UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ

VETERINARĂ DIN BUCUREŞTI

FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ

SPECIALIZAREA CONTROLUL ŞI EXPERTIZA PRODUSELOR

ALIMENTARE

PROIECT LA DISCIPLINA
REZIDUURI MEDICAMENTOASE

Student:
MACSIM ROXANA

BUCUREŞTI
2019
METODE DE IDENTIFICARE A
SULFAMIDELOR ÎN LAPTE
 INTRODUCERE

Sulfadimetoxina, sulfametoxazolul, sulfaquinoxalina si sulfadiazinele sunt

cele mai folosite sulfonamide in medicina veterinara. Daca perioada de asteptare
nu este respectata, produsele de origine animala pot fi contaminate cu reziduuri din
aceste substante. Interesul pentru detectarea acestor reziduuri este foarte actual.

Ordonanța pentru laptele pasteurizat al Administrației pentru Alimentație

și Medicamente au cerut ca laptele producătorilor să fie testat pentru antibiotice de
cel puțin patru ori în timpul tratamentului pe perioadă consecutivă de 6 luni.

Deși medicamentele cu sulf sunt utilizate în mod obișnuit împreună cu

antibioticele pentru a trata mastita bovină, procedura de testare utilizată
este, în general, insensibila la sulfamide.

Exista in prezent metode chimice pentru detectarea sulfamidelor în

lapte;cu toate acestea, procedurile analitice implicate sunt mult mai complexe decât
cele pentru antibiotice utilizate in prezent pentru testele de rutină.

S-a dorit dezvoltarea unei proceduri de testare de rutină in detectarea

sulfamidelor, precum și antibioticele utilizate în mod obișnuit pentru a trata
mastita,cu condiția ca testul dezvoltat să nu fie mai complex decât metoda descrisă
pentru detectarea lui Bacillus subtilis în metodele standard pentru examinare de
produse lactate.
MATERIALE SI METODE

Prepararea plăcilor de testare.

Trei organisme sporogene si doua nesporogene
au fost utilizate pentru testarea sensibilității.Acestea au fost B. subtilis ATCC
6633, B. cereus ATCC11778, B. megaterium ATCC 9855, Sarcina lutea ATCC
9341 și Escherichia coli ATCC 11229. Sporii de B.subtilis au fost obținuți de la
Difco Laboratories,Inc. Suspensiile de spori de B. cereus și B. megaterium
au fost preparate prin creșterea celulelor în Sporulația AK Mediu nr. 2 (BBL) în
sticle de prescripție,incubate timp de 48 de ore la 35 ° C. Suspensiile de S. lutea și
E. coli au fost preparate zilnic din șuvițe de agar Mueller-Hinton care au fost
incubate timp de 18 până la 20 ore la 32 ° C. Trei transferuri succesive au fost
realizate înainte ca celulele sa fie recoltate și utilizate.
Sporii crescuti sau culturile de celule vegetative au fost indepartate de pe agar cu
apă distilată tamponată cu fosfat și centrifugate la o forță centrifugă relativă de
5.000 rotatii/min pentru 15 minute la 3 ° C și procesul de spălare prin centrifugare
a fost repetat de trei ori. Sporii au fost pastrati în apă de diluare tamponată la 4 °C
până la utilizare. Tot inoculul (celulele vegetale sau sporii) a fost ajustat la
densitatea optimă pentru a se obține o concentrație finală de aproximativ
5 x 104 pe ml de agar. A fost adăugat inoculul peste agar la 50 °C, agarul inoculat
a fost amestecat ușor, prin rotire, pentru a evita formarea bulelor de aer.
4ml de agar a fost pipetat intr-un vas de plastic Petri cu diametrul interior de 90
mm, iar agarul a fost distribuit in tot vasul prin rotirea acestuia. A fost pregătit agar
proaspăt pentru fiecare zi de testare, iar sporii, atunci cand au fost utilizați,
nu au suferit un soc de caldura.
Pregătirea și testarea probelor de lapte.
In acest studiu a fost folosit laptele crud. Discuri care conțin un derivat de sulf sau
un antibiotic au fost preparate prin cântărirea inhibitorului din test și adaugata în
apă distilată. Din aceasta,o cantitate adecvată a fost adăugată in lapte și s-au
efectuat diluții seriate ale inhibitorului în lapte. Un mililitru de lapte care conține
inhibitor a fost adăugat la proba martor de 0,5 inch (12,7 mm),discurile au fost
plasate pe agarul solidificat pentru testarea inhibitorilor. Temperaturile de 25, 32,
35,și 37 ° C au fost utilizate pentru diferite perioade de incubare.
Măsurătorile zonei au fost făcute cu un etrier avand plăcile din spate iluminate de
lumina fluorescenta ușoară. Au fost zone cu diametrul de 15 mm sau mai mare
înregistrat ca pozitiv (diametrul discului este de 12,7 mm). Pentru testele de rutină,
orice zonă ar trebui înregistrată ca pozitivă furnizând controalele corespunzătoare.
Criteriul de 15 mm a fost folosit în acest studiu pentru că a dat o zonă care nu ar
putea fi confundata nici macar de un analist relativ neinstruit. Toate sensibilitățile
minime raportate au fost obținute în cel puțin două studii.

Rezultate si discutii

Au fost selectate opt sulfamide și nouă antibiotice pentru studiu, și procedura de

testare a inhibitorului enumerat în Metodele standard pentru Examinarea
produselor lactate, a fost utilizată pentru a stabili sensibilitatea procedurii ,acum în
general fiind utilizata pentru testarea de rutina față de inhibitorii selectați.(Tabelul
1).
TABELUL 1. Sensibilitatea procedurii de testare a lui B. subtilis standard pentru
inhibitorii medicamentelor sulfatice și a antibioticelor

Se crede că insensibilitatea generala din metoda standard pentru sulfamide a

fost rezultatul mediei (Mediu antibiotic Nr. 1) conținând acid p-aminobenzoic sau
acid folic sau amândouă. Din moment ce B. subtilis produce bacitracina,este
insensibil la ea.
Agarul Mueller-Hinton a fost folosit pe scară largă pentru detectarea sulfamidelor,
și acest mediu a fost folosit pentru a testa sensibilitatea a cinci specii de bacterii la
cei 17 inhibitori aflați în studiu.În toate cazurile, incubarea a fost la 37 ° C
pentru un timp de incubare determinat anterior ,si au oferit zone optime cu
organismul de testare. S.lutea și B. megaterium au fost mai sensibile la
inhibitorii de test decât celelalte trei organisme testate.
Socul de caldura asupra sporilor de B.cereus, B. subtilis și B. megaterium nu au
determinat o creștere a sensibilitatii sau nu a redus semnificativ timpul de testare.
TABELUL 2. Sensibilitatea a cinci organisme de testare la sulfamide și antibiotice
atunci când sunt incubate la 37 ° C în agar Mueller-Hinton

Deoarece incubarea la 37 ° C nu este frecvent utilizată în laboratoarele de testare a

laptelui, temperaturi de incubare de 35, 32 și 25 au fost studiate pentru a determina
dacă ar putea fi la fel de utile ca temperatura 37 C.
TABELUL 3. Efectul temperaturii de incubație pe sensibilitatea lui B. megaterium
la 17 inhibitori compuși când au fost testați în agar Mueller-Hinton
In general, sensibilitatea procedurii creste odata cu cresterea temperaturii de
incubare,și 37 ° C a fost temperatura aleasa. Metodele standard pentru examinarea
produsele lactate recomandă ca toate tipurile de lapte să fie încălzite la 82 ° C timp
de 2 până la 5 minute pentru a evita raportarea rezultatelor fals-pozitive din
substantele inhibitorii naturale din laptele crud. Deoarece aceasta face parte din
procedura de testare și ar afecta sensibilitatea aparenta daca unul din inhibitori sunt
sensibili la caldura,de aceea toți cei 17 inhibitori aflați în studiu au fost analizați în
lapte înainte și după încălzire când au fost incubați la 25, 32, 35 și 37 ° C.

In nici un caz nu a fost modificata sensibilitatea aparentă a testului mai mult de un

pas într-o serie de diluții duble după ce laptele care conține inhibitorii a fost
încălzit. Această variație este normală pentru această procedură atunci când este
utilizata pentru testarea repetitivă a laptelui ce contine un inhibitor. Spre deosebire
de rezultatele Marth, Alexander și Hussong (2) in studiile despre efectului
încălzirii laptelui asupra sensibilității aparente, tehnica de încălzire de 82 ° C timp
de 3 minute nu a avut efect asupra penicilinei. Asta poate se datorează tehnicilor de
încălzire utilizate in acele timpuri,deoarece Marth și colab. au fiert in abur laptele
de test timp de 7 minute înainte de testare.

In cazul penicilinei,pentru indentificare se folosesc discuri de penicilinază si se

verifica daca antibioticul este inactivat de către enzimă.În mod similar, s-au testat
discuri de 0,5 inch (12,7 mm) impregnate cu 50 ug de acid p-aminobenzoic pentru
utilitatea lor în identificarea unui inhibitor ca sulfamida. Aceste discuri au fost
realizate prin adăugarea acidului în soluție apoasă in disc, urmată de uscarea
discului la 40 până la 44 ° C. Aceste discuri au inactivat proprietățile inhibitorii ale
tuturor sulfamidelor studiate în concentrații de cel puțin 5 g de derivat de sulf pe
disc. În consecință, se consideră că această tehnică este utilă în identificarea unui
inhibitor necunoscut ca sulfamida.
Din studiile realizate, se crede că cele enumerate mai jos sunt cele mai importante
etape pentru detectarea sulfamidelor și a antibioticelor din lapte:

1. se adaugă spori de B.megaterium ATCC 9855 la agar Mueller-Hinton la

50 ° C pentru a se obține o concentrație finală de spori de 5 x 104 per ml de
agar;
2. se distribuie 4 ml de agar inoculat într-o placă petri cu fund plat cu diametrul
interior de circa 90 mm și se agită vasul astfel încât agarul să acopere
suprafața vasului;
3. se permite agarului să se solidifice pe o suprafață plană;
4. se foloseste hartie de filtru pentru ca proba de lapte prelevata sa ude discul
prin actiunea capilara, și se plaseaza discul pe suprafața agarului inoculat;
5. se incubeaza plăcile la 37 ° C timp de 4 până la 5 ore;
6. să examineze zonele de inhibiție;
7. identificarea zonelor utilizând tehnicile convenționale descrise în Metodele
Standard Pentru Examinarea Produselor Lactate, incluzând încălzirea
laptelui la 82 ° C timp de 2 până la 5 minute pentru a detecta inhibitorii
naturali. Discurile care conțin acid p-aminobenzoic pot fi utilizate pentru a
identifica inhibarea de la sulfamide.

Se crede ca inlocuirea procedurii Bacillus megaterium-Mueller-Hinton pentru cea

care este acum folosită în mod obișnuit pentru testarea laptelui, oferă avantajul
sensibilității la sulfamide și la bacitracină.Acest lucru se realizează fără o
modificare semnificativă a sensibilității față de celelalte antibiotice testate și fără
ca procedura de testare să fie mai dificil de realizat. Din aceste motive, se consideră
că procedura descrisă merită considerată o metodă standard pentru testarea de
rutina a antibioticelor și sulfamidelor din lapte.
 Impactul sulfamidelor asupra sănătății umane

Sulfonamidele au potențialul de a provoca o varietate de reacții adverse, inclusiv

tulburări ale tractului urinar, tulburări hemopoietice, porfirie(tulburare care
afectează sistemul nervos sau a pielii, sau ambele. Fiecare tip de porfirie se
datorează deficitului de unul dintre enzimele necesare pentru a face o substanță în
organism numit hem) și reacții de hipersensibilitate. Atunci când sunt utilizate în
doze mari, acestea pot provoca o reacție alergică puternică. Cele mai grave dintre
acestea sunt descrise ca reacții adverse cutanate severe (SCAR) și includ sindromul
Stevens-Johnson, necroliza epidermică toxică (cunoscută și sub numele de
sindromul Lyell), sindromul DRESS și o reacție de tip SCAR care nu este la fel de
gravă. Aproximativ 3% din populație are reacții adverse atunci când este tratată cu
antimicrobiene sulfonamide. De notat este observația că pacienții cu HIV au o
prevalență mult mai mare, la aproximativ 60%.
Două regiuni ale structurii chimice a sulfonamidei sunt implicate în reacțiile de
hipersensibilitate:
1. Primul este inelul heterociclic N1, care determină o reacție de
hipersensibilitate de tip I.
2. A doua este azotul N4 amino care, într-un proces stereospecific, formează
metaboliți reactivi care determină fie citotoxicitate directă, fie răspuns
imunologic.
Cele mai frecvente manifestări ale unei reacții de hipersensibilitate la
medicamentele cu sulf sunt erupții cutanate și urticarie. Cu toate acestea, există,
printre altele, mai multe manifestări de hipersensibilitate la medicamentele
sulfatice, inclusiv sindrom Stevens-Johnson, necroliză epidermică toxică,
agranulocitoză, anemie hemolitică, trombocitopenie, necroză hepatică fulminantă
și pancreatită acută.
 BIBLIOGRAFIE

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC377285/
2. https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60062a013
3. https://ro.wikipedia.org/wiki/Sulfamide