Schema generală, simplificată, a dezvoltării

unei metode HPLC

Informaţii cu privire la probă Validarea metodei
- definirea scopurilor

Sunt necesare operaţii

preliminare? - prep.probă, Recuperare, analiză
metode speciale, etc. calitativă, analiză cantitativă

Alegere detector şi a Verificare, evaluarea

parametrilor de lucru aferenţi problemelor analitice

Alegerea metodei de LC – Optimizarea procesului

estimarea cond. de separare cromatografic şi a separării
 Date esenţiale cu privire la probă

● Numărul de compuşi prezenţi

● Structura chimică a acestora
● Masa moleculară
● Spectrele UV ale compuşilor (de preferat şi
spectrele MS, FT-IR, RMN)
● Domeniul de concentraţii de interes
● Solubilitatea probei ! În condiţiile metodei
 Strategia de stabilire a metodei LC

● Determinarea modului de lucru în funcţie de

caracteristicile probei (masă moleculară,
polaritate, caracter ionic, costuri aferente)
● Selectarea tipului şi dimensiunilor coloanei
cromatografice
● Ajustarea tăriei solventului, ε0
● Ajustarea selectivităţii pentru R > 1.5 - 2
Determinarea modului de lucru
 Îmbunătăţirea selectivităţii
● modificarea polarităţii solventului din amestecul de solvenţi
● Avantaje – uşor de realizat

● Dezavantaje – control mai slab în special izocratic

● Schimbarea solventului

● Avantaje – se impune dacă prima metodă nu dă

rezultate
● Dezavantaje – necesită mai multe analize

● Amestec mai complex de solvenţi

● Avantaje – duce la separări mai bune

● Dezavantaje – număr mare de probe

● Schimbarea coloanei

● Avantaje – poate îmbunătăţi mult separarea

● Dezavantaje – demontare, echilibrare

● Schimbarea temperaturii de separare

● Avantaje – scade viscozitatea, scade t

r
● Dezavantaje – necesită coloană termostatată,

modificarea selectivităţii este mai redusă decât în

cazul celorlalţi parametrii, uzează coloana
ANALIZA CALITATIVĂ ŞI CANTITATIVĂ -
ÎNTRE OPTIM, FEZABIL ŞI INCERT -
 Analiza calitativă – cerinţe şi etape

● Identificarea unor compuşi necunoscuţi din amestecul

de analizat – prin metode de cromatografie preparativă
urmate de analiză spectrală sau metode spectrometrice
cuplate on-line (se impune utilizarea a cel puţin unei
metode spectrale pentru confirmare) – principalele
variante: MS, FT-IR, UV-VIZ/fluorescenţă, RMN, etc.
● Confirmarea poziţiei relative a unuia sau mai multor

compuşi cunoscuţi din cromatogramă – prin etaloane şi

metode bazate pe retenţia relativă – de preferat cu
coloană de confirmare sau prin metodă spectrometrică.
● Etape: identificare – comparaţie cu spectre de
referinţă – comparare cu date de retenţie – verificare
prin altă metodă spectrală sau conexă
 Argumente în favoarea necesităţii
dezvoltării metodelor de analiză cantitativă

● păstrarea liniarităţii răspunsului detectorului numai pentru

domenii relativ mici de concentraţie (1-2 ordine de mărime)
● răspunsul diferit al detectorului pentru compuşi cu
structuri diferite
● răspunsul diferit al detectorului în funcţie de principiul de
detecţie utilizat
● răspunsul diferit al detectorului la lungimi de undă diferite
● saturarea detectorului sau depăşirea domeniului de
funcţionare a acestuia
 Domeniul util de lucru în
analiza cantitativă

LRL
Intensitate

LMC => limita măsurătorii cantitative

LMC LRL => limita răspunsului linear

Domeniu util

Concentraţie
 Elemente esenţiale pentru realizarea
cu succes a analizei cantitative
● alegerea corectă a metodei pentru separarea
compuşilor de analizat (GC sau LC)
● reali zarea corect ă a anal izei calitative, evaluarea

corect ă a interferenţelor
● opt imizarea procesului de injecţie-separare-detecţie

● alegerea corectă a domeniului de concentraţii

pentru evitarea extrapol ăril or şi păstrarea liniarităţii

● uti lizarea unui material de ref erinţă de calitate,

păstrat corespunzător şi în domeniul de valabilit at e

● corelarea volumului de injecţie cu capacitatea

coloanei pent ru probă şi saturarea detectorului

● alegerea corectă a sistemului de detecţie

● alegerea şi apl icarea corectă a metodei de anali ză

cantitativă
● evaluarea realistă a factoril or de incertit udine

● evaluarea realistă a rezultat elor statistice şi a

rezultatelor val idării

 Alegerea metodei de măsurare
a picurilor cromatografice

● înălţimea picului

● aria picului

rezoluţie slabă

rezoluţie bună

metoda de corecţie a
liniei de bază
 Metode de analiză cantitativă

● normarea de arie
● normarea de arie cu factori de răspuns
● metoda standardului extern
● metoda standardului intern
● metode mixte
● metoda adaosului
 Metoda normării de arie

%A %B %C %D

A
A C

B
D
Metoda normării de arie
cu factori de răspuns cromatograma probei

fA fB fC fD concentraţia
probei
A
A C

B
D
proba etalon
Metoda standardului extern
curba de calibrare
B pentru B
3
etaloane c1,c2,c3, ...
pentru A+B+C
C
A
2 y = a*x + b
ecuaţia dreptei
1 de regresie
pentru B

concentraţia
PROBA arie pentru B
pentru B
 Metoda standardului intern
B
A proba concentraţia concentraţia
pentru A pentru B

fIs

varianta simplificată proba + Is Is B

! Is cu structură chimică A
apropiată cu A şi B

! Is între A şi B ca timp
de retenţie

! Is cu concentraţie
apropiată de A şi B
 Metoda standardului intern

c1 A B c1
c2 c2
c3 Is c3
... ...

curba de calibrare curba de calibrare

pentru A pentru B

y1 = a1*x + b1
y = a*x + b

concentraţia concentraţia
pentru A pentru B
PROBA