Tehnici de separare: Electroforeza capilară (CE)

Electroforeza capilară, numită datorită performanţelor sale şi electroforezăcapilară de mare

performanţă (HPCE – high performance capillary electrophoresis), realizează separarea electroforetică
pe o capilară foarte îngustă (din silice sau teflon, cu diametrul între 25 şi 75 μm, iar lungimea cuprinsă
între 10 şi 80 cm), în care se găseşte o soluţie tampon.
Utilizarea capilarei are multe avantaje, dar primul şi cel mai important este înlăturarea efectului
Joule de încălzire. Rezistenţa electrică mare a capilarei permite aplicarea unui potenţial electric foarte
mare (între 100 şi 500 V/cm), cu generarea unei cantităţi minime de căldură. In plus, datorită raportului
mare suprafaţă/volum în cazul capilarei, are loc o disipare eficientă a căldurii care este generată la
transportul speciilor încărcate prin mediul lichid.
Este cunoscut faptul că, la nivel periferic, cuarţul prezintă din loc în loc grupări hidroxilice
reziduale (grupări silanol, cu caracter acid). Dacă electrolitul suport introdus în capilare de cuarţ se
găseşte la un pH suficient de mare (≥ 4), grupările hidroxilice reziduale vor disocia, generând sarcini
negative distribuite la nivelul peretelui intern. In acest mod se va forma la nivelul peretelui un strat
dublu electric (vezi figura 1). Contraionii, dispuşi în straturi lângă suprafaţa internă a capilarei de cuarţ,
pentru a egaliza sarcina suprafeţei, vor genera un potenţial, denumit potenţial zeta ξ. Contraionii din
stratul rigid (Stern), la aplicarea potenţialului E, se vor deplasa către catod. Aceastămigrare în câmp
electric va atrage după sine deplasarea ionilor electrolitului, din straturile difuze, dar şi a moleculelor
de apă care hidratează ionii. In consecinţă, va apărea în interiorul coloanei o deplasare de la anod către
catod, cunoscută sub numele de migrare electroosmotică, sau electroendosmotică.
Viteza de deplasare electroosmotică vEOF este dependentă de mobilitatea electroosmotică a
ionilor din electrolitul suport, potenţialul zeta ξ generat la interfaţa capilară/electrolit suport, constanta
dielectricăε, vâscozitatea electrolitului suport ηşi câmpul aplicat:

Conform acestei relaţii, mobilitatea electroosmotică este:

De remarcat, însă, că această mobilitate este independentă de câmpul aplicat. Sensul

componentei de deplasare electroosmotică depinde de modul în care se ionizează suprafaţa internă a
capilarei.

1
 Chiar în cazul în care materialul din care este confecţionată capilara nu prezintătendinţă de
ionizare la interfaţa cu electrolitul suport, componenta electroosmotică apare datorită adsorbţiei ionice,
specifice la nivelul acestei suprafeţe. pH-ul electrolitului suport influenţează în cea mai mare măsură
mobilitatea electroosmotică. Figura 2, prezintă o astfel de dependenţă în raport cu materialul din care
este confecţionată capilara şi cu pH-ul electrolitului suport.

Figura 1. Reprezentarea dublului strat format la nivelul peretelui interior al capilarei

Figura 2. Dependenţa mobilităţii electroosmotice (μEOF) în raport cu pH-ul electrolitului suport,

pentru trei materiale din care sunt des confecţionate capilarele in HPCE.

2
 Modalităţile de influenţare a câmpului electroosmotic prin diverşi parametri experimentali sunt
prezentate schematic în tabelul următor.
Tabelul 1. Modalităţi de control a câmpului electroosmotic

In condiţii bine determinate, fluxul electroosmotic poate anula câmpul electroforetic. In cazul în
care evEOFv>, speciile anionice vor migra către catod, în cazul operării cu capilare din cuarţ. In
consecinţă, mobilitatea analitului (μa) se poate calcula după relaţia:

unde: V reprezintă voltajul aplicat;

l reprezintă lungimea efectivă a capilarei (până în zona de detecţie);
L reprezintă lungimea totală a capilarei;
t reprezintă timpul de migrare;
E reprezintă câmpul electric.
Eficienţa globală a separărilor HPCE este condiţionată de următorii factori:
• difuzie;
• injecţie;
• temperatură;

3
• adsorbţie selectivă;
• volumul zonei de detecţie;
• electrodispersie.
Abaterea standard pentru picul unui analit va fi, în consecinţă, condiţionată de procesele de
lărgire a frontului acestuia prin fenomenele amintite anterior:

Instrumentaţie
Componentele unui sistem electroforeză capilară de mare performanţă sunt redate schematic în
figura următoare.

Figura 3. Schema-bloc a unui sistem de electroforeză capilară

Conform datelor conţinute în tabelul 2, rezultă că volumele de injecţie trebuie să fie foarte
reduse. De aceea, este important ca porţiunea din capilară în care proba este introdusă în momentul
injecţiei să fie cât mai redusă ca lungime, pentru a nu influenţa eficienţa globală a separării. Cele mai
importante modalităţi de injecţie în HPCE sunt prezentate schematic în figura 3 şi descrise parametric
în continuare.[1]
Injecţia hidrodinamică constă fie în aplicarea unui regim de presiune, fie a unui regim de
vacuum, în unul dintre rezervoarele în care se găseşte probă sau electrolit, fie se apelează la sifonare
între cele două rezervoare, prin intermediul capilarei. In conformitate cu ecuaţia Hagen-Poiseuille,
volumul de probă injectat este dat de relaţia:

4
unde: ΔP reprezintă diferenţa de presiune;
d reprezintă diametrul intern al capilarei;
t reprezintă timpul de injecţie;
η reprezintă vâscozitatea tamponului;
L reprezintă lungimea totală a capilarei.
In cazul sifonării ca modalitate de injecţie:

unde: ρ reprezintă densitatea tamponului;

g reprezintă constanta gravitaţională;
Δh reprezintă diferenţa de înălţime între rezervoare.
Cantitatea de probă injectată se poate calcula în conformitate cu relaţia:

Tabelul 2. Dependenţa volumului de injecţie de parametrii capilarei şi presiunea aplicată.

S-a putut demonstra că proba poate penetra în coloană în momentul imersiei capătului capilarei,
fără aplicarea de presiune, vacuum sau sifonare. O lungime a frontului de probă în astfel de condiţii a şi
fost determinată. Efectul este mai însemnat în cazul capilarelor cu diametru interior mai mare. S-a mai
luat în considerare şi faptul că imersia capătului capilarei în rezervorul de probă poate conduce la
adsorbţia de analiţi pe suprafaţa exterioară a acesteia, ceea ce poate afecta ulterior, în mod serios,
eficienţa separării. S-a demonstrat experimental că spălarea suprafeţei externe a capilarei are ca efect
creşterea simetriei picurilor şi reducerea efectelor de trenă. Totodată, modul de tăiere a capătului
capilarei prezintă un rol important. O secţiune oblică de tăiere poate scădea eficienţa globală a separării
la jumătate. Injecţia electrocinetică se realizează prin imersarea capătului coloanei capilare în soluţia de
probă şi aplicarea unui câmp electric (în general de 3 - 5 ori mai scăzut decât cel folosit pe durata
separării). Pe durata injecţiei electrocinetice analitul pătrunde în capilară atât prin migrare, cât şi prin
efectul de pompare al câmpului electroosmotic.

5
 In cazul injecţiei electrocinetice apare o discriminare generată de mobilităţile caracteristice
fiecărui analit.
Cantitatea de analit injectată este dată de relaţia:

unde: μe reprezintă mobilitatea electroforetică a analitului;

μEOF reprezintă mobilitatea electroosmotică;
V reprezintă voltajul aplicat;
r reprezintă raza capilarei;
C reprezintă concentraţia analitului;
t reprezintă timpul de injecţie;
L reprezintă lungimea totală a capilarei.

Figura 4. Modalităţi de injecţie a probei în HPCE.

Detecţia cea mai utilizată în HPCE se bazează pe absorbţia radiaţiei în ultraviolet şi vizibil,
prezentând asemănări cu detecţia în cromatografia de lichide (vezi tabelul 3).[2] Deoarece fereastra
optică a detectorului este situată chiar pe peretele capilarei, în acest caz nu există efecte de lărgire a
picului HPCE datorat volumul celulei. Alte metode de detecţie spectrometrică se bazează pe

6
fluorescenţa analiţilor separaţi sau prin inducerea fluorescenţei cu ajutorul laserului. Metodele
amperometrice sau conductometrice sunt de asemenea utilizate în detecţia HPCE.
Tabelul 3. Performanţele tipurilor de detecţie în HPCE.

7
 BIBLIOGRAFIE

[1]. D. Bulgariu, Laura Bulgariu - Metode instrumentale de analiză – Principii Vol. 2, Editura
Universitatii “Alexandru Ioan Cuza”, Iasi.

[2]. Lorentz JÄNTSCHI, Horea Iustin NAŞCU - Chimie Analiticăşi Instrumentală