REGULI DE PROTECŢIE ÎN LABORATORUL DE

BIOCHIMIE

1. Sunt esenţiale în laborator păstrarea ordinii şi a curăţeniei precum şi organizarea judicioasă a

lucrului.
2. În laborator nu se mănâncă, nu se bea, nu se fumează.
3. Glumele proaste sunt interzise.
4. Echipamentul necorespunzător şi expedientele reprezintă primul pas spre un accident.
5. În timpul lucrului, în laborator este obligatorie purtarea halatului.
6. Nu lăsaţi nesupravegheată niciodată o experienţă în timp ce se efectuează o operaţie de
încălzire sau când reacţia are loc rapid.
7. În laborator nu se poartă:
- pantofi decupaţi sau sandale;
- lentile de contact sub care pot pătrunde substanţe chimice volatile şi iritante;
- îmbrăcăminte prea largă care poate intra în contact cu substanţele sau cu focul deschis;
- părul lung desfăcut.
8. Sticlele cu reactivi se astupă imediat după utilizare pentru a se evita schimbarea dopurilor de
la o sticlă la alta.
9. Pipetarea substanţelor toxice, volatile, corozive nu se va face niciodată cu gura ci numai cu
ajutorul pompiţelor de cauciuc.
10. Pipetarea produselor biologice se va face numai cu pipete prevăzute cu vată la capătul de
aspiratie.
11. Pentru evitarea impurificării reactivilor, surplusul rămas în pipetă sau în alt vas nu se toarnă
înapoi în sticlă, ci se aruncă într-un vas special pentru colectură.
12. La încălzirea eprubetelor cu soluţii se evită direcţionarea gurii vasului spre persoanele din
apropiere pentru a preîntâmpina stropirea lor cu lichid fierbinte. Încălzirea eprubetelor direct pe
flacără se va face numai sub agitare continuă.
13. În cazul lucrului cu substanţe toxice şi/sau corozive se vor purta mănuşi de cauciuc şi
ochelari de protecţie.
14. Substanţele toxice, corozive şi cele volatile se vor depozita şi manipula numai în nişă
prevăzută cu instalaţie de ventilaţie. După manipulare ventilaţia va fi pornită minimum 10
minute.
15. Se evită orice contact al reactivilor cu ochii şi mucoasele.
16. Dacă v-aţi stropit pe piele cu substanţe corozive şi/sau toxice, spălaţi-vă cu multă apă rece.
17. Dacă v-aţi stropit cu substanţe toxice şi /sau corozive liposolubile, utilizaţi pentru clătire
soluţii de polietilen glicol.
18. Dacă v-aţi stropit hainele cu substanţe corozive şi/sau toxice scoateţi-le imediat şi, în măsura
posibilităţilor, spălaţi-le cu multă apă.
19. Substanţele corozive pătrunse în ochi trebuiesc cu grijă îndepărtate prin clătirea ochilor cu în
jet de apă nu prea puternic. După aceea, ochii se rotesc în toate direcţiile pentru a verifica
eficienţa clătirii.
20. În chiuvetă nu se aruncă substanţe corozive (acizi, alcalii).
21. În chiuvetă nu se aruncă hârtii, cioburi chibrituri etc.

1
22. Examinaţi cu atenţie sticlăria înainte de a o utiliza. Nu o utilizaţi dacă este zgâriată, ciobită,
plesnită.
23. Nu folosiţi vase murdare, crăpate sau cu marginile ciobite.
24. Nu amestecaţi acid sulfuric şi apă în cilindri gradaţi deoarece căldura reacţiei îi poate sparge.
25. Nu folosiţi vase cu fundul plat la instalaţii de vacuumare deoarece apare pericolul imploziei.
Fac excepţie flacoanele Kitasato, speciale pentru astfel de manipulări.
26. Nu încălziţi vase de sticlă direct pe flacără, ci pe sită de azbest.
27. Nu apucaţi şi nu transportaţi vasele de sticlă de gât, dop sau braţul lateral ci de baza lor.
28. Nu forţaţi introducerea dopurilor de cauciuc sau a manşoanelor nelubrifiate în vase sau
tubulaturi din sticlă.
29. Nu puneţi la încălzit vase de sticlă crăpate.
30. Nu răciţi şi nu încălziţi brusc sticlăria.
31. Nu încălziţi direct la flacără sticlăria gradată (cilindri, baloane cotate, pipete, etc.).
32. Când se lucrează la vacuum sau sub presiune ridicată este indicată folosirea unui ecran de
protecţie din plexiglas.
33. Nu creaţi niciodată vacuum sau presiuni ridicate în aparatura de sticlă în mod brusc. Supuneţi
instalaţia unor modificări lente şi treptate de presiune.
34. Pentru etanşarea instalaţiilor folosiţi vaselină siliconată.
35. Dacă s-au spart vase de sticlă, cioburile mari se îndepărtează cu o mătură, iar cioburile mici,
cu ajutorul unei cârpe ude, care se aruncă ulterior.
36. Aparatele electrice trebuie să aibă izolaţie perfectă şi prize împământate. Nu se manevrează
cu mâinile ude.
37. Fiecare laborator trebuie dotat cu extinctor şi dulap de prim ajutor.
38. La terminarea lucrărilor fiecare student trebuie să spele, toată sticlăria utilizată, cu detergent
şi cu apă caldă şi s-o clătească cu apă distilată. Instalaţiile de gaz şi robinetele de apă vor fi
închise iar aparatele electrice deconectate de la reţea.
39. Înainte de părăsirea laboratorului spălarea mâinilor cu apă şi săpun este obligatorie.
40. Reactivii din laborator nu se gustă şi nu se miros puternic.
41. În laborator nu se depozitează haine şi bagaje.
42. În laborator se execută numai lucrările indicate. Orice alte lucrări se fac numai cu acordul şi
sub îndrumarea unui cadru didactic.
43. Masa de lucru se menţine în permanenţă curată. În acest scop, fiecare student trebuie să aibă
o cârpă de laborator.
44. Pipetarea lichidelor toxice se face cu pipete speciale , prevăzute cu bule de siguranţă , pentru
a evita orice posibilitate de accidentare ;
45. Întotdeauna se adaugă acizii în apă şi niciodată apa în acizi ;
46. Sticlele şi recipienţii cu reactivi se astupă imediat după folosire ;
47. Reactivii neutilizaţi sau contaminaţi nu se pun niciodată înapoi în vasele din care au fost
scoşi ,ci se aruncă astfel :
 substanţele solide – în recipiente pentru reziduuri ;
 lichidele solubile-în chiuvetă , lăsând să curgă apă în exces ;
 lichidele insolubile în apă-se depozitează în recipiente speciale ;
48. În cazul supraîncălzirii lichidelor se folosesc bucăţele de piatră ponce sau porţelan poros ,
care provoacă o fierbere progresivă şi liniştită a lichidelor ; piatra ponce sau porţelanul poros se
vor introduce întotdeauna în lichidul rece şi nu în cel fierbinte;

2
49. Spălarea vaselor se face imediat după terminarea operaţiei la care au fost folosite , cu lichide
potrivite în care impurităţile respective sunt solubile , pentru a preveni reacţiile vătămătoare;
50. Acizii se păstrează în sticle cu dop rodat ; acidul fluorhidric se păstrează în recipiente de
polietenă sau de ebonită;
51. Soluţiile de hidroxizi se păstrează în sticle cu dopuri de cauciuc ;
52. În orice moment fiti atenti la ceea ce faceţi!

ACORDAREA PRIMULUI AJUTOR

Orice accident trebuie anunţat imediat cadrului didactic îndrumător.

În cazul arsurilor chimice, se îndepărtează îmbrăcămintea, se spală cu apă din abundenţă
regiunea arsă, apoi se neutralizează arsura astfel:
-arsurile provocate de acizi se spală cu o soluţie rece de 2% NaHCO3;
-arsurile provocate de alcalii se spală cu soluţie 4% acid boric sau 2% acid acetic.
După neutralizare, se unge cu grijă rana cu jecolan şi se pansează.
-arsurile cu brom sau acid bromhidric se tamponează local cu soluţia 2% tiosulfat de
sodiu.
Dacă o substanţă corozivă a pătruns în ochi se spală ochii cu apă multă, apoi,
folosindu-se paharul spălător de ochi şi pipeta, se neutralizează cu soluţie 3% bicarbonat de
sodiu sau 2% acid boric, după cum arsura se datoreşte acizilor sau alcaliilor.
 Dacă acidul a pătruns în gură, se clăteşte gura cu multă apă şi apoi se bea lapte. Nu se
provoacă vomă!
 Dacă bazele tari au pătruns în gură, se clăteşte gura cu multă apă şi apoi cu oţet diluat
sau cu suc de lămâie. Se provoacă vomă prin administrarea de ulei vegetal.
 În cazul arsurilor provocate prin căldură, se îndepărtează resturile de îmbrăcăminte şi
apoi, în funcţie de gradul arsurii, se va proceda după cum urmează:
- la arsurile de gradul 1 (roşeaţă) se tamponează rana cu alcool şi se unge cu jecolan, ulei
de peşte, Bioxiteracor, etc.;
- la arsurile de gradul 2 (băşici), se tamponează rana cu o soluţie 3% permanganat de
potasiu sau cu o soluţie 5% tanin proaspăt preparată;
- la arsurile de gradul 3 (distrugerea ţesutului), se acoperă rana cu pansament steril şi se
aşteaptă medicul.
 În cazul intoxicaţiilor acute, primul ajutor constă în scoaterea accidentatului din
mediul toxic şi transportarea lui într-o încăpere bine aerisită. Accidentatul este aşezat în poziţia
culcat şi i se îndepărtează îmbrăcămintea dacă aceasta este imbibată cu substanţă toxică. Se
anunţă urgent medicul.
 Pentru intoxicatiile cu arsen sau stibiu se provoacă vomă cu ajutorul unei soluţii de
sulfat de magneziu. Se administrează un antidot constând din: 300mL apă+ 100g sulfat feric+
suspensie de 20g oxid de magneziu frecat cu 300mL apă. Soluţia antidot se agită puternic şi se
administrează în porţii mici.
 Pentru intoxicaţiile cu compuşi ai mercurului se administrează rapid trei ouă crude
amestecate cu cca 1l lapte apoi se provoacă vomă.

3
  Pentru intoxicatii cu compuşi ai plumbului se bea o cantitate mare de soluţie de sulfat
de magneziu.
 Pentru intoxicaţiile prin ingestie de solvenţi organici i se dă accidentatului să bea ulei
de parafină.
Componentele trusei de prim ajutor:
 soluţie apă oxigenată 3%
 soliţie acid boric 4%
 fiole cafeină
 fiole Algocalmin
 tinctură de iod
 soluţie carbonat acid de sodiu 2%
 soluţie diluată de permanganat de potasiu
 un tub Jecolan
 un flacon Emetiral
 un flacon Lizadon
 vată hidrofilă
 comprese sterile
 faşă tifon
 leucoplast
 foarfece
 pahar ocular

4
 GHID DE BIOSIGURANTA

1. Salopetele de laborator, halatele sau uniformele trebuie purtate tot timpul cât se lucrează în
laborator.
2. Mănuşi corespunzătoare de protecţie trebuie purtate în timpul tuturor procedurilor care pot
implica contactul direct sau accidental cu sânge, cu alte umori sau fluide ale organismului, cu
alte material potenţial infecţioase sau cu animale infectate. După utilizare, mănuşile se scot
aseptic şi se spală mâinile.
3. Studentii trebuie să se spele pe mâini după manipularea materialelor infecţioase şi înainte de
părăsirea zonei de lucru a laboratorului.
4. Ochelarii de protecţie, ecranele de protecţie facială sau alte dispozitive de protecţie trebuie
purtate ori de câte ori este necesară protecţia ochilor şi a feţei de stropi, obiecte impactante şi
surse artificiale de radiaţii ultraviolete.
5. Este interzisă purtarea îmbrăcăminţii protectoare de laborator în afara laboratorului, de
exemplu în cantine, camere de oficiu, biblioteci, toalete, etc.
6. Încălţămintea decupată în partea din faţă (sandale) este improprie purtării în laborator.
7. Consumul de alimente, băuturi, machiajul şi manipularea lentilelor de contact sunt interzise în
zonele de lucru ale laboratorului.
8. Depozitarea de alimente sau băuturi oriunde în zona de lucru a laboratorului este interzisă.
9. Echipamentul va fi ales luând în considerare câteva principii generale, de exemplu:
- Să fie conceput astfel încât să prevină sau să limiteze contactul dintre operator şi materialul
infecţios.
- Să fie confecţionat din materiale impermeabile la lichide, rezistente la coroziune şi
corespunzătoare ca structură.
- Să fie confecţionat astfel încât să nu aibă asperităţi, margini ascuţite şi părţi mobile neprotejate.
- Să fie proiectat, construit şi instalat pentru a facilita operarea simplă şi întreţinerea, curăţarea,
decontaminarea şi testarea în vederea certificării; ori de câte ori este posibil, se va evita utilizarea
sticlăriei şi a altor materiale casante.

Evitarea ingestiei de material infecţios şi a contactului cu pielea şi ochii

1. Particulele mari şi picăturile cu diametrul mai mare de 5 μm, apărute în timpul
manipulării materialului microbiologic, trebuie îndepărtate rapid de pe suprafaţa de lucru
şi de pe mâinile operatorului. Trebuie purtate mănuşi de unică folosinţă. Lucrătorii din
laborator trebuie să evite atingerea gurii, ochilor şi a feţei.
2. Este interzisă depozitarea şi consumul de alimente şi băutură în laborator.
3. Este interzisă introducerea în gură a oricăror obiecte (creioane, pixuri, gumă de
mestecat).
4. Este interzisă aplicarea cosmeticelor în laborator;
5. Faţa, ochii şi gura trebuie protejate cu un ecran sau prin alte modalităţi, în timpul oricărei
operaţii care se poate solda cu împroşcarea de material infecţios.

Utilizarea pipetelor şi a dispozitivelor de pipetare

1. Dispozitivul de pipetare trebuie utilizat întotdeauna. Pipetarea cu gura este interzisă.
2. Toate pipetele trebuie să aibă filtru de vată pentru a reduce contaminarea dispozitivului
de pipetare.

5
 3. Nu trebuie suflat niciodată într-un lichid care conţine agenţi infecţioşi.
4. Materialul infecţios nu trebuie niciodată amestecat prin aspirare şi expulzare alternantă,
prin pipetă
5. Lichidele nu trebuie niciodată expulzate forţat din pipete.
6. Pipetele gradate neterminal sunt preferabile altor tipuri de pipete deoarece nu necesită
expulzarea ultimei picături.
7. Pipetele contaminate vor fi imersate complet într-un dezinfectant adecvat, aflat într-un
container incasabil. Ele trebuie lăsate în dezinfectant atâta timp cât este necesar înainte de
a fi scoase din laborator.
8. Containerul pentru pipete folosite trebuie plasat în interiorul hotei de siguranta biologica,
nu în afara ei.
9. Seringile cu ace hipodermice nu trebuie utilizate pentru pipetare.
10. Trebuie utilizate dispozitive speciale pentru deschiderea flacoanelor prevăzute cu
capsule cu septuri de cauciuc care să permită apoi utilizarea pipetelor, evitându-se
utilizarea în acest scop a acelor hipodermice şi a seringilor.
11. Pentru a evita dispersia picăturilor de material infecţios din pipetă, pe suprafaţa de lucru
va fi aşezat un material absorbant ; după utilizare acesta va fi evacuat ca material
infecţios.

Procedurile
1. Pipetarea cu gura este strict interzisă.
2. Nici un material nu trebuie dus la gură. Etichetele nu trebuie umectate cu limba înainte de
lipire.
3. Toate procedurile tehnice trebuie efectuate într-un mod care să reducă la minimum formarea
de aerosoli şi picături.
4. Folosirea acelor şi seringilor hipodermice trebuie limitată. Ele nu trebuie folosite ca
substituente ale dispozitivelor de pipetare sau pentru oricare altă manoperă ce nu reprezintă
injecţii parenterale sau aspirarea de fluide de la animalele de laborator.
5. Toate stropirile accidentale şi expunerile evidente sau posibile cu material infecţios trebuie
raportate responsabilului laboratorului. Se va păstra o evidenţă scrisă a acestor accidente şi
incidente.
6. Se va elabora şi aplica o procedură scrisă pentru curăţarea-inactivarea substanţelor vărsate.
7. Lichidele contaminate trebuie decontaminate (chimic sau fizic) înaintea evacuării lor în
reţeaua de
canalizare. În funcţie de riscul evaluat se poate dezvolta un sistem de tratare a acestor lichide.
8. Documentele ce urmează a fi scoase din laborator trebuie să fie protejate pe toată perioada cât
se află în laborator, pentru a nu fi contaminate.

Zonele de lucru ale laboratorului

1. În laborator trebuie păstrată curăţenia şi ordinea, eliminându-se toate materialele care nu sunt
necesare pentru munca desfăşurată în laborator.
2. Suprafeţele de lucru trebuie decontaminate după fiecare vărsare de materiale potenţial
periculoase precum şi la sfârşitul zilei de lucru.
3. Toate materialele contaminate, probele şi culturile, trebuie decontaminate înainte de a fi
îndepărtate sau curăţate pentru refolosire.

6
Echipamente esenţiale pentru asigurarea biosiguranţei
1. Dispozitive de pipetare, pentru a evita pipetarea cu gura.
2. Hotele de biosiguranţă, ce trebuie folosite ori de câte ori:
- se manipulează materiale infecţioase; aceste materiale pot fi centrifugate în spaţiul deschis
al laboratorului dacă se folosesc cupe de centrifugă cu dispozitiv de securizare şi dacă sunt
introduse şi descărcate într-o hotă de biosiguranţă
- există risc crescut de infecţii aerogene
- se folosesc proceduri cu potenţial ridicat de producere de aerosoli: centrifugarea, mojararea,
secţionarea, agitarea sau mixarea viguroasă, dezintegrarea sonică, deschiderea containerelor
cu material infecţios cu presiune internă diferită de presiunea ambiantă, inocularea intranazală a
animalelor şi recoltarea de ţesuturi infectate de la animale şi ouă, etc. Alternativ, în scopul
reducerii producerii de aerosoli, în interiorul hotei de biosiguranţă se pot folosi incineratoare
electrice pentru anse de transfer.
4. Tuburi şi flacoane cu capace prevăzute cu filet.
5. Autoclave sau alte mijloace folosite pentru decontaminarea materialului infecţios.
6. Pipete Pasteur de unică folosinţă din plastic, ori de câte ori este posibil, evitând utilizarea celor
din sticlă.

Manipularea deşeurilor
Se consideră deşeuri toate materialele care se aruncă.
În laboratoare, în desfăşurarea activităţii cotidiene, decontaminarea deşeurilor şi eliminarea
finală a acestora sunt strâns legate. Un număr foarte mic de materiale contaminate necesită
îndepărtarea efectivă din laborator sau distrugerea. Majoritatea sticlăriei, instrumentelor şi
articolelor de îmbrăcăminte sunt refolosite sau reciclate. Principiul general ce trebuie să
funcţioneze este că toate materialele infecţioase vor fi decontaminate, autoclavate sau incinerate
în laborator.
Principalele probleme care se pun, înainte de eliminarea oricăriu obiect sau material din
laboratoarele ce lucrează cu microorganisme potenţial infecţioase sau ţesuturi de la animale,
sunt:
1. Au fost obiectele sau materialele respective eficient decontaminate sau dezinfectate printr-o
procedură autorizată?
2. Dacă nu, au fost ele ambalate într-un mod autorizat pentru incinerare imediată la faţa locului
sau pentru transfer într-o altă locaţie cu posibilităţi de incinerare?
3. Aruncarea obiectelor sau materialelor decontaminate implică eventual alte pericole adiţionale,
biologice sau de alt tip, pentru cei care îndeplinesc procedurile de eliminare sau care ar putea
veni în contact cu obiectele eliminate în afara perimetrului respectiv?

In procesul de inlaturare a deseurilor se va tine seama de identificare şi de separare a

materialelor infecţioase şi a containerelor respective. Vor fi obligatoriu respectate reglementările
naţionale şi internaţionale în domeniu. Categoriile care se includ sunt următoarele:
1. Deşeurile necontaminate (neinfecţioase) care pot fi refolosite, reciclate sau eliminate ca
deşeuri generale sau menajere
2. Obiectele ascuţite (tăietoare-înţepătoare) contaminate (ex. ace hipodermice, bisturie, cuţite şi
cioburi de sticlă); acestea vor fi întotdeauna colectate în containere rezistente la înţepare-tăiere,
prevăzute cu capace şi vor fi tratate ca infecţioase.

7
3. Materialul contaminat destinat decontaminării prin autoclavare urmată de spălare şi refolosire
sau reciclare.
4. Materialul contaminat destinat autoclavării şi eliminării.
5. Materialul contaminat destinat incinerării directe.

Procedurile de prim ajutor după expunerea accidentală la material infecţios

Primul ajutor în caz de expunere accidentală la material real / potenţial infecţios constă în
aplicarea imediat după eveniment, de către o persoană avizată, a tratamentului medical adecvat,
chiar la locul producerii accidentului.
Primul ajutor se acordă respectând metoda aprobată pentru o anumită expunere, urmând ca
îngrijirile să fie continuate de către un medic de specialitate pentru tratarea consecinţelor
accidentului.
1. Înţeparea, tăierea, zgârierea, abraziunea accidentală
• Consideră ca fiind un risc de expunere semnificativ orice leziune cu corpuri ascuţite, tăioase,
chiar dacă nu sunt urme de sânge vizibile la locul leziunii şi tegumentul nu pare a fi fost lezat
serios.
• Spală imediat abundent zona afectată cu un jet de apă, apoi cu apă şi săpun.
• Dezinfectează zona cu un antiseptic activ, eficient, proaspăt preparat; aplică un pansament steril
dacă este necesar.
• Raportează incidentul şefului de laborator şi medicului epidemiolog-infecţionist.
2. Contactul accidental cu material infecţios
Categoria include orice contact neprotejat al tegumentului prezentând soluţii de continuitate, a
mucoasei bucale, nazale sau a globului ocular cu material potenţial infecţios.
• Spală abundent imediat zona tegumentară cu jet de apă şi săpun. Foloseşte doar apă pentru
cavitatea bucală şi, respectiv, ser fiziologic steril pentru globul ocular.
• Raportează imediat incidentul şefului de laborator şi medicului epidemiolog / infecţionist.
3. Acţiuni imediate după expunerea accidentală
Indiferent de potenţialii agenţi microbieni patogeni, conţinuţi de materialul infecţios implicat în
expunerea accidentală potenţial infectantă, se impun câteva măsuri imediate:
• Se va preleva o probă de sînge de la accidentat pentru testări de bază (afirmarea / infirmarea
unei / unor infecţii preexistente accidentului cu etiologie: HBV +/- HDV, HCV, HIV, Treponema
pallidum, etc.).
• O contraprobă de ser se va păstra în congelator pentru investigaţii suplimentare.
• Se va preleva (dacă este posibil) o probă de sânge de la subiectul de la care provine materialul
biologic potenţial infectios (teste paralele cu accidentatul).
Raţiunea pentru care se fac aceste prelevări este de :
- a stabili caracterul profesional / neprofesional al unei / unor îmbolnăviri ulterioare;
- a se adopta o atitudine terapeutică imediată, raţională şi eficientă faţă de accidentat;
- a stabili durata de urmărire/ supraveghere clinică şi de laborator a accidentatului (în general, pe
durata maximă de incubaţie a agentului/ agenţilor infecţioşi potenţial / real existenţi în materialul
infecţios implicat în accident.
• În cursul investigării unei izbucniri epidemice, trebuie stabilite proceduri adecvate, specifice,
de prevenţie şi tratament şi de urmărire pe durata maximă de incubare (pentru agentul etiologic
incriminat) a personalului implicat în acţiune.

8
• În cursul unei izbucniri epidemice suspectate de a fi o febră hemoragică, personalul implicat în
investigarea focarului va fi monitorizat de două ori pe zi, timp de trei săptămâni, pentru starea
generală şi temperatură.
• Dacă un detaliu procedural este identificat drept cauza generatoare a accidentului, este necesar
a se întreprinde o acţiune corectivă.

9
 ETAPELE PROCESULUI DE PRELUCRARE ŞI
ANALIZĂ A MATERIALELOR BIOLOGICE ÎN
LABORATORUL DE BIOCHIMIE

1. Recoltarea

A. Probele de origine animală - se recoltează imediat după sacrificarea animalului. Dacă nu

sunt prelucrate imediat, conservarea se face la - 20C, timp limitat, funcţie de parametrii
de analizat.
Obs.: probele de sânge se vor preleva la cel puţin două ore după consumul hranei. Uneori
este necesară pregătirea animalului pentru sacrificare (se specifică în protocolul de lucru).

B. Probele de origine vegetală – se recoltează în sezonul optim, după 11:00 a.m., la distanţă
de zilele ploioase.

2. Prelucrarea primară

Materialele biologice cele mai variate (sânge, urină, LCR, ţesuturi, păr) care intră pentru
determinări în laboratoare de multe ori sunt prelucrate ca atare, dar sunt şi cazuri când ele
necesită unele pregătiri preliminare. Pe un anumit material biologic, care urmează să fie supus
analizelor biochimice, nu se pot efectua simultan toate determinările necesare, acesta trebuind
împărţit in prealabil în mai multe părţi şi pregătit în mod corespunzător pentru fiecare tip de
determinare.
Rezultatele analizelor, în special la ţesuturi, sunt raportate de obicei la 1 g substanţă
proaspătă sau la 1 g substanţă uscată, eventual la 1 g cenuşă.

Uscarea
Pentru raportarea rezultatelor analizelor chimice la substanţa uscată, în practica curentă se
determină apa totală. Metoda cea mai des întâlnită este uscarea produselor biologice la etuvă
încălzită la 105C.
Într-o fiolă de cântărire (care în prealabil a fost uscată la 105C şi la care s-a luat tara) se
cântăresc la balanţa analitică 2-3 g din materialul de cercetat, după care se introduc în etuvă la
1052C. Uscarea durează de obicei câteva ore, până când se ajunge la o pondere constantă,
adică se cântăreşte fiola, se notează greutatea, după care din nou se încălzeşte 30 min. şi se repetă
cântărirea. Dacă rezultatele obţinute la două cântăriri consecutive nu diferă mai mult de 0,1% din
masa probei uscate, procesul se consideră terminat.
Analiza elementelor anorganice din ţesuturi biologice necesită ca operaţie preliminară
distrugerea materiei organice. Aceasta este posibilă fie prin incinerare fie prin mineralizare.
Pentru ambele grupuri de operaţii se pleacă de la produsul uscat.

10
 Incinerarea (Calcinarea)
Se cântăresc la balanţa analitică 1-2 g din produsul deshidratat într-un creuzet de
porţelan. Creuzetul este încălzit până la carbonizarea probei, într-un cuptor electric de calcinare,
ridicându-se treptat temperatura acestuia până la 550C. Temperatura creuzetului se păstrează la
această valoare până când se obţine o cenuşă albă, fără pete negre. Creuzetul se răceşte în
exicator şi apoi se recântăreşte.

cantitatea de cenusa dupa calcinare

cenusa % = X 100
cantitatea de produs luat în lucru

Nu este indicată depăşirea temperaturii de 550C, întrucât la temperaturi mai ridicate

oxizii unor metale pot suferi evaporări considerabile. În tot cursul incinerării se evită prezenţa
unei atmosfere reducătoare, care ar putea provoca de asemenea pierderi din substanţă.
Incinerarea ţesuturilor animale prezintă dezavantajul că adesea se pierde din substanţă
datorită revărsării şi aglomerării materialului în cursul calcinării.

Mineralizarea pe cale umedă (Dezagregarea)

Tratarea substanţelor solide, insolubile în apă, cu acizi minerali se numeşte mineralizare,
dar pentru că reactivii sunt în stare lichidă se spune că se face o mineralizare pe cale umedă.
Viteza de dezagregare a substanţelor depinde de mai mulţi factori şi anume: de natura probei, de
gradul de diviziune a probei, de reactivii utilizaţi, de temperatura la care are loc procesul.
În practica curentă a mineralizărilor se folosesc acizi anorganici ca atare sau în amestec.
Cei mai utilizaţi sunt:
acidul clorhidric – care formează cloruri uşor solubile în apă; nu dă reacţii secundare, iar
excesul de acid se îndepărtează uşor prin evaporare. Este mai puţin întrebuinţat în cadrul
laboratoarelor ca agent de mineralizare;
acidul azotic – care formează nitraţi solubili în apă, are o acţiune puternic oxidativă. Excesul se
poate îndepărta de asemenea prin evaporare;
acidul percloric concentrat – prin mineralizare elementele metalice trec sub formă de percloraţi
uşor solubili în apă, unii percloraţi fiind puternic higroscopici. Acidul concentrat încălzit până la
fierbere (208C) are proprietăţi oxidante (spre deosebire de cel diluat). Puterea oxidativă se poate
explica prin descompunerea moleculei în oxigen, clor şi apă. Substanţele organice pot fi astfel
oxidate cu o viteză foarte mare şi violent, producând şi explozii. Pentru evitarea acestor
accidente, în general, materialul se tratează în prealabil cu acid azotic şî numai după aceea se
adaugă acidul percloric;
acidul sulfuric concentrat – deşi este un acid puternic oxidant, este relativ puţin întrebuinţat ca
atare la mineralizare.

În laboratoarele clinice de cele mai multe ori se folosesc pentru mineralizare amestecuri
de acizi.
Una din metode prevede, de exemplu, pentru mineralizarea sângelui, urinii, părului,
organelor, în vederea dozării unor oligoelemente (mangan, nichel, crom, arsen) următorul
procedeu.

11
 Într-un balon Erlenmeyer de 100 mL, prevăzut cu sticlă de ceas pentru acoperire se
pipetează 15-20 mL sânge (sau se introduc 1-2 g organe) şi 10 mL acid azotic concentrat şi se
încălzeşte pe baie de nisip. Când rămân 2-3 mL, se răceşte şi se adaugă acid azotic diluat (2:1).
Se continuă încălzirea până când lichidul devine limpede, galben pai şi nu mai emite vapori
bruni. Dacă înainte de a se ajunge la acest stadiu lichidul s-a evaporat, se vor adăuga după răcire
încă câţiva mL de acid azotic diluat şi se va continua încălzirea având grijă să nu se carbonizeze
proba. Vasul cu lichid se răceşte şi se adaugă 1 mL acid percloric concentrat şi 2-3 mL apă
distilată. Se continuă încălzirea vasului acoperit până la decolorarea completă, apoi se
îndepărtează sticla de ceas şi se evaporă la sec. Pentru îndepărtarea urmelor de acid percloric se
mai adaugă de câteva ori câte 5 mL apă distilată şi se evaporă. Reziduul trebuie să fie cristalin şi
perfect alb.
Mineralizarea urinii este identică, dar se porneşte de la 200 mL urină şi 20 mL acid
azotic.
O altă tehnică destul de rapidă, recomandă pentru fiecare gram de ţesut un amestec
format din 10 mL acid azotic concentrat, 2 mL acid percloric concentrat şi 0,25 mL acid
sulfuric concentrat. Materialul pentru mineralizare, deshidratat şi cântărit exact, se introduce fie
în balonul Kjeldahl, fie în paharul Berzelius de 250 mL, se pune peste probă amestecul de acizi,
se acoperă vasul şi se încălzeşte treptat până la fierbere la baia de nisip, unde se menţine până la
eliminarea vaporilor nitroşi (de culoare roşcată-maronie). După clarificarea probelor, vasul se
lasă descoperit până la obţinerea unui reziduu uscat. Reziduul trebuie să aibă culoarea albă, în
caz contrar se lasă să se răcească proba, se mai adaugă 5 mL din amestecul de acizi şi se repetă
operaţia.
Reziduul uscat se reia cu apă distilată fierbinte şi uşor acidulată cu acid clorhidric, pentru
a asigura dizolvarea metalelor. Lichidul se transvazează cantitativ într-un balon cotat şi se aduce
la semn cu apă distilată.
Este de dorit în cazul mineralizărilor să se facă cu fiecare serie o probă martor, toate
operaţiunile executându-se la nişă.

Deproteinizarea
Un număr de determinări necesită obţinerea filtratelor fără proteine, adică este necesară o
deproteinizare prealabilă.
Este cunoscut faptul că proteinele sunt ioni polivalenţi, care se comportă la un pH mai
mic decât punctul izoelectric ca nişte cationi şi ca anioni la un pH mai ridicat decât punctul
izoelectric. Proteinele formează un precipitat uşor separabil din mediul de reacţie , la un pH mai
mic decât punctul izoelectric, cu acid tricloracetic, acid percloric, molibdat, wolframat şi la un
pH superior punctului izoelectric cu diferiţi cationi ai metalelor grele: bariu, mercur, zinc.
Felul deproteinizatului se alege în funcţie de analiza cerută. Metodele de deproteinizare
folosite cel mai frecvent în practica de laborator sunt:
1. Filtratul neutru (Folin Wu), agentul precipitant fiind acidul wolframic. La o parte de
sânge (plasmă, ser) - probă biologică, se adaugă aceeaşi cantitate de wolframat de
sodiu 10% şi 8 părţi acid sulfuric n/12 (83,4 mL acid sulfuric 1 N ad 1000 mL apă
distilată) picătură cu picătură sub agitare continuă. Se lasă în repaus 10 minute, apoi
se filtrează sau se centrifughează. Filtatul se poate păstra 1-2 zile în frigider.
2. Filtratul acid (agentul de precipitare este acidul tricloracetic 20%). Proba biologic ă
se diluează cu 4 părţi apă distilată şi sub continuă agitare se adaugă 5 părţi ractiv.
După 5-10 minute se centrifughează şi se filtrează. Din filtrat se poate doza azotul

12
 rezidual, insulina, sulfonamidele, acidul para-amino-hipuric şi ionii ca: sodiul,
potasiul, fierul, cuprul, fosfaţii.
3. Filtratul alcalin (Somogyi), agentul de precipitare fiind ionul de zinc. De obicei se
foloseşte sulfatul de zinc heptahidrat sub formă de soluţie 10% şi hidroxidul de sodiu
0,5 N. Este important ca 10 mL sulfat de zinc să corespundă 10,8-11,2 mL hidroxid
de sodiu (se stabileşte prin titrare în prezenţa fenolftaleinei). Pentru obţinerea
filtratului alcalin se porneşte de la 1 parte probă biologică, 7 părţi apă distilat, 1 parte
sulfat de zinc şi o parte hidroxid de sodiu. Se agită puternic amestecul, se filtrează sau
se centrifughează. Filtratul astfel obţinut nu se poate folosi pentru determinarea
azotului rezidual, întrucât în precipitat rămân acidul uric, glutationul.
4. Precipitarea cu alcool-eter. La o parte probă biologică se pun 9 părţi amestec alcool-
eter (1:1) picătură cu picătură, agitând continuu. Proba se pune în baie de apă
fierbinte 2 minute, având grijă ca pierderile să fie minime, iar după răcire se
completează volumul pierdut cu un amestec alcool etilic-eter, şi se filtrează. În filtrat
se găsesc toate tipurile de lipide.

Dezintegrarea tisulara
Se realizează prin diverse procedee, în funcţie de tipul de ţesut:
Pentru ţesuturi moi (viscere, mucoase) se foloseşte omogenizatorul Potter. Acesta este un
vas cilindric prevăzut cu un pistil de sticlă rodată sau teflonată. Spaţiul dintre pistil şi peretele
vasului are aproximativ 0,1 mm. Prin acţionarea mecanică sau manuală a pistilului în vas, ţesutul
este dezintegrat până la nivel de componente celulare sau subcelulare. Se mai poate utiliza în
aceleaşi scopuri şi un mojar de porţelan în care materialul biologic, cântărit în prealabil, se
triturează prin amestecare cu o substanţă dură şi inertă (alumină, bile de sticlă, nisip de cuarţ,
pudră de sticlă). În final acestea se separă de probă prin decantare sau centrifugare.

Omogenizator Potter

13
 Pentru ţesuturi cu consistenţă medie (muşchi) se pot utiliza omogenizatoare cu cuţite,
concepute special pentru acest scop. Acestea sunt prevăzute cu un vas din sticlă, pe fundul căruia
se află un cuţit inoxidabil cu 4 braţe acţionat mecanic de un ax central. Designul special al

Omogenizatoare cu
cuţite

acestui ax permite măcinarea şi omogenizarea probelor umede, datorită bunei etanşeităţi.

Ţesuturile dure (cartilagii, oase, cochilii) se dezintegrează utilizând mori cu bile sau
mojare de agată, de preferinţă acţionate mecanic.
Pentru ţesuturile vegetale, bacterii sau alte organisme unicelulare (alge, protozoare,
fungi) dezintegrarea celulară poate fi făcută prin:
- îngheţ - dezgheţ repetate, când se produce ruperea membranelor prin şoc osmotic.
- ultrasonare, când se modifică presiunea intracelulară şi pot fi rupţi astfel: pereţii celulari (în
cazul ţesuturilor vegetale sau al bacteriilor), membrane plasmatice şi membranele
subcelulare. Modelele noi de băi de ultrasunete dispun de generatoare duble ce măresc
eficienţa procedeului. Se procesează astfel: bacterii, fungi, alge unicelulare, protozoare,
celule splenale, renale, ganglionare, eritrocite.
O altă metodă de dezintegrare tisulară utilizează digestia enzimatică. Prin această
metodă ruperea pereţilor celulari în cazul celulelor vegetale sau bacteriene se realizează cu
poliglicozidaze specifice (celulaza-pentru pereţii celulozici, muramidaza-pentru peretele
celulelor bacteriene). Acest procedeu, deşi eficace prin păstrarea nealterată a celorlalte
componente celulare, prezintă dezavantajul contaminării probei biologice cu proteine străine,
care pot interfera în determinările ulterioare. Tratarea cu detergenţi specifici ce distrug structurile
stratului dublu lipidic membranar este o metodă potrivită mai ales pentru separarea proteinelor
fixate în membrana plasmatică.
În funcţie de specificul probei, se poate alege metoda de dezintegrare cea mai comodă.

În continuare, în funcţie de grupul structural de compuşi de interes (proteine, acizi

nucleici, lipide, glucide), proba se procesează conform protocolului de lucru specific fiecăruia.

14
 Proba biologica

Omogenizare,
dezintegrare tisulara

Mineralizare Calcinare Extractie la rece Extractie în

Uscare
umeda în mediu apos soventi organici

Proba Reziduu mineral Cenusa Extract apos Extract lipidic

biologica
uscata
Dozare Dozare Dozare Dozare elemente Analiza Analiza
Defecare lipide
substanta azot fosfor (carbon, hidrogen, proteine,
uscata (Kjeldahl) sulf, ioni metalici) enzime

Analiza acizi Analiza

nucleici glucide

Principalele directii de procesare si analiza

a probelor biologice în laboratorul de
biochimie

15
 Principii generale de prelevare, prelucrare şi stocare a probelor de sânge utilizate în
laboratorul de biochimie

Manipulările pre-analitice ale eşantioanelor trebuie să urmărescă preîntâmpinarea oircărui

proces capabil să denatureze calitatea acestora.
Preluarea probelor de sânge integral se face cu eprubete curate şi uscate, spălate în
prealabil cu detergent şi clătite temeinic cu apă iar în final cu apă deionizată sau distilată.
În mod obişnuit se utilizează 5 anticoagulanţi:
a) Oxalaţii- sunt rar folosiţi. Se prepară după formula:
0,8g oxalat de potasiu
1,2g oxalat de amoniu
se dizolvă în 100 mL apă distilată.
Se folosesc 0,1 mL soluţie la 1 mL sânge prelevat. Dezavantajele acestui anticoagulant
sunt:
- provoacă autoliza leucocitelor
- nu se pretează la dozarea azotului neproteic şi a azotului ureic.
b) Citratul de sodiu- se foloseşte în soluţie 3,8 % în proporţie de o parte soluţie la 9 părţi
sânge. Acest anticoagulant nu se pretează pentru examenul biochimic al sângelui (activităţi
enzimatice).
c) EDTA sare disodică sau dipotasică- se utilizează 1-2mg EDTA/ mL sânge. Sângele
prelevat pe EDTA poate fi folosit pentru dozarea uremiei, glicemiei, proteinemiei. Toţi
anticoagulanţii enumeraţi până acum acţionează prin complexarea ionului de calciu.
Anticoagulantul nu se pretează pentru determinarea ionilor Ca şi Mg.
d) Heparina- este anticoagulantul preferat pentru analizele biochimice ale sângelui. Se
folosesc 0,1 mL soluţie heparină 1% la 5 mL sânge.
e) Fluorura de sodiu- este folosită pentru conservarea mai lungă a probelor în cazul
dozării glucidelor saguine. Fluorura de sodiu are rolul de a inhiba utilizarea glucozei de către
eritrocite.
În scopul prevenirii hemolizei este necesară o cât mai grabnică separare a plasmei prin
centrifugare la turaţie mică. Probele de sânge total nu se congelează!
Prelevarea probelor de ser sanguin -se face în tuburi curate şi uscate, conform cu cele
utilizate pentru prevelarea sângelui total, fără alte adaosuri.
Pentru exprimarea serului, probele se menţin la temperatura laboratorului (25°C). După
ce coagularea a avut loc se efectuază desprinderea (decolarea) cheagului de pe pereţii eprubetei,
preferabil cu o baghetă de sticlă.
Serul separat de coagul se centrifughează pentru îndepărtarea cât mai completă a
eritrocitelor. Contine 2 tipuri de proteine: albumina si globuline.
Astfel prelevat, el se pretează la depozitare prin refrigerare sau congelare.
Plasma este obtinuta din sangele recoltat intr-un tub cu anticoagulant si apoi centrifugat.
Anticoagulantul inhiba formarea coagulului. Plasma contine trei tipuri de proteine: albumina,
globuline si fibrinogen.
Pentru anumiti analiti exista diferente semnificative intre rezultatele obtinute la testarea din ser si
cea din plasma: potasiu, magneziu, fosfor, proteine totale, lactat etc.
Diferentele dintre valorile obtinute din ser si din plasma se datoreaza unor factori ca:
- analitul poate fi consumat in timpul procesului de coagulare: fibrinogen, trombocite, glucoza;

16
- analitul poate fi eliberat din celule in timpul coagularii: potasiu, LDH, fosfor, lactat;
- anticoagulantul poate interfera cu metoda de determinare in cazul GGT, Li.

Tabelul 1. Conservabilitatea probelor după prelevare

Examenul Proba +4°C -20°C

biochimic analizată
Acid uric ser sanguin 5 zile 6 luni
Aldolază ser sanguin 5 zile 15 zile
Amilază ser sanguin, 7 zile 7 zile
urină 10 zile 7 zile
Bilirubină ser sanguin, 4 zile la întuneric
plasmă
Colesterol ser sanguin, 6 zile 7 luni
plasmă
Corpi cetonici sânge total, 2 ore
urină 2 ore
Electroforeză ser sanguin 2 zile
Fosfolipide ser sanguin - 30 zile
Glucoză sânge total -2-3 zile după 10 zile
deproteinizare cu TCA - 4
ore nedeproteinizat
Gamma glutamil ser sanguin 7 zile -
transpeptidază plasmă
GOT ser sanguin 3 zile 7 zile
plasmă (scade 8 %)
GPT ser sanguin 3 zile 7 zile
(scade 10 %)
Acid lactic plasmă 6 zile (fluorură/EDTA) 14 zile
Lactat ser sanguin 3 zile nu se pretează
dehidrogenază (scade 8 %) la congelare
Lipide totale ser sanguin 7 zile -
Proteină totală ser sanguin 6 zile 10 zile
urină 6 zile
Trigliceride ser sanguin 3 zile >10 zile
Uree ser sanguin 3 zile -
plasmă

17
 Principii generale de prelevare, prelucrare şi stocare a probelor de urină utilizate în
laboratorul de biochimie

Probele de urină se recoltează, de asemenea, în vase perfect curate şi uscate. Se

recomandă examenul urinei imediat după recoltare deoarece la temperatura ambientului ea
devine sediul unei masive colonizări bacteriene care se soldează cu modificări ale pH-ului şi
deci, ale sedimentului. Unele componente ale sale sunt fie volatile (corpi cetonici), fie suferă
descompunere rapidă (glucide, sediment organic).
În cazuri fortuite urina se poate stoca în recipienţi închişi la 4°C sub protecţie de
antibiotic (Penicilină- Streptomicină) sau de formol (1 mL formol la 10 mL urină). Sedimentul
urinar se va examina în decurs de 2 ore de la prelevare. Analiza chimică se va efectua în decurs
de 4 ore de la prelevare (fără conservant).

18
 ACIZI NUCLEICI
METODA DIRECTĂ DE IZOLARE A ADN DIN CELULE ANIMALE
(KAY)
ADN–ul (acid dezoxirobonucleic) este un acid nucleic care conţine informaţia genetica
necesara dezvoltării si funcţionarii tuturor organismelor vii.

19
Principiul metodei
ADN se izolează din diferite ţesuturi direct, fără alte procedee preliminare de
omogenizare sau fracţionări celulare, cu ajutorul unui detergent anionic (dodecil sulfatul de
sodiu).
Metoda se utilizează pentru extracţia rapidă a acizilor nucleici, cât si pentru cercetările
privind biosinteza ADN în celulele tumorale.

Materiale
- Soluţie NaCl 0,14 M (ser fiziologic)
- Soluţie dodecil sulfat de sodiu 5 % in etanol 45%
- Soluţie etanol 95%
- Soluţie etanol 70 %
- Ficat proaspăt

Mod de lucru
1 g ţesut tăiat mărunt cu o forfecuţă se dispersează rapid într-un mojar cu nisip de cuarţ,
adăugând ulterior 9 mL soluţie NaCI 0,14 M. Se decantează supernatantul.
Imediat se adaugă 2 mL soluţie dodecil sulfat de sodiu.
În momentul în care suspensia devine vâscoasă se adaugă NaCI solidă, sub agitare
continuă până când soluţia devine 1M (0,57 g). Agitarea se prelungeşte o jumătate de ora cu
scopul de a dizolva complet sarea. Soluţia vâscoasă rezultată în urma tratamentului cu dodecil
sulfat de sodiu se datoreşte în principal trecerii ADN în soluţie. Se centrifughează soluţia 20
minute la 3000 rpm pentru a îndepărta proteinele denaturate de detergent.
Supernatantul rezultat se decantează şi se precipită cu un volum egal de alcool etilic 95%.
ADN-ul precipită sub forma unui fuior. Se scoate cu o baghetă cât mai repede din vasul
de precipitare (storcându-se de alcool prin presare pe pereţii eprubetei). Se introduce într-o
soluţie de alcool 70%, apoi într-una de 95 %, iar în final se spală cu acetonă şi se usucă.

20
 AMINOACIZI
SEPARAREA AMINOACIZILOR DINTR-UN AMESTEC PRIN
CROMATOGRAFIE DE PARTIŢIE ŞI DETECTARE POLICROMATICĂ
CU NINHIDRINĂ - Cu(NO3)2
Aminoacizii sunt molecule ce contin in structura lor o grupare o grupare amino si o
grupare carboxil.
Structura generala a unui aminoacid:

Aminoacizii proteinogeni sunt α-aminoacizii, sunt in numar de 22, dintre care numai 20
de aminoacizi sunt direct specificati de codul genetic, ceilalti doi selenocisteina si pirrolizina
sunt incorporati in proteine prin mecanisme unice de sinteza direct pe lantul polipeptidic.
Reprezinta unitatile constituente ale proteinelor din toate organismele vii, formand
macromolecule proteice prin realizearea de legaturi peptidice intre gruparea aminica a unei
molecule si gruparea carboxil a moleculei invecinate.

Principiul metodei
Pentru analiza aminoacizilor se practică cromatografia de partiţie, folosind ca suport
hârtia sau silicagelul întins într-un strat subţire pe o placă rigidă.
Procedeul permite o separare netă a unor cantităţi foarte mici de substanţe. Faza
staţionară este apa din jurul granulelor de silicagel sau a microfibrilelor de celuloză iar faza
mobilă este reprezentată de un amestec solvent organic - apă.
Prin migrarea pe suportul solid, faza mobilă antrenează aminoacizii din amestecul de
cercetat şi îi deplasează corespunzător afinităţii lor specifice faţă de faza staţionară.
Când solventul a ajuns aproape de capătul superior al plăcii (sau hârtiei de filtru) se
întrerupe migrarea, se scoate suportul din tancul de cromatografie, se usucă şi se developează cu
o soluţie revelatoare.
Plasarea fiecărui aminoacid este marcată printr-o pată de culoare. Această plasare
corespunde unei mărimi caracteristice, notată Rf.

Distanta de la linia de start la spotul de aminoacid

Rf =
Distanta de la linia de start la frontul solventului

21
 Există o relaţie între natura radicalilor aminoacizilor şi viteza lor de migrare: aminoacizii
cu radicali hidrofobi mari (Val, Leu, Ileu, Phe, Tyr, Trp, Met) migrează mai departe decât cei cu
radicali hidrofobi mai scurţi (Gly, Ala, Pro) sau decât cei cu radicali hidrofili (Cys, Ser, Tre, Asp,
Glu, Lys, Arg, His).
Migrarea diferenţială a aminoacizilor este determinată de afinitatea diferenţiată pentru una
din cele două faze:
- afinitate mai mare pentru apă a aminoacizilor cu radicali hidrofili
- afinitate mai mare pentru faza neapoasă a aminoacizilor cu radicali hidrofobi

Reactivi şi materiale
- sistem de eluţie: fenol:apă:amoniac (160:40:1)
- hârtie Whatman nr1
- soluţii de aminoacizi 1mg/mL
- tanc de migrare
- reactiv pentru detectare policromatică

0,1 g ninhidrină ex temporae

Sol A 50 mL etanol absolut 50 pA + 3 pB
10 mL acid acetic glacial se amestecă în pulverizator
2mL colidină

Sol B 0,5 g Cu(NO3)2 • 3H2O

50 mL etanol absolut

Mod de lucru
Tancul cromatografic este umplut cu amestecul de migrare în strat de 1-1,5 cm. Pereţii
verticali se căptuşesc cu o hârtie de filtru îmbibată în amestec de migrare. Se păstrează astfel
24 ore la temperatura camerei.
Se introduce hârtia cu probele depuse pe linia de start şi se migrează 65 - 70 min. Se
scoate hârtia din tanc.
Se usucă hârtia la 90°C timp de 5-10 min.
Se pulverizează soluţia pe hârtie şi se încălzeşte la 110°C timp de 4 min.
Se observă culorile în primele 10 min.

Aminoacid Culoarea spotului Rf

Cistină Cenuşiu

Lizină brun roşu, formează în timp inel galben

Histidină brun cu inel brun închis, în interior inel

galben
Asparagină Auriu
Arginină purpuriu închis

22
Glicină brun oranj cu inel oranj strălucitor

Treonină brun verzui, în timp trece în purpuriu

Alanină purpuriu închis

Cisteină Verde

Tirozină brun luminos

Metionină purpuriu cenuşiu cu inel galben

Triptofan brun cu inel albastru care dispare rapid

Fenil alanină galben verzui

Prolină verde strălucitor cu inel galben

23
 PROTEINE
METODE DE SEPARARE ŞI FRACŢIONARE A EXTRACTELOR
PROTEICE

Proteinele sunt macromolecule organice constituite din lanturi de aminoacizi uniti intre ei
prin legaturi peptidice.

Proteinele se caracterizează printr-o organizare spaţiala specifica, fiecare lanţ polipeptidic

avand o structura tridimensionala specifica in funcţie de secvenţa de aminoacizi constitutiva.
Separarea şi purificarea unei proteine dintr-un amestec biologic constituie una dintre cele
mai importante părţi din cercetarea biochimiei proteinelor. Metodele chimiei organice şi tehnicile
fizicii pentru separarea moleculelor sunt inadecvate, biochimia având un arsenal metodologic
propriu pentru fracţionarea unui amestec de compuşi cu proprietăţi similare.
Pentru conservarea activităţii biologice trebuiesc evitate valorile extreme de pH şi
temperatură, solvenţi organici, agenţi redox energici.
Tehnicile experimentale adecvate acestui scop utilizează condiţii blânde în separarea
biomoleculelor, bazate pe diferenţele în proprietăţile fizice ale acestora, de exemplu: mărimea,
forma, masa, sarcina netă globală, solubilitatea, absorbţia pe diferite suporturi cromatografice.

24
 PRECIPITAREA LA PH IZOELECTRIC. IZOLAREA CASEINEI DIN LAPTE
Caseina reprezintă principala proteină din lapte (aproximativ 35 g/l).
Ea este constituită din lanţuri polipeptidice cu resturi seril esterificate cu ortofosfat (este o
fosfoproteină).
Caseina din lapte formează complexe micelare care se găsesc dispersate in faza apoasa a
laptelui. Miceliile de caseina sunt alcătuite din subunitati formate din diferite tipuri de caseina
unite prin punţi de fosfat de calciu, mărginite la exterior de un strat de molecule solubile de k-
caseina, cu rol de stabilizare a miceliului in soluţie.

submiceliu

fosfat de calciu
k - caseina

Principiul metodei
Caseina are pH-ul izoelectric la 4,8 unităţi de pH.
În prezenta lucrare principiul de lucru constă în precipitarea acestei proteine la pH-ul ei
izoelectric.
Deoarece caseina este insolubilă în etanol, proteina obţinută se spală cu etanol, lipidele
putând fi astfel uşor îndepărtate.

Materiale
- Soluţie tampon acid acetic/acetat de sodiu 0,2 M pH = 4,6.
A – soluţie acid acetic 0,2 M (11,55 mL acid acetic se aduc la 1000 mL cu apă distilată)
B – soluţie acetat de sodiu 0,2 M (16,4 g sare anhidra sau 27,2 g sare cristalizată cu 3H2O se
dizolvă în 1000 mL de apă distilată)
- 25 mL soluţie A se amestecă cu 24,5 mL soluţie B şi se aduce la 100 mL cu apă distilată
- Eter etilic
- Etanol absolut
- Lapte

25
Mod de lucru
Într-un pahar de 200 mL se toarnă 50 mL lapte şi se încălzeşte la 40C.
Se adaugă sub agitare 50 mL soluţie tampon şi se aduce totul la 40C.
Se verifică pH-ul şi se ajustează, la nevoie, la 4,8 cu ajutorul soluţiilor A sau B
(componentele soluţiei tampon).
Se răceşte suspensia la temperatura laboratorului şi se lasă să stea 5 minute, după care se
filtrează prin mai multe straturi de tifon.
Precipitatul se spală cu mici volume de apă de 2-3 ori.
Se reia apoi în 15 mL etanol.
Suspensia se filtrează pe pâlnie Büchner, iar precipitatul se spală cu un amestec de
volume egale etanol – eter etilic.
În final precipitatul se spală cu 25 mL eter sub vid.
Urmele de solvent din preparat sunt îndepărtate prin presarea caseinei între două bucăţi
de hârtie de filtru.
După uscarea preparatului, caseina este cântărită şi se calculează randamentul separării,
ţinând seama că 100 mL lapte conţin, teoretic, minimum 3,4 g caseină.

26
 METODE DE DETERMINARE CANTITATIVĂ A PROTEINELOR

DETERMINAREA PROTEINELOR PRIN METODA BIURET

Metoda Biuret cuantifica concentraţii de proteine solubile cu domeniu de detecţie in intervalul
104 – 10 5 μg/mL.

Principiul metodei
Compuşii polipeptidici (de la 4 unităţi în sus) formează complecşi de culoare violet cu ionul
Cu2+ in mediu bazic.
Intensitatea culorii este direct proporţională cu concentraţia proteinelor şi se determină
spectrofotometric.

HN: :NH

O=C C=O
2+
Cu
R1-HC CH- R3

HN: :NH

O=C C=O

R2-HC CH- R4

Formarea complexului cupric cu electronii neparticipanţi

ai atomilor de azot implicaţi în legătura peptidică.

Reactivi
- reactiv Biuret: 45 g tartrat de sodiu şi potasiu
15 g CuSO45H2O
8 g NaOH
5 g KI
ad 1000 mL apă distilată

- albumină serică bovină soluţie 1g %

27
Mod de lucru

CONSTRUIREA CURBEI DE CALIBRARE

sol albumină apă distilată Reactiv Biuret g/dL ΔA

nr. tub
(mL) (mL) (mL) albumină
1 0,1 0,9 4 1

2 0,2 0,8 4 2

3 0,3 0,7 4 3

4 0,4 0,6 4 4

5 0,5 0,5 4 5

6 0,6 0,4 4 6

7 0 1 4 0

Se agită tuburile, se lasă la temperatura camerei 25 min. Se citesc la spectrofotometru, la

lungimea de undă de 540 nm.
Se realizează curba etalon notând pe abscisă concentraţia proteică (g/dL) iar pe ordonată A540.

Determinarea probei necunoscute

0,1 mL probă se pun într-o eprubetă curată. Se adaugă 0,9 mL apă distilată şi se agită bine. Se
adaugă apoi 4 mL reactiv Biuret, se agită şi se lasă la temperatura laboratorului 25 de minute. Se
citeşte absorbanţa la 540 nm faţă de martor (tubul nr.7 din curba de etalonare).
Se determină concentraţia proteica din probă prin interpolarea valorii A determinate pe
curba de etalonare.

28
 DETERMINAREA CANTITATATIVĂ A PROTEINELOR PRIN METODA
LOWRY

Determinarea proteinelor din produse cu conţinut proteic mic (25-500 g/mL ) se poate
face prin metode colorimetrice diferite de metoda Biuret (a cărui domeniu de detecţie este
cuprins între 1x104-1x105 g/mL ). Una din cele mai utilizate este metoda Lowry.

Principiul metodei
Determinarea proteinelor prin metoda Lowry se bazează pe formarea unui complex
cupric colorat violet (reacţia biuretului). Reacţia de culoare este amplificată de reducerea
fosfomolibdaţilor şi fosfo wolframaţilor din reactivul Folin-Ciocâlteu de către compuşii fenolici
(radicali tirozil şi fenil) din lanţurile polipeptidice.

Materiale
- Reactiv Folin-Ciocâlteu: într-un balon cu reflux se introduc pe rând:
100 g Na2WO4 • 2H2O
25 g Na2MoO4 • 2H2O
700 mL apă distilată
- Se dizolvă sărurile în apă, după care se adaugă:
50 mL H3PO4 85%
100 mL HCl concentrat
- Se refluxează la flacără 10 ore. Se adaugă 150 g Li2SO4 dizolvat parţial în 50 mL apă şi
câteva picături de brom.
- Amestecul se fierbe 15 min. fără refrigerent, se răceşte la temperatura camerei, se diluează la
1l şi se filtrează. Reactivul de culoare galben-auriu se păstrează în sticle brune, foarte curate,
închise ermetic, la 4°C (când este redus reactivul devine verzui).
- Înainte de întrebuinţare se diluează 1:10 cu apă distilată.
- Reactiv alcalin de cupru: A - Na2CO3 anh. soluţie 10% în NaOH 0,5 N
- B – Soluţie 0,5% CuSO4 • 5H2O în citrat de sodiu 1%. Înainte de întrebuinţare se amestecă
10 părţi A cu 1 parte B.
- Soluţie standard de albumină serică bovină 100 mg% în apă distilată.
- Proba proteică de determinat.

29
Mod de lucru

A. Construirea curbei etalon

Din soluţia standard de albumină se realizează diluţii după cum urmează:

Soluţie albumină Apă distilată

Nr. tub g/mL albumină ΔA
(mL) (mL)

1 0 1,0 0

2 0,1 0,9 10

3 0,2 0,8 20

4 0,3 0,7 30

5 0,4 0,6 40

6 0,5 0,5 50

7 0,6 0,4 60

8 0,7 0,3 70

9 0,8 0,2 80

10 0,9 0,1 90

11 1,0 0 100

În fiecare tub se adaugă câte 1 mL reactiv alcalin de cupru, se incubează 10 min. la

temperatura camerei, apoi se adaugă câte 3 mL reactiv Folin-Ciocâlteu diluat 1:10, se agită
energic şi se incubează 10 min. la 50°C. După aceea, probele se răcesc şi se colorimetrează la
660 nm faţă de apă distilată.

Se realizează curba etalon notând pe abscisă concentraţia proteică (g/mL) iar pe ordonată
A660.

30
C. Determinarea concentraţiei proteinei într-o probă biologică

Reactivi (mL ) Probă Martor

Probă biologică 1 mL -
Apă distilată - 1 mL
Reactiv alcalin 1 mL 1 mL
Agitare, repaus 10 min. la temperatura camerei
Reactiv Folin-Ciocâlteu diluat 3 mL 3 mL

Incubare 10 min. la 50°C, răcire, colorimetrare la 660 nm faţă de apă distilată.

Absorbanţele probelor se inseră pe curba etalon şi se transformă în valori ale

concentraţiei proteice.

31
 ENZIME
CINETICA ENZIMATICĂ

Enzimele sunt catalizatori biologici de natură proteică, caracterizaţi printr-o eficienţă

catalitică superioară celei a catalizatorilor chimici.

Caracteristici generale
 înalta specificitate de acţiune (catalizează un singur tip de reacţie);
 viteza mare de reacţie;
 capacitate de a cataliza reacţii în condiţii moderate de: pH, temperatură, presiune;
 specificitate mare pentru substrat;
 capacitate de autoreglare a activităţii catalitice.
Activitatea enzimatică a unei proteine este reprezentată ca număr de molecule de substrat
transformate de către o moleculă de proteină într-o secundă („activitatea moleculară”).

CALCULAREA VITEZEI UNEI REACŢII ENZIMATICE

Într-o reacţie enzimatică, viteza de reacţie în funcţie de concentraţia de substrat are loc
conform următoarei curbe:

vmax – saturare cu substrat

[s]

32
 KM = constanta Michaelis – reprezintă concentraţia de substrat la care viteza de reacţie
este jumătate din viteza maximă. Are dimensiunile unei concentraţii (moli/l) şi exprimă afinitatea
enzimei pentru substrat (este invers proporţională).
Dacă v0 = k+2 [ES] (viteza în orice moment)

33
 STUDIUL INFLUENŢEI CONCENTRAŢIEI DE ENZIMĂ ASUPRA VITEZEI
DE REACŢIE

Principiu
- se păstrează constantă concentraţia substratului
- se variază concentraţia enzimei în mediul de reacţie
- se reprezintă grafic viteza de reacţie în funcţie de cantitatea de enzimă
- Reacţia enzimatică este descompunerea ureei de către urează:

H2 N
ureaz
C =O + H-OH CO2 + 2 NH3
AaA
H2 N AAA
aaaaa
Reacţia este stopată după 25 min. cuaaaaa
HgCl2. Amoniacul format se titrează cu acid clorhidric
în prezenţa indicatorului roşu metil. aa

NH4OH + HCl NH4Cl + HOH

Reactivi
- soluţie uree 1 M;
- tampon fosfat pH = 7;
- soluţie HCl 0,05 N;
- soluţie indicator roşu metil
- soluţie HgCl2 0,05%;
- suspensie urează 0,1% în tampon fosfat.

Mod de lucru
Volum HCl μ moli μ moli uree
Nr. sol. sol. tampon apă
0,005 N uree desc./min.
pro uree urează fosfat distilată
pentru descompu (viteza de
bă (mL) (mL ) (mL ) (mL )
titrare si reactie)
1 2 - 4 4
2 2 1 4 3
3 2 2 4 2
4 2 3 4 1
5 2 4 4 -

Incubare 25 min. la temperatura camerei;

Stopare cu 1,5 mL soluţie HgCl2;
Adăugare 3 picături roşu metil;
Titrare cu HCl 0,05 N până la viraj portocaliu.

34
Calcul
Viteza de reacţie se exprimă în număr de moli uree descompusă/min.
1 mL soluţie HCl 0,05 N conţine 0,05  10 3 moli HCl.
La titrare, pentru 0,05  10 3 moli HCl corespund 0,05  10 3 moli NH3.
0,05
La 0,05  10 3 moli HCl corespund  10 3 moli uree.
2
1 mL HCl ........................................... 25  10 6 moli uree = 25 µmoli uree
Se calculează cantitatea de uree descompusă în µmoli/min.
Se reprezintă grafic viteza de reacţie în funcţie de concentraţia de enzimă

35
 INFLUENŢA CONCENTRATIEI DE SUBSTRAT ASUPRA ACTIVITATII
ENZIMATICE A UREAZEI CALCULUL KM

Reprezentând grafic viteza unei reacţii enzimatice în funcţie de concentraţia de substrat se

poate determina constanta Michaelis (KM).

Principiul metodei
- se menţine constantă concentraţia de enzimă;
- se modifică concentraţia de substrat;
- se reprezintă grafic 1 în funcţie de 1 ;
v [S]
Mod de lucru

Volum μ moli
Sol. Sol. Apă
Nr. Tampon HCl uree Viteza 1/v 1/[S]
uree urează distilată
probă (mL ) 0,005 N desc. de
(mL ) (mL ) (mL )
pentru reactie
titrare
1 - 2 4 4
2 1 2 4 3
3 2 2 4 2
4 3 2 4 1
5 4 2 4 -

Se păstrează probele 25 min. la temperatura camerei.

Se stopează reacţia cu câte 1,5 mL soluţie HgCl2.
Se adaugă 3 picături de soluţie roşu metil.
Se titrează cu soluţie HCl 0,05N până la viraj portocaliu.

Mod de lucru
Se calculează cantitatea de uree din fiecare probă în µmoli = [S]
1 mL soluţie uree conţine 1000 µmoli uree.
1
Se calculează .
S
Se calculează cantitatea de uree hidrolizată/min. = v. Se calculează 1 .
1 1 v
Se reprezintă grafic S în funcţie de v .

36
 DETERMINAREA ACTIVITĂŢII CATALAZEI

Catalaza (E.C. 1.11.1.6) este o enzimă prezentă în toate organismele vii.

Activitatea ei variază în funcţie de ţesut; cea mai mare activitate enzimatică există în ficat
şi rinichi şi cea mai mică în ţesutul conjunctiv.
În ţesuturi catalaza este în principal legată de mitocondrii şi peroxizomi iar în eritrocite ea
se găseşte în citoplasmă.
Reacţiile catalizate de această enzimă sunt:
catalaza
(1) 2H2O2 2H2O + O2
catalaza
(2) R-O-OH + DH2 R-OH + D + H2O
(1) – descompunerea peroxidului de hidrogen printr-o reacţie redox;
(2) – oxidarea unor donori de hidrogen
Catalaza din peroxizomi joacă un rol important în metabolizarea rapidă a peroxidului de
hidrogen, compus extrem de toxic pentru celula vie.
În eritrocite catalaza manifestă o funcţie protectoare faţă de hemoglobina şi proteinele
SH.
La concentraţii scăzute de catalază agenţii oxidanţi (H2O2, acid ascorbic, metil hidrazina)
conduc la formarea met hemoglobinei şi la oxidarea grupărilor SH din proteine.
În cazul ecosistemului marin, acţiunea de anihilare a substanţelor oxidante pătrunse în
mediu este realizată de către organismele filtratoare din ecosistem (moluşte bivalve).
De aceea, hepatopancreasul acestor organisme conţine cantităţ mari de enzimă .

Metoda Sinha

Principiul metodei
Extractul enzimatic este lăsat să acţioneze asupra H2O2 o perioadă fixă de timp, după care
reacţia este stopată cu un amestec de bicromat-acid acetic glacial.
Bicromatul de potasiu în mediu acid este redus de peroxidul de hidrogen la acetat cromic,
colorimetrabil la 570 nm.
Bicromatul nu absoarbe în această regiune, astfel încât prezenţa compusului nereactionat
nu interfera cu determinarea colorimetrică a acetatului cromic.
Apa oxigenată rămasă după stoparea reacţiei enzimatice este determinată colorimetric.

K2Cr26+O7 + 8CH3-COOH + 3H2O2 2 (CH3-COO)2Cr3++7H2O+2 CH3-COOK+8[O]0

portocaliu verde

37
Reactivi
- Reactiv bicromat-acid acetic glacial, preparat prin amestecarea unei soluţii K2Cr2O7 5% cu
acid acetic glacial în proporţie de 1:3 volume.
- Soluţie tampon K2HPO4-KH2PO4 0,01 M pH=7
- Soluţie H2O2 0,8 M : 0,88 mL perhidrol se aduce la 100 mL cu tampon.
- Soluţie H2O2 0,16 M : 1,76 mL perhidrol se aduce la 100 mL cu tampon.
- Preparat enzimatic din ficat: 1 g tesut hepatic proaspat recoltat se triturează în mojar
adăugând 5 mL apă distilată. Suspensia se centifughează 15 min. la 5000 rpm, după care
supernatantul se diluează 1/50 cu apă distilată.
- Preparat enzimatic din eritrocite: 2 mL sânge proaspăt recoltat pe heparină se centrifughează
5 min. la 2000 rpm. Se aspiră supernatantul şi se spală peletul eritrocitar cu 2 mL ser
fiziologic tamponat, la temperatura camerei, prin agitare uşoară. Se centrifughează suspensia
5 min. la 2000 rpm. Se aspiră supernatantul şi se repetă spălarea de încă două ori. Se
suspendă peletul eritrocitar rezultat în 5 mL apă distilată şi se lasă la temperatura camerei 30
min. pentru liză. Se centrifughează 30 min. la 6000 rpm pentru clarificare. Se utilizează
supernatantul limpede.
- Preparat enzimatic din cartofi: Se taie mărunt 10 g cartofi. Se triturează cu 5 g carbonat de
calciu. Amestecul se trece cantitativ într-un cilindru gradat de 50 mL şi se aduce la semn cu
apă distilată.
Conţinutul cilindrului gradat se agită energic şi se lasă în repaus 1/2 h. Soluţia se filtrează
printr-un filtru de vată.

Mod de lucru
Construirea curbei etalon
Din soluţia stoc 0,08 M H2O2 se fac diluţii după cum urmează:

mL tampon mL soluţie ΔA
Nr. tub µ moli H2O2
pH=7 H2O2 0,08 M
1 1 0 0
2 0,9 0,1 8
3 0,8 0,2 16
4 0,7 0,3 24
5 0,6 0,4 32
6 0,5 0,5 40
7 0,4 0,6 48
8 0,3 0,7 56
9 0,2 0,8 64
10 0,1 0,9 72
11 0 1 80

În fiecare tub se adaugă 2 mL reactiv bicromat iar probele se incubează 10 min. la fierbere.

38
 Se răcesc sub jet de apă şi se citesc absorbanţele la 570 nm faţă de apa distilată. Se
reprezinta grafic concentratia de H2O2 exprimata in µ moli (pe abscisă) funcţie de ΔA (pe
ordonată).
Dozarea activităţii enzimatice

Reactivi (mL ) Proba 1 Proba 2 Proba 3 Proba 4 Proba 5 Martor

Extract enzimatic 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 -
Soluţie tampon 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
Soluţie H2O2
0,16M
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
15 30 45 60 120
incubare -
sec. sec. sec. sec. sec.
Reactiv bicromat 2 2 2 2 2 2
Extract enzimatic - - - - - 0,1
ΔA
µmoli H2O2
rămaşi
nedescompuşi
µmoli H2O2
consumată
µmoli H2O2
consumată/mL
extract
enzimatic/secunda

Toate probele se fierb 10 min. pe baie de apă, se răcesc şi se citesc absorbanţele la 570 nm
faţă de apa distilată.

Calcul
Valoarea absorbanţei fiecărei probe se transformă în µmoli H2O2 consumată/mL extract
enzimatic/secunda. Pentru aceasta, din cantitatea iniţială de 80 µmoli H2O2 din mediul de reacţie
(o,5 mL sol. H2O2 0,16 M) se scade cantitatea de H2O2 determinată prin citirea absorbanţei
probelor şi interpolarea valorii găsite pe curba-etalon (cantitatea rămasă nedescompusă).
Se poate calcula constanta de viteză pentru reacţia monomoleculară după formula:
1 S
K   log 0
t S
S0 = concentraţia iniţială de H2O2 (80 µmoli)
S = concentraţia finală de H2O2
t = timpul de reacţie (secunde)

39
 DOZAREA ACTIVITĂŢII PEROXIDAZEI (METODA BRAD ŞI
COLABORATORII)
Peroxidazele desemnează o grupă de enzime specifice (NAD peroxidaza, NADP
peroxidaza, acid gras peroxidaza, citocrom peroxidaza, glutation peroxidaza), cât şi nespecifice
care pot dona hidrogenul unui număr mare de substrate.
Sistemele de detoxifiere ale organismului conţin peoxidaze nespecifice capabile să
oxideze oxignul peroxidic la O2-.
În ţesuturile şi secreţiile mamiferelor peroxidazele nespecifice se găsesc în: leucocite
(mieloperoxidaza), lapte (lactoperoxidaza), ficat, splină, uter, glande salivare, peretele intestinal,
mucoasa intestinală, plămân, glandă tiroidă.
Reacţiile catalizate de aceste enzime sunt:
peroxidaza
DH2 + H2O2 2H2O + D DH2 = donor de hidrogen

Principiul metodei
Acidul ascorbic este oxidat de apa oxigenată sub acţiunea peroxidazei din preparatul
enzimatic (1). Reacţia are loc în prezenţa benzidinei în calitate de indicator redox (2).
Produsul de oxidare al benzidinei este de culoare albastră. Pentru determinarea activităţii
enzimei se măsoară timpul de apariţie al acestui produs în sistem (timpul de oxidare al donorului
de hidrogen).

Reactivi

- Tampon acid acetic – acetat de sodiu 0,1 M pH = 4,7

- H2O2 1% în soluţie acetat
- Soluţie acid ascorbic 1% în soluţie tampon acetat
- Reactiv benzidină: 0,230 g benzidină se dizolvă în 3 mL acid acetic glacial. Se adaugă 6,8 g
acetat de sodiu cristalizat şi se aduce la un volum final de 250 mL cu apă distilată

40
- Preparat proteic cu activitate peroxidazică: se rad 5 g de hrean, care se suspendă în 100 mL .
tampon acetat o oră la cald. Se decantează supernatantul.
Se diluează preparatul proteic cu activitate peroxidazică după cum urmează:

Reactiv (mL ) D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7
apă distilată 0,9 0,8 0,7 0,6 0,4 0,2 0
Prep. proteic 0,1 0,2 0,3 0,4 0,6 0,8 1

Mod de lucru

Se folosesc cele cinci diluţii de preparat enzimatic, corespondente numărului probei.

Reactivi (mL ) P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7
Sol. acid 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
ascorbic
Soluţie H2O2 1 1 1 1 1 1 1
Benzidină 2 2 2 2 2 2 2
Prep. enzimatic 1 -D1 1 -D2 1 - D3 1 - D4 1 - D5 1 - D6 1 - D7
Timp de reacţie
(secunde)
Viteza de
reacţie

Se determină pe rând timpul necesar pentru oxidarea celor 11,2 µmoli de acid ascorbic
din fiecare probă (timpul după care soluţia de benzidină devine albastră).

Calcul

Viteza reacţiei catalizate de peroxidază se exprimă în µmoli acid ascorbic oxidat/mL

preparat enzimatic/ min. la temperatura camerei.
Cu ajutorul rezultatelor obţinute se poate construi un grafic, trasând pe ordonată viteza de
reacţie şi pe abscisă mL preparat enzimatic concentrat din probă.

nr. µmoli ac. ascorbic

v1 =
t1 • 0,1
nr. µmoli ac. ascorbic
v2 =
t2 • 0,2

41
 DETERMINAREA ACIDULUI ASCORBIC DIN SUCURI
DE FRUCTE PROASPETE

Principiul metodei

Acidul ascorbic (vitamina C) este oxidat cu ajutorul dicromatului de potasiu in prezenţa KI.

3 + Cr2O72- + 8H+ 3 + 2Cr3+ + 7H2O

Excesul de ion dicromat reacţionează cu ionii iodură, eliberând iod.

Cr2O72+ + 9I- + 14H+ 3[I3]- + 2Cr3+ + 7H2O
Iodul eliberat colorează mediul de reacţie cu amidon în albastru.

Materiale

- Soluţie standard acid ascorbic 1,5 g/dL

Se prepară prin dizolvarea a 0,15 g acid ascorbic p.a. în 10 mL apă distilată.
- Soluţie K2Cr2O7 0,1 N
Se cântăresc exact 4,9035 g K2Cr2O7 fin pulverizat şi uscat la 120-130° C. Se aduc în balon cotat
de 1000 mL şi se dizolvă. Se completează la semn cu apă distilată.
- Soluţie iodură de potasiu 0,1 N
Se cântăresc exact 16,6 g KI care se aduc în balon cotat de 100 mL, se dizolvă şi se completează
apoi la semn cu apa distilată. Se păstrează în sticle brune.
- Acid clorhidric concentrat
- Soluţie amidon 1 %
1 g amidon se triturează cu 5 mL apă rece. Amestecul se toarnă încet şi sub agitare în 100 mL
apă la fierbere. Se mai fierbe 2-3 minute la foc mic, pe sita de azbest, până când lichidul devine
transparent sau uşor opalescent.
- Suc de fructe proaspete (mere, portocale, grapefruit) filtrat prin vată şi tifon.

42
Mod de lucru

În doua vase Erlenmayer de 300 mL, notate P şi St, se pipetează:

Reactivi (mL ) P St
Soluţie standard - 10
Suc de fructe 10 -
HCI concentrat 10 10
Sol. amidon 1 1

Se adaugă câte 100 mL apă în ambele vase si câte 5-6 picături KI 0,1 N.
Se titrează cu K2Cr2O7, 0,1 N până la coloraţie albastru persistent.

Calcul

Conc. acid ascorbic în proba (g/dL) = Vp/Vst x 1,5

Vp =volumul de soluţie K2Cr2O7 cu care s-a titrat proba

Vst = volumul de soluţie K2Cr2O7 cu care s-a titrat standardul

43
 EXTRACŢIA CAROTENOIZILOR DIN ŢESUTURILE
VEGETALE

Principiu

Componentele hidrofobe din organele nefotosintetizante ale plantelor pot fi extrase cu un

amestec metanol-cloroform-apă. Compusii hidrofobi se repartizează în stratul cloroformic.

Reactivi
- metanol absolut
- cloroform
- morcovi

Mod de lucru
- 20 g material vegetal este mărunţit cu ajutorul unei răzătoare;
- se suspendă în 30 mL amestec metanol-cloroform (2:1 v/v);
- se omogenizează 5 min. în mojar la temperatura camerei;
- se filtrează omogenatul. Se păstrează filtratul;
- reziduul se suspendă din nou în 30 mL amestec metanol-cloroform şi 10 mL apă;
- se omogenizeze din nou;
- se filtreze omogenatul. Se păstrează filtratul;
- cele două filtrate obţinute se pun intr-o pâlnie de separare peste care se adaugă 7,5 mL
cloroform şi 9 mL apă;
- se lasă să se separe cele două faze;
- se colectează stratul cloroformic;
- se concentrează prin încălzire pe baia de apă.

SEPARAREA CAROTENOIZILOR PRIN

CROMATOGRAFIE ÎN STRAT SUBŢIRE

Principiul metodei

Cromatografia pe strat subţire este o metodă eficientă de separare a amestecurilor complexe.

Metoda se aplică în special pentru detectarea impurităţilor în cazul dozărilor farmaceutice
exacte, la detectarea şi la izolarea drogurilor interzise şi la separarea amestecurilor organice
sintetice.
Cromatografia pe strat subţire este similară cu cromatografia pe hârtie deoarece în ambele
cazuri proba este aplicată pe o suprafaţă plană, poroasă. Proba este apoi separată prin eluţie şi
detectată printr-o reacţie chimică de formare a culorii sau prin fluorescenţă.
Amestecul este analizat calitativ prin calcularea valorilor Rf pentru spoturile respective.

44
Materiale si metode
- plăci acoperite cu Silicagel G 20x6 cm;
- soluţie -caroten etalon 0,01 g/mL ;
- soluţie necunoscută;
- amestec de eluţie 8:2 ciclohexan-dietil eter sau 9:1 acetonă – apă

Mod de lucru
Cu ajutorul unui tub capilar se aplică fiecare soluţie pe linia de start. Se lasă să se evapore
solventul.
Se introduce în camera de developare şi se lasă ca solventul să se deplaseze circa 15 cm.
Se scoate şi se marchează frontul de solvent cu un creion. Se usucă placa. Carotenoizii pot fi
observaţi sub forma unor spoturi de culoare galbenă sau portocalie pe fundal alb.
Se încercuieşte fiecare spot, se calculează valorile Rf şi se determină compoziţia soluţiei
necunoscute.

45
 DETERMINAREA INDICELUI DE ACIDITATE AL
UNUI ULEI

Prin indice de aciditate se înţelege numărul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar

pentru neutralizarea acizilor graşi liberi conţinuţi în 1 g probă de analizat (uleiuri volatile, uleiuri
grase, balsamuri, ceruri, etc.).

Reactivi şi soluţii

- amestec de solubilizare alcool etilic: eter etilic 1:1 (V:V) neutralizat

- soluţie apoasă KOH 0,1 N
- soluţie fenolftaleină 1%

Mod de lucru

Se cântăresc la balanta analitică 5 g probă de analizat. Se dizolvă în 50 mL amestec de

solubilizare. Dacă este necesar, dizolvarea se efectuează prin încălzire pe baia de apă, la reflux.
Se titrează cu soluţie KOH 0,1 N în prezenţă de fenolftaleină, până la coloraţie roz
persistent.

Calculul rezultatelor

Indicele de aciditate IA se calculează cu ajutorul formulei:

V · 5,61
IA =
m

unde :
V = volumul soluţiei de hidroxid de potasiu 0,1 N utilizat pentru titrare (în mL)
m = masa probei luate în lucru (în g)
5,61 = mg KOH corezpunzător la 1 mL hidroxid de potasiu 0,1 N

Observaţie

Dacă în timpul titrării apare o tulbureală se mai adaugă amestec de dizolvare până la re
dizolvare.

46
 DETERMINAREA INDICELUI DE PEROXID AL UNUI
ULEI
Determinarea indicelui de peroxid descrie o metodă de stabilire a oxidării (râncezirii)
grăsimii. Indicele de peroxid reprezintă conţinutul de peroxid şi alte substanţe oxidante dintr-o
anumită cantitate de grăsime, care, în condiţiile metodei descrise, oxidează iodura de potasiu
punând în libertate iodul.
Prin indice de peroxid se înţelege numărul de mL de tiosulfat de sodiu 0,01 M oxidat de
ionul eliberat din acidul iodhidric prin acţiunea peroxizilor din 1 g probă de analizat.

Reactivi şi soluţii

- Cloroform (înainte de folosire se barbotează cu un curent de gaz inert timp de 10 min).

- Acid acetic glacial (înainte de folosire se barbotează cu un curent de gaz inert timp de 10
min).
- amestec de solubilizare acid acetic: cloroform 18:12 (V:V)
- Iodură de potasiu, soluţie apoasă saturată, proaspăt preparată, lipsită de iod liber şi iodaţi: se
dizolvă 15 g iodură de potasiu în 10 ml apă. Soluţia trebuie să conţină, după agitare, cristale
nedizolvate de iodură de potasiu şi să fie incoloră.
- Tiosulfat de sodiu, soluţie 0,01 n sau 0,002 n: se prepară înainte de utilizare, prin diluţie cu
apă, din soluţie 0,1 n de tiosulfat de sodiu. Titrul soluţiei se stabileşte înainte de fiecare
înainte de fiecare determinare, cu bicromat de potasiu soluţie 0,01 n sau 0,002 n, astfel: cu
ajutorul unei biurete se măsoară 25 ml soluţie de bicromat de potasiu 0,01 n sau 0,002 n, se
introduc într-un vas Erlenmeyer cu dop şlefuit, de 200 ÷ 300 ml, se adaugă 5 ml acid
clorhidric d = 1,19 şi 1,5 g iodură de potasiu dizolavtă în 15 ml apă. Se închide vasul
Erlenmeyer, se agită conţinutul şi se lasă în repaus, la întuneric, 5 min. În continuare se
adaugă în vasul Erlenmeyer aproximativ 100 ml apă, spălându-se bine pereţii vasului şi se
titrează cu tiosulfat de sodiu soluţie 0,01 n sau 0,002 n, agitând mereu, până când culoarea
soluţiei trece din brun în galben deschis. Se adaugă 2 ml soluţie de amidon şi se continuă
titrarea până la trecerea culorii din albastru intens în verzui.
- Amidon, soluţie apoasă 1%, proaspăt preparată: se amestecă 1 g amidon cu 10 ml apă rece şi
apoi se toarnă în 90 ml apă încălzită la fierbere; se fierbe aproximativ 3 min. Se foloseşte
după răcire.

Mod de lucru

Se cântăresc la balanta analitică 5 g probă de analizat şi se transvazează cantitativ într-un

flacon cu dop rodat. Se dizolvă prin agitare sau prin încălzire în 30 mL amestec de solubilizare.
După răcire se adaugă 1 mL soluţie iodură de potasiu 1 g/mL proaspăt preparată şi se agită
energic timp de 1 min.
Se adaugă 30 mL apă şi se titrează cu soluţie tiosulfat de sodiu 0,01 M, până la coloraţie
galben deschis. Se adaugă 2 mL soluţie amidon şi se continuă titrarea agitând energic, până la
decolorare.

47
În paralel se efectuează o determinare martor cu aceeaşi reactivi, în aceleaşi condiţii ca mai sus,
înlocuind extractul cloroformic, cu cloroform (10 mL).
Dacă la determinarea martor se folosesc mai mult de 0,1 mL soluţie de tiosulfat de sodiu 0,01 N
trebuie să se prepare noi reactivi.

Calculul rezultatelor

Indicele de peroxid, exprimat în miliechivalenţi de oxigen activ la un kg grăsime din produs, se

calculează cu formula:

(V1  V0 ) n
indice de peroxid =  1000 (miliechivalenţi/kg)
m
unde:
V1 este volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu utilizat la titrarea probei de analizat, în mL
V0 este volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu utilizat la titrarea probei martor, în mL
m este masa grăsimii în grame,
n este normalitatea soluţiei de tiosulfat de sodiu folosită la titrare (0,01 sau 0,002).

Rezultatul se calculează cu o zecimală.

48
 IZOLAREA SI IDENTIFICAREA AMIDONULUI DIN
TESUTURI VEGETALE
Amidonul este un polizaharid format din unitati de glucoza unite intre ele prin legaturi α-
glucozidice. Este constituit din doua componente:
-amiloza este o molecula cu structura lineara si helicoidala, reprezentand 20-30 % din structura
amidonului.
-amilopectina este o molecula cu structura ramificata si reprezinta 70-80 % din structura
amidonului.

Principiul metodei:
Amidonul este extras din cartof prin spalare sub jet de apa si precipitare in final cu
metanol. In prezenta polizaharidelor, iodul formeaza compusi de incluziune de culoare rosu-
brun(amilopectina) sau albastru inchis (amiloza) care dispare la incalzire. Dupa racire coloratia
reapare.

Reactivi si solutii :
- metanol
- solutie I2 0,05 M
- apa distilata

49
Mod de lucru:
Cartofii decojiti si maruntiti sunt introduşi intr-un omogenizator cu cutite, timp de 5
minute in prezenta a doua trei volume de apa distilata. Maruntirea trebuie realizata la o turatie
moderata pentru a evita ruperea granulelor de amidon. Omogenatul este filtrat prin mai multe
straturi de tifon, care sunt in final stoarse si amidonul spălat sub jet de apa. Pasta obţinuta este
resuspendată in apa distilata si maruntita inca 5 minute la omogenizator. Se repeta operatia de
filtrare prin straturile de tifon, prin stoarcerea puternica a acestora. Suspensiile de amidon sunt
reunite si lăsate timp de o ora pentru sedimentarea polizaharidului. Amidonul de calitate
superioara sedimentează cel mai rapid deci se recomanda decantarea soluţiei când este inca
tulbure. Sedimentul este reluat in douăzeci de volume de apa si suspensia este lăsată din nou sa
sedimenteze. Amidonul este separat prin decantarea soluţiei supernatante, si este resuspendat in
metanol, filtrat pe o palnia Buchner, spălat pe o pâlnie cu metanol si uscat la 40-50 °C.
Identificarea amidonului se realizează prin adăugarea a 5-10 picaturi solutie iod peste
solutia de amidon obţinută.

50
 DETERMINAREA GLUCOSTEROIZILOR
PLASMATICI PRIN COLORIMETRIE

Principiul metodei
Dupa extractia si purificarea probelor plasmatice hormonii corticali sunt determinati sub
forma de cromogeni Porter-Silber ce se formeaza intre catena de la C17 a corticosteroizilor si
fenilhidrazina in mediu acid.

Reactivi:
-Eter de petrol
-Clorura de metilen
-Hidroxid de sodiu
-Acid sulfuric 62% alcoolic:50 ml acid sulfuric(62% se amesteca cu 25ml alcool metilic
absolut)
-reactiv Porter-Sielber: 32,5 mg fenilhidrazina se dizolva in 50 ml acid sulfuric 62%, apoi
se adauga 25 ml alcool etilic absolut
-solutie etalon stoc: 25 mg corticosteron se dizolva in 20 ml etanol absolut. Solutia de
lucru se obtine prin diluarea etanolului stoc cu etanol absolut in proportie de 1:5000.

Tehnica de lucru
a) purificarea plasmei: intr-o eprubeta de centrifuga se agita 5 min o parte de plasma
impreuna cu trei parti eter de petrol. Solutia se centrifugheaza 10 minute la 2500 rpm, iar
faza eterica se arunca.
b) Extractia steroizilor: in eprubeta de centirfuga cu dop se pipeteaza o parte plasma
purificata si 5 parti clorura de metilen. Se agita bine timp de 10 minute , apoi se
centrifugheaza 10 minute la 4000 rpm.
c) Purificarea extractului: faza organica se spala prin agitare 30 secunde cu 15 volume
hidroxid de sodiu 0,1 N. După separarea si eliminarea fazei alcaline se repeta spalarea in
aceleasi conditii. In final,aceasta operatie se repeta numai cu apa distilata. Solutia se
centrifugheaza 5 min la 3000rpm; faza organica este reţinuta pentru reacţia de culoare.
d) Reactia de culoare: din faza organica se pipeteaza cate 4 ml in doua eprubete.
- in prima eprubeta ( proba) se adauga 1,2 ml reactiv de culoare Porter-Sileber,
- in a doua eprubeta (martor), 1,2 ml acid sulfuric alcoolic.
- in a treia eprubeta (etalon) se adauga 4 ml solutie etalon de lucru si 1,2 ml reactiv de
culoare Porter-Sileber.
Probele se agita 2 minute si se centrifughează. Supernatantul se transfera intr-o alta eprubeta.
Dupa incalzire pe baie de apa la 60°C , soluţia se raceste timp de 30 de minute. Intensitatea
culorii se citeşte la 410 nm.

Calcularea rezultatelor :

C glucocorticoizi/ml plasma= ΔAp/ΔAs x conc. sol stadard

51