDICII BIOLOGICI AI GOGOILOR CRUDE

Tabelul 1
Mediile i parametrii dispersiei calculai pentru masa gogoilor crude

Masa
incartament
Masa Dev. Err. Dev. Err.
Ras/Hibrid N V% ului V%
gogoii (g) std. std. std. std.
(g)

AC 29/T 1.54 0.24 0.06 15.60 0.35 0.03 0.01 8.57

AC/T 1.49 0.21 0.09 14.09 0.36 0.05 0.01 13.88
AB 1.63 0.16 0.05 9.80 0.33 0.04 0.01 12.12
B1 1.59 0.20 0.06 12.57 0.36 0.03 0.01 8.33
RG90 1.51 0.27 0.08 17.88 0.27 0.04 0.01 14.81
IBV 1.21 0.17 0.03 14.05 0.29 0.05 0.01 17.24
S8 1.76 0.19 0.04 10.81 0.36 0.02 0.00 5.55
B1X AC
B 20 1.77 0.12 0.03 6.78 0.37 0.02 0.01 5.40
ACX B1 1.62 0.16 0.05 9.87 0.33 0.01 0.00 3.03
AC29/TXS8 1.78 0.13 0.04 7.30 0.35 0.01 0.00 2.85
S8XAC29/T 1.80 0.19 0.05 10.55 0.37 0.03 0.01 8.10
HESA1XSVILA2 1.68 0.23 0.07 13.69 0.35 0.03 0.01 8.57
B1XSVILA2
B 1.94 0.20 0.06 10.30 0.41 0.03 0.01 7.31
B1X HESA2
B 1.70 0.17 0.05 10.00 0.36 0.04 0.01 11.11
VRATZA35XSVILA2 1.78 0.13 0.04 7.30 0.36 0.02 0.00 5.55

Masa gogoilor crude, conform datelor prezentate n tabelul 1, atinge valori

maxime de 1.94 g la hibridul B1 X SVILA2 i valori minime de 1.21 g la rasa IBV,
avnd o medie de 1.65 g.

5.5. INDICII TEHNOLOGICI AI GOGOII USCATE

n urma determinrilor s-a putut observa c cea mai mare valoare medie de 0.87 g
a fost nregistrat la rasa RG 90, iar cea mai mic medie de 0.59 g la rasa AB i la
hibridul B1X AC, media masei gogoilor uscate a raselor i hibrizilor fiind de 0.69 g,
valoarea medie minim a incartamentului a fost nregistrat la rasa IBV 0.17 g, iar
valoarea maxim de 0.34g la rasa AC29/T.
Coeficienii de variabilitate obinui pentru masa gogoii uscate i masa
incartamentului mtsos sunt n toate cazurile sub 15%, lucru care denot o mare
omogenitate a raselor i hibrizilor analizai.
n ceea ce privete lungimea filamentului, valoarea medie maxim de 1256 m s-a
nregistrat la hibridul AC29/T X S8, iar cea minim 1008 m la hibridul B1X HESA2, se
constat c rasele sunt cuprinse ntre hibrizi, avnd valori maxime de 1210 m la rasa
AC/T i valori minime de 1038 m la rasa IBV.

12
 Tabelul 2
Mediile i parametrii dispersiei calculai pentru masa gogoilor uscate
Masa
Masa incartam
Dev. Err. Dev. Err.
Rase/Hibrizi N gogoii V% entului V%
std. std. std. std.
(g) (g)

AC 29/T 0.83 0.06 0.02 7.228 0.34 0.04 0.02 11.76

AC/T 0.79 0.03 0.01 3.797 0.25 0.01 0.00 4.000
AB 0.59 0.06 0.01 10.16 0.21 0.02 0.00 9.523
B1 0.76 0.04 0.01 5.263 0.19 0.01 0.00 5.263
RG 90 0.87 0.09 0.02 10.34 0.22 0.03 0.00 13.63
IBV 0.62 0.02 0.01 3.225 0.17 0.04 0.01 23.52
S8 0.61 0.04 0.01 6.557 0.25 0.01 0.00 4.000
B1X AC 20 0.59 0.03 0.01 5.084 0.29 0.01 0.00 3.448
ACX B1 0.65 0.08 0.02 12.30 0.25 0.02 0.01 8.000
AC29/TXS8 0.63 0.04 0.01 6.349 0.26 0.01 0.00 3.846
S8XAC29/T 0.77 0.09 0.02 11.68 0.27 0.01 0.00 3.703
HESA1XSVILA2 0.68 0.08 0.02 11.76 0.19 0.01 0.00 5.263
B1XSVILA2 0.69 0.08 0.04 11.59 0.21 0.04 0.01 19.04
B1X HESA2 0.65 0.05 0.01 7.692 0.27 0.05 0.02 18.51
VRATZA35XSVILA2 0.74 0.05 0.02 6.756 0.23 0.02 0.00 8.695

5.6. CONCLUZII PARIALE

n privina indicelui biologic al masei larvelor, coeficientul de variabilitate
prezint o medie de 8.04%, se poate observa o mare omogenitate a raselor studiate.
Prin corelarea direct a lungimii i masei larvelor la rase, se poate observa o
corelaie pozitiv, apreciat prin coeficientul de regresie liniar (R2=0.9458), ceea ce
semnific faptul c lungimea larvelor se coreleaz aproape perfect cu masa larvelor.

CAPITOLUL VI. MATERIALE I METODE UTILIZATE PENTRU

REALIZAREA ANALIZEI RAPD

6.1. MATERIALE UTILIZATE

S-au luat n studiu ca i material biologic n prima etap: 6 rase: AB, IBV, B1,
RG90, AC29/T, AC/T i 2 hibrizi: H1 = AC/T x S8XAc29/T; H2 = AC/T x
AC29/T;
- iar n etapa a doua 8 din hibrizii consacrai: S8 x AC 29/T, AC 29/T x S8, AC x B1,
B1 x AC, Hesa1 x Svila2, B1 x Svila2, B1 x Hesa2, Vratza35 x Svila2 i o ras S8;
B

6.2. METODE DE LUCRU

6.2.1. Protocolul extraciei de ADN

n vederea obinerii unui ADN de calitate care s poate fi utilizat n tehnica RAPD,
n prima etap s-a izolat ADN genomic din ou de viermi de mtase provenite de la S.C.
Sericarom Bneasa.

13
 n a doua etap s-a efectuat izolarea ADN din ou (Hesa1 x Svila2, B1 x Svila2, B1
x Hesa2, Vratza35 x Svila2) i din poriunea posterioar a glandei sericigene a viermelui
de mtase din vrsta a V-a (S8 x AC 29/T, AC 29/T x S8, AC x B1, B1 x AC, S8) larvele de
viermi de mtase au fost crescute n modul sericicol familial n cadrul laboratorului de
Apicultur-Sericicultur, USAMV Cluj-Napoca, fiind prelevate n vrsta a V-a i pstrate
n condiii optime la -20 C pn la folosirea lor.
Dup izolarea materialului biologic s-a realizat mrunirea i omogenizarea lui
prin mojararea cu azot lichid conform cu protocolul descris de Suzuki i colab., n anul
1972. Extracia ADN a continuat folosind kitul de extracie: Wizard Genomic DNA
Purification Kit [PROMEGA]-(WGDP)- care este un kit de extracie ce furnizeaz ADN
de puritate ridicat.

6.2.2. Cuantificarea ADN-ului

Metoda uzual de apreciere a puritii ADN-ului este cea spectrofotometric, n
vederea cuantificrii ADN-ului extras, s-a folosit Spectofotometrul NanoDrop ND-1000.

6.2.3. Amplificarea PCR

Amplificarea PCR a ADN-ului genomic s-a efectuat cu un numr de 44 primeri
RAPD, conform protocolului de amplificare descris de ctre Williams i colab., 1990,
modificat de Nagaraja i i colab., n anul 1995, acest protocol de amplificare a fost
optimizat n funcie de termocycler-ul utilizat n anul 2009 (BioRad, iCycler),
temperatura utilizat n actualul experiment fiind cu 1-2 C mai mic, iar n cazul
extensiei timpul a fost redus la jumtate. n vederea evidenierii polimorfismelor ntre
rasele i hibrizii de viermi de mtase luai n studiu, au fost alei 44 de primeri RAPD, n
concordan cu literatura de specialitate.

6.2.4. Migrarea elecroforetic -n gel de agaroz 2%;

6.2.5. Preluarea imaginilor -Vizualizarea produilor de amplificare prin electroforez se

evideniaz n lumin UV, se realizeaz capturarea imaginii gelului de agaroz cu
ajutorul sistemului UVP (BioSpectrum AC Imaging System) BioChemi HR Camera
(Made in Japan), SYBR Gold 485-655nm filter imaginea obinut se numete fingerprint.

6.3.ANALIZA DATELOR
n prima etap: analiza bioinformatic a datelor s-a efectuat cu Neighbour
Joinning analyse, Coeficientul Nei-Li, Bootstrap 1000.
n etapa a doua: interpretarea rezultatelor s-a efectuat cu programul Free Tree
0.9.1.50, utiliznd coeficientul Jaccard pentru distanele genetice, respectiv metoda
UPGMA;
CAPITOLUL VII. REZULTATE I DISCUII PRIVIND
POLIMORFISMUL OBINUT CU PRIMERII RAPD

7.1. MATERIALUL BIOLOGIC

S-a prelevat material biologic (ou de Bombyx mori) i s-a observat c prin
mojararea cu azot lichid conform (Suzuki, 1972), a rezultat o mai bun mrunire i
omogenizare a probelor.

14
 7.2. REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA I ELECTROFOREZA
PRODUILOR DE REACIE
Fragmentele de ADN au fost amplificate fr probleme i datorit folosirii n
amestecul de reacie a PVP-ului n procent de 2%. Din cei 44 de primeri RAPD testai, au
fost utilizai mai departe pentru evaluarea diversitii genetice a tuturor hibrizilor un
numr de 35. Reaciile cu primerii RAPD au generat un total de 876 de fragmente
polimorfice, cu o medie de 8,9 fragmente/primer. Aceti 35 de primeri au fost alei n
funcie de numrul de benzi polimorfice date i repetabilitatea amplificrilor.

Ladder AB IBV B1 RG90 H1 H2 AC29/T AC/T

Figura 6 .Ampliconii obinui cu ajutorul primerului OPF 20

Figura 7. Dendrograma, generat de programul TreeView alctuit pe baza distribuiei

genetice dintre unele rase de viermi de mtase, dup metoda Neighbour Joinning analyse,
utiliznd coeficientul Nei-Li/Dice i programul FreeTree

15
 Din dendrogram se poate observa clasificarea probelor studiate n trei grupuri.
Valorile prezentate n dreptul nodurilor dendrogramei reprezint rezultatul analizei
bootstrap asupra arborelui, executat n 1000 de repetiii. Proba H2 este foarte ndeprtat
genetic de grupul format din ceilali indivizi analizai, clasificare susinut de o valoare
maxim de bootstrap, 100. Este firesc acest lucru datorit faptului c acesta este un
hibrid. Probele AB i H1 au format un grup, iar probele AC29/T, AC/T, B1, IBV i RG90
au format un alt grup. Valorile de bootstrap sunt nfiate pe dendrogram n drepturile
nodurilor, prezentnd valori peste 50, excepie de la acest fapt, fiind valoarea de 22, care
susine clasificarea grupelor formate din probele AB i H1 i respectiv, AC29/T, AC/T,
B1, IBV i RG90.
Tabelul 3
Analiza valorilor calculate ale indicilor afereni similitudinii genetice
la rasele i hibrizii analizai
Rasa/
AB IBV B1 RG90 H1 H2 AC29/T AC/T
Hibridul
AB
IBV 0,42
B1 0,58 0,62
RG90 0.21 0,43 0,47
H1 0.75 0,50 0,63 0,27
H2 0,65 0,46 0,50 0,25 0,69
AC29/T 0,62 0,48 0,59 0,24 0,69 0,64
AC/T 0,57 0,56 0,57 0,38 0,62 0,59 0,65

H1 = AC/T x S8xAC29/T;
H2 = AC/T x AC29/T.

Cea mai mare similitudine genetic (0,75), a fost nregistrat ntre indivizii AB i
H1, iar cea mai mic similitudine genetic (0,21) a fost nregistrat ntre indivizii AB i
RG90. Distana genetic medie ntre indivizii studiai a fost de 0,48.
n etapa a doua 21 de primeri din totalul de 35 de primeri utilizai au generat 921
de benzi polimorfice care au putut intra n analiza matematic-statistic de interpretare a
relaiilor de filogenie Total Lab 120, UVP soft.
Se poate observa datorit dendrogramei gruparea probelor luate n studiu n trei
grupe, prima coninnd hibridul Hesa 1 x Svila 2 care este ndeprtat fa de grupurile
formate de ceilali indivizi, observaie susinut de o valoare foarte mare de bootstrap
egal cu 100. Apariia benzilor non-parentale la proba care conine hibridul Hesa 1 x
Svila 2, generate prin metoda s-a ncercat a fi explicat prin mai multe ipoteze: formarea
moleculelor de heteroduplex ntre alele, mutaii sau recombinri la nivelul locusurilor de
ataare a amorsei sau n interiorul fragmantelor de amplificat, sau competiia pentru
locusurile de ataarea Nicese i colab., 1998.
Al doilea grup este format din 2 subgrupuri, n primul subgroup este clasificat
proba care conine rasa S8, iar n cel de-al doilea subgroup este mprit n dou grupe
care include n prima probele Ac29/T x S8 i S8 x Ac /T care au o similitudine genetic
indicat de bootstrap cu valoarea 51, iar n a doua probele AC x B1 i B1x Ac au o
valoare de boostrap de 70.

16
 Al treilea grup este format din 2 subgrupuri: primul doar din proba B1x Hesa 2, iar
al doilea din B1 x Svila 2 i Vratza 35 x Svila 2.
Analiza RAPD reliefeaz faptul c urmtoarele probe luate n studiu sunt aproape
identice din punct de vedere molecular: AC x B1 i B1 xAC- avnd o valoare ce 70 in
dreptul nodului, B1 x Svila i Vratza 35 x Svila2- sunt foarte aproape identice din punct
de vedere molecular avnd o valoare de bootstrap de 90. Analiza datelor prelucrate
folosind, Coeficientul Jaccard, cu ajutorul programului Free Tree i Bootstrap 1000 este
evideniat n tabelul 4, datele sunt prelucrate folosind metoda UPGMA, Coeficientul
Jaccard, Bootstrap 1000.

Outgroup

HESA1xSVILA2
100
S8

AC29/TxS8
100 29
51
S8xAC29/T
40
ACxB1
56 70
B1xAC

B1xHESA2

28
B1xSVILA2
90
VRATZA35
XSVILA2

Figura 8. Dendrograma, generat de programul TreeVie, alctuit pe baza distribuiei

genetice dintre unii hibrizi i o ras de viermi de mtase prin metoda UPGMA, utiliznd
coeficientul Jaccard cu ajutorul programului FreeTree

Media distanelor genetice ntre hibrizii i rasa luat n studiu este 0,53; cea mai

17
 mic distan genetic este 0,302; ntre S8 i B1 x Svila, iar cea mai mare distan
genetic, 0,753; este ntre S8 x AC 29/T i B1X AC;
Tabelul 4
Analiza valorilor calculate ale indicilor afereni similitudinii genetice
la probele analizate

Vratza35
Race/ B1x Hesa1x S8xAC2 B1x AC29/
x Svila2 B B

ACxB1 S8 B1xAC
Svila2 Svila2 9/T Hesa2 TxS8
B

Hybrid

Vratza35 x Svila2
B1 X Svila2
B 0.557
Hesa1 X Svila2 0.689 0.481
S8XAC29/T 0.639 0.479 0.553
B1X Hesa2
B 0.444 0.438 0.532 0.527
ACXB1 B 0.582 0.365 0.352 0.503 0.436
S8 0.609 0.302 0.494 0.434 0.440 0.376
AC29/TXS8 0.393 0.538 0.591 0.599 0.452 0.516 0.523
B1 X AC
B 0.590 0.664 0.672 0.753 0.652 0.687 0.708 0.495

7.3. CONCLUZII PARIALE

n prima etap: s-au efectuat extracii de ADN din ou de Bombyx mori i s-a
observat c prin mojararea cu azot lichid rezult o mai bun mrunire i
omogenizare a probelor;
Din cei 44 de primeri utilizai la rase 34 au generat benzi polimorfice;
Distana genetic medie ntre indivizii studiai a fost de 0,48;
Se evideniaz faptul c exist diferene majore de nivel genetic ntre rasele
studiate, ceea ce denot ca aceste rase de Bombyx mori sunt populaii locale cu un
profil genetic bine conturat, n care fluxul genic intrapopulaional a condus la
diferenierea unui ansamblu stabil de gene coadaptate.
n etapa a doua, s-au efectuat extracii de ADN din ou i glande sericigene din
larve de viermi de mtase de vrsta a cincea, s-a observat c puritatea cea mai mare
s-a obinut la probele care conineau glande sericigene;
Din cei 35 de primeri utilizai 21 au generat benzi polimorfice
Distana genetic medie ntre probele analizate s-a dovedit a fi relativ mare 0.53 i
poate fi datorat apartenenei hibrizilor la dou rase diferite, ct i originii
ndeprtate a acestor rase.

18
 CAPITOLUL VIII. MATERIALE I METODE UTILIZATE PENTRU
REALIZAREA ANALIZEI SSR

8.1. MATERIALE UTILIZATE

8.1.1. Material biologic
Materialul biologic a fost reprezentat de: 7 rase crescute n anul 2009: AB, IBV,
B1, RG 90, Ac 29/T, Ac/T , S8; 3 rase crescute n anul 2011 AB, B1, AC/T i 8
hibrizi: S8 x Ac 29/T, Ac 29/T x S8, Ac x B1, B1 x Ac, Hesa1 x Svila 2, B1 x Svila 2,
B1 x Hesa 2, Vratza 35 x Svila 2; Pentru o analiz ct mai complet s-au luat cte 10
indivizi din fiecare ras i hibrid.

8.2. METODE DE LUCRU

8.2.1. Extracia ADN
S-au preluat de la -20 C cte 10 viermi de mtase din fiecare ras i hibrid luat n
experiment, izolarea ADN-ului a fost efectuat din poriunea mijlocie a glandei
sericigene a fiecrui vierme de mtase. Extracia a fost efectuat cu Chelex 5%.

8.2.2. Cuantificarea ADN-ului-la terminarea incubaiei s-a citit cantitatea i puritatea

ADN-ului cu ajutorul unui Spectrofotometru UV-VIS NanoDrop ND-2000;

8.2.3. Amplificarea PCR

Amplificarea PCR s-a realizeat prin repetarea a 35 de cicluri ntr-un termocycler
(BioRad C 1000); Au fost testai nou primeri SSR nemarcai fluorescent, secvenele lor
fiind preluate din literatura de specialitate, iar din acetia s-au ales cinci primeri (SAT
951, SAT 1423, TO1CTA07R, SAT 346, CA16G03R) la care secvenele forward au fost
marcate. De asemenea, pentru reducerea costurilor de rulare a electroforezei capilare,
primerii au fost marcai cu fluorocromi diferii (D2, Cy5, Cy5.5), putndu-se realiza
astfel un multiplex. Protocolul GenomeLab Fragment Analysis Protocol a fost adaptat
astfel c s-au pregtit produii rezultai din amplificarea PCR pentru introducerea lor n
echipamentul Beckman.

8.3. ANALIZA DATELOR

Analiza cromatogramelor a fost realizat cu ajutorul programului CEQTM
Fragments Analysis distribuit de Beckman Coulter. Programul GenAlEx 6.41, testul
Chi-ptrat pentru evidenierea echilibrului genetic HW; testul AMOVA (analiza
molecular a coeficientului de varian), coeficientul RST i coeficientul Nei, programul
StatSoft Inc., Statistica data analysis software sistem, version 10.

CAPITOLUL IX. REZULTATE PRIVIND POLIMORFISMUL OBINUT CU

PRIMERII SSR
9.1. REZULTATE OBINUTE CU PRIMERII SSR
Rezultatele obinute privind puritatea ADN-ului, n urma extraciei cu Chelex 5 %,
evideniaz avantajul utilizrii lui ca metoda de extracie, pe care o putem considera
rapid, putnd fi uor de depozitat la 4 C.

19
 Aceast metod de extracie a fost pus la punct n prezenta tez de doctorat i
reprezint o premier ca metod de extracie i purificare a ADN-lui la viermii de mtase
din Romnia.
9.1.1. Mrimea alelelor generate de primerii SSR
Tabelul 5
Alelele obinute cu primerii SSR la viermii de mtase
Primer
SAT 951 SAT 1423 TO1CTA07R SAT 346 CA16G03R
Nr.de alele
6 8 6 4 7
Alele
97 159 244 131 224
99 161 246 135 226
105 165 248 139 236
111 167 264 141 238
113 169 266 244
117 171 282 246
173 248
177
Numrul de alele identificate de fiecare primer este cuprins ntre patru la primerul SAT
346 i opt la primerul SAT 1423.
n ceea ce privete rasa S8, i hibridul S8 X AC29/T aceasta se afl n echilbru
genetic Hardy-Weinberg pentru toi cei cinci loci analizai, fiind singurele aflate n
echilibru genetic pentru toi loci utilizai. Media numrului de indivizi analizai este de
7.400.30, numrul mediu de alele pe locus este de 2.400.11, numrul efectiv de alele
pe locus este de 1.830.08.
Heterozigoia observat (Ho), are valori mai mici dect heterozigoia ateptat, per
total locusuri prezint o valoare de 0.2900.031 fa de He care are o valoare de
0.3740.026, ceea ce semnific c 29% din 180 de indivizii analizai sunt heterozigoi.
Conform mediei indicelui de fixare pentru rasele i hibrizi analizai n prezentul
studiu, a rezultat c acetia prezint un exces de homozigoi.

9.2. DISTRIBUIA ALELELOR

Figura 9. Distribuia alelelor

20
9.3. ANALIZA VARIAIEI GENETICE N CADRUL RASELOR I HIBRIZILOR

Intre
populatii/
Among
Pops
23%
Intre
indivizi/
Among
Indiv
77%

Figura 10. Coeficientul de varian molecular ntre probele analizate

n figura 10, se poate constata c coeficientul de varian molecular are valori de

23% ntre cele 18 populaii analizate (nsumnd cele 18 rase i hibrizi analizai), ca
rezultat al originii diferite al raselor i hibrizilor. ntre indivizi, coeficientul de varian
molecular a nregistrat valori de 77%.
Valorile obinute att ntre populaii ct i ntre indivizii sunt considerate valori
mari care evideniaz faptul c rasele i hibrizii analizai ca populaie, dar i indivizii ce
compun populaia (indivizi ce aparin raselor i hibrizilor de viermi de mtase) sunt
diferii genetic.

Figura 11. Histograma distribuiei distanei genetice la indivizii analizai

n figura 11. sunt mai bine evideniate distanele genetice a celor 153 de probe analizate,
distana medie nregistrat pentru a acestea fiind de 0.51.

21
 Distanele genetice foarte mari identificate la rasa IBV, confirm faptul c rasa
IBV este singura dintre rasele luate n analiz care are origini foarte diferite de celelate
rase, deoarece este o ras la origine polivoltin, ns de-a lungul timpului prin selecie i
aclimatizare a devenit monovoltin, acest lucru nefiind considerat un impediment
deoarece de-a lungul anilor s-a demonstrat c aceast ras este una stabil i omogen,
lucru dovedit i de analizele SSR.

9.4. CONCLUZII PARIALE

1. S-au utilizat cinci primeri marcai pe care i-am adnotat (SAT 951, SAT
1423, TO1CTA07R, SAT 346, CA16G03R), fiecare primer a fost utilizat
individual pentru amplificarea probelor, iar n momentul introducerii lor n
Beckman, a fost dezvoltat un sistem de amplificare multiplex pentru a
reduce costurile de rulare a electroforezei capilare.
2. Coeficientul de varian a identificat valori distins semnificative ntre rasele
i hibrizii analizai (23%) i (77%) ntre ndivizii analizai.

CAPITOLUL X. CONCLUZII GENERALE

1. Acest studiu reprezint primul de acest gen din Romnia, importana lui
fiind dat de necesitatea caracterizrii moleculare a raselor i a hibrizilor de
viermi de mtase din specia Bombyx mori L., care fac parte din fondul
genetic sericicol autohton al Romniei.

2. n prezentul studiu s-au utilizat dou tehnici moleculare, mai precis doi
markeri moleculari pentru analizele propuse: markeri RAPD- folosii n
analizele de screening i markeri SSR-utilizai pentru caracterizarea
molecular a raselor i hibrizilor de viermi de mtase Bombyx mori, din
Romnia.

3. n urma creterilor experimentale efectuate s-a putut realiza o clasificare a

raselor i hibrizilor n funcie de fiecare parametru studiat astfel:
prolificitatea: rasa AC/T; hibridul B1 X Hesa2;
procentul de ecloziune: rasa IBV; hibridul Hesa1 x Svila2;
lungimea larvelor: rasa AC29/T; hibridul B1X AC;
masa larvelor: rasa AC/T; hibridul B1 X Hesa2;
masa glandelor sericigene: rasa B1; hibridul B1 X Svila 2;
masa gogoii crude i a incartamentului: hibridul B1 X Svila 2;
masa gogoii uscate- rasa RG90;
masa incartamentului: rasa AC29/T;
lungimea firului de mtase: hibridul: AC29/T X S8.

4. Se evideniaz faptul c exist diferene majore de nivel genetic ntre rasele

i hibrizii analizai, ceea ce denot c acetia sunt populaii locale cu un

22
 profil genetic bine conturat, n care fluxul genic intrapopulaional a condus
la diferenierea unui ansamblu stabil de gene coadaptate.

5. n ceea ce privete rasa S8, i hibridul S8 X AC29/T acetia se afl n

echilibru genetic Hardy-Weinberg pentru toi cei cinci loci analizai.

6. Heterozigoia observat (Ho), are valori mai mici dect heterozigoia

ateptat, pe total locusuri prezint o valoare de 0.2900.031 fa de He
care are o valoare de 0.3740.026, ceea ce semnific c 29% din 180 de
indivizii analizai sunt heterozigoi.

7. Conform mediei indicelui de fixare pentru rasele i hibrizi analizai n

prezentul studiu, a rezultat c acetia prezint un exces de homozigoi.

ELEMENTE DE ORIGINALITATE
1. Gradul de noutate al tezei const n faptul c rasele i hibrizii de viermi de
mtase Bombyx mori au fost caracterizate complet, att fenotipic prin
metode standardizate ct i molecular printr-o analiz primar RAPD i o
analiz mai complex cea a microsateliilor.

2. Protocolul de extracie ADN cu Chelex 5% i proteinaz K utilizat,

reprezint o premier n ceea ce privete utilizarea lui la viermii de mtase
din Romnia.

3. Datorit locusurilor evideniate prin studiul de polimorfism s-au putut

identifica rasele i hibrizii predispui la o depresie de consangvinizare n
urmtorii ani, acestea prezentnd nc de pe acum un exces de homozigoi.

RECOMANDRI I PERSPECTIVE

1. Se recomand continuarea cercetrilor n ceea ce privete studierea

polimorfismului n special a analizei SSR la toate rasele i hibrizii din fondul
genetic autohton pentru a crete valoarea informaiilor despre acestea i pentru
a identifica rase genitoare de hibrizi heterozigoi.

2. n vederea unei mai bune conservrii a raselor i hibrizilor de viermi de mtase

care fac parte din fondul genetic sericicol autohton al Romniei, este necesar
stabilirea ct mai exact a variabilitii genetice a acestora, aceasta este bine s
fie determinat pe dou niveluri: fenotipic i genotipic.

23
 REFERINE BIBLIOGRAFICE

1. Akkaya, M. S., Shoemaker, R. C., Specht, J.E., Bhagwat, A. A., and P. B.,
Cregan, 1995, Integration of simple sequence repeats DNA markers into a
soybean linkage map. Crop. Sci. 35, 1439-1445.
2. Aufauvre-Brown, A., J. Cohen, and D.W. Holden, 1992, Use of Randomly
Amplified Polymorphic DNA Markers to Distinguish Isolates of Aspergillus
fumigatus, J. Clin. Microbiol., 30, 299l -2993.
3. Ballinger-Crabtree, M. E., W. C. V. Black, and B. R. Miller (1992). Use of
Genetic Polymorphisms Detected by the Random Amplified Polymorphic DNA
Polymerase DNA Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR) for Differentiation
and ldentification of Aedes Aegpti Subspecies and Population, Amer. J. Trop.
Med & Hyg., 47, 893-901.
4. Bruford, M.W. and R.K. Wyne, 1993, Microsatellites and their application to
population genetic studies. Curr. Opin. Genet. Dev. 3, 939-943.
5. Bura, M., 1992, Curs de tehnologia produciei sericicole. Universitatea de
tiine Agricole a Banatului Timioara.
6. Chatterjee, S.N. and T. Tanushree, 2004, Molecular Profiling of Silkworm
Biodiversity in India: An Overview. Russian Journal of Genetics, Vol. 40, No.
12, 2004, pp. 1339-1347. From Genetika, Vol. 40, No. 12, 1618-1627.
7. Crooijman, R.P.M.A., P.A.M. Vanoers, J.A. Strijk, J.J. Vanderpoel, M.A.
M., Groenen, 1996, Preliminary linkage map of the chicken (Gallus domesticus)
genome based on microsatellite markers- 77 new markers mapped. Poult. Sci.
75: 746-754.
8. Dib, C., Sabine Faur, Ccile Fizames, Delphine Samson, Nathalie Drouot,
A. Vignal, P. Millasseau, Sophie Marc, J. Kazan, E. Seboun, M. Lathrop, G.
Gyapay, J. Morissette and J. Weissenbach, 1996, A comprehensive genetic
map of the humain genome based on 5264 microsatellites, Nature 380:152-154.
9. Dietrich, W.F., J. Miller, R. Steen, M.A. Merchant, D. Damronboles, Z.
Husain, R. Dredge, M.J. Daly, K.A. Ingalls, T.J. OConnor, C.A. Evans, M.
M., DeAngelis, D.M. Levinson, L. Kruglyak, N. Goodman, N.G. Copeland,
N.A. Jenkins, T.L. Hawkins, L.Stein, D.C. Page, and E.S. Lander, 1996, A
comprehensive genetic map of the mouse genome, Nature, 380:149-152.
10. Field, D., and C. Willis, 1996, Long polymorphic microsatellites in simple
microorganisms. Proc. R. Soc. Lond. Ser. B. Biol. Sci. 263:209, 215.
11. Goldsmith, M.R., T. Shimada and A. Hiroaki, 2005, The genetics and
genomics of the silkworm, Bombyx mori, Annual Review of Entomology,
Proquest Agricultura Journals,71.
12. Gotelli, D., C. Sillero-Zubiri, G.D. Applebaum, M.S. Roy, D.J. Girman, J.
Garcia-Moreno, E.A. Ostrander, and R.K. Wayne, 1994, Molecular genetics
of the most endangered canid: The Ethiopian wolf Canis simensis., Mol. Ecol. 3,
301-312.
13. Hubbell, S., 2001, Shrinking the Cat: Genetic Engineering Before We Knew
about Genes. Boston: Houghton Mifflin, 175.

24
 14. Jeffreys, A.J., A.J. Allen, E. Hagelberg, and A. Sonnberg, 1991,
Identification of the skeletal remains of Josef Mengele by DNA analysis. Nature,
352, 427-429.
15. Jung, D.S., I.J. Rhe, S.M. Lee, 1989, Classification and selection of the
breeding materials in the silkworm, Bombyx mori, by multivariate analysis.
Classification of the silkworm genetic stoks by principal component analysis and
cuuster analysis. Miryang National Junin. Coll. Of Agriculture and Sericiculture,
Miryana, Korean Journal Of Sericicultural Science (Korea Republic), 31:2, 102-
112.
16. Kazan, K., J. M. Manners, and D.F. Cameron, 1993, Genetic Relationships
and Variation in the Stylosanthes guianensis complex assessed by Random
Amplified Polymorphic DNA, Genome, 36, 43-49.
17. Kurin, R., 2002, The Silk Road: Conecting Cultures, Creating Trust Talk Story,
Fall, Smith-sonian Center for Folklife and Cultural Heritage 21, 1-11.
18. Lehmann, P.F., D. Lin, and B.A. Lasker, 1992, Genotypic Identification of
Characterization of Species and Strains within the Genus Candida by Using
Random Amplified Polymorphic DNA, J. Clin. Microbiol., 30, 3249-3254.
19. Morin, P.A., J.J. Moore, R. Chakraborty, L. Jin, J. Goodall, and D.S.
Woodruff, 1994, Kin selection, social structure, gene, flow and evolution of
chimpanzees, Science, 265, 1193-1201.
20. Nagaraja, G.M. and J. Nagaraju, 1995, Genome fingerprinting of the
silkworm, Bombyx mori, using randim arbitrary primers, Electrophoresis, 16,
1633-1638.
21. Nicese, F.P., J.I. Hormaza, and G.H. Mcgranahan, 1998, Molecular
characterization and genetic relatedness among walnut (Juglans regia L.)
genotypes based on RAPD markers, Euphytica 101, 199206.
22. Ostander, E.A., J.F. Sprague, and J.Jr. Rine, 1993, Identification and
characterization of dinucleotide repeat (CA)n markers for genetic mapping in
dog, Genomics 16, 207-213.
23. Paca, I., L.Al. Mrghita, D. Dezmirean, Laura Laslo, Georgeta Dini, O.
Maghear, Dana Pusta, R. Morar, A. Cmpean, R. Oroian, Claudia Bagita,
2008b, Technological features of parental breeds dry cocoon and hybrid
combinations on mulberry silkworm (Bombyx mori L.) SERISTECH, The
Proceedings of the First Internatiolnal Conference Sericulture From
Tradition to Modern Biotechnology, U.S.A.M.V. Cluj-Napoca, Editura
AcademicPres, 17 18 aprilie, ISBN 978-973-744-109-6, 119 132.
24. Prasad, D.M., M. Muthulakshmi, M. Madhu, Sunil Archak, K. Mita and J.
Nagaraju, 2005a, Survey and Analysis of Microsatellites in the Silkworm,
Bombyx mori: Frequency, Distribution, Mutations, Marker Potential and Their
Conservation in Heterologous Species, Genetics 169, 197214.
25. Suzuki, Y., L. Gage, and D.D. Brown, 1972, The genes for silk fibroin in
Bombyx mori, J., Mol. Biol., 70, 637649.
26. Williams, J.G. K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski, and S.V. Tingey,
1990, DNA Polymorphism Amplified by Arbitrary Primers Are Useful Genetic
Markers, Nucl. Acids Res.,18, 653l -6535.

25