BIOTEHNOLOGII DE OBŢINERE A SUBSTANŢELOR BIOLOGIC ACTIVE

CAP. 2 –MICROORGANISMEUTILIZATE ÎN BIOTEHNOLOGII

În comparație cu diversitatea microorganismelor prezente în mediile naturale, biotehnologiile microbiene utilizează un număr relativ
restrâns de specii:

 bacterii (inclusiv actinomicete);

 fungi: drojdii (levuri) și mucegaiuri (micromicete, fungi filamentoși)
 alge microscopice

Microorganismele sunt utilizate în biotehnologii în scopul:

 obţinerii de medicamente, alimente, furaje, surse neconvenţionale de energie;

 valorificării superioare a minereurilor, zăcămintelor petroliere şi carbonifere;
 combaterii poluării mediului înconjurător.

Microorganismele prezintă o serie de avantaje față de plante sau animale:

 au un ritm de creștere mult mai rapid în comparație cu organismele vegetale sau animale: timpul unei generații este de doar
15 minute la Escherichia coli, în comparație cu 12 ani la om, 24 de luni la vite, 18 luni la porc sau 6 luni la păsări;
 spațiul necesar dezvoltării microorganismelor este mult mai mic în comparație cu cel necesar cultivării plantelor sau creșterii
animalelor;
 costurile aferente cultivării microorganismelor corelate cu randamentul de obținere al produșilor finali sunt mai mici;
 microorganismele nu sunt influențate de condițiile climatice care pot afecta grav producțiile agricole;
 microorganismele nu sunt afectate de bolile și dăunătorii care apar la plante și animale, cheltuielile efectuate în acest sens
fiind mult mai mici;
 Condiţii de îndeplinit
Să crească rapid pe un substrat organic cât mai ieftin;

Să fie echipat cu un echipament enzimatic specific procesului biotehnologic;

Să producă transformările dorite într-un mod simplu şi rapid, cu randamente superioare şi consumuri energetice limitate

Să formeze uşor o cultură abundentă;

Să poată fi conservat în timp fără să-şi modifice proprietăţile biochimice şi genetice;

Produşii elaboraţi să fie uşor extraşi din lichidul de cultură sau celula microbiană.

Influenţa factorilor de mediu asupra creşterii bacteriilor

Creşterea bacteriilor este influenţată de: nutrienți, temperatură, pH-ul, O2, CO2, presiunea osmotică.

Cunoașterea modului în care acești factori influențează dezvoltarea microorganismelor reprezintă o condiție esențială în vederea
obținerii substanțelor biologic active.

Substanțele nutritive
Celula bacteriană este extrem de sensibilă la variaţiile concentraţiei nutrienților.

Mărirea concentraţiei de nutrienți în mediul de cultură poate conduce la creșterea numărului de celule bacteriene, dar numai până la
anumite limite peste care multiplicarea este încetinită de procesele de inhibiţie care au loc la nivelul celulei.
Pentru un sistem de biosinteză se stabileşte concentraţia optimă a substratului atât în momentul iniţial, cât şi pe parcurs.

De exemplu, concentraţia de 10-15 % în sursă de carbon (glucoză, zaharoză) este inhibitoare, ele dezvoltându-se bine la valori ale
sursei de carbon sub 10 %.Alţi nutrienţi (sursa de azot, elemente minerale, vitamine, aminoacizi) pot influenţa negativ rata creşterii la
concentraţii inferioare substraturilor hidrocarbonate .

Temperatura
Reprezintă unul dintre cei mai importanţi factori de mediu care influenţează metabolismul, creşterea şi supravieţuirea bacteriilor.

Influența asupra creșterii este mult mai importantă în comparație cu celelalte organisme deoarece bacteriile sunt microorganisme
unicelulare, temperatura lor variind în funcție de temperatura mediului ambiant.
Efectul temperaturii asupra creșterii este determinat de sensibilitatea reacțiilor catalizate de enzime.

Creșterea temperaturii determină mărirea ratei de creștere deoarece viteza reacțiilor catalizate de enzime se dublează la fiecare 10°
C, ceea ce duce la o intensificare a metabolismului.

Peste o anumită valoare temperatura încetinește creșterea, valorile prea mari fiind letale (denaturarea enzimelor și a proteinelor,
distrugerea membranelor celulare.).
Creșterea are o dependență caracteristică de anumite temperaturi cardinale:

 temperatură minimă (mai puţin favorabilă diviziunii celulare);

 temperatură optimă (la care se produce cea mai rapidă diviziune celulară, rezultând un număr maxim de celule pe unitatea de
timp);
 temperatură maximă (la care activitatea biologică este încă posibilă iar multiplicarea poate fi evidenţiată).

În funcţie de preferinţele termice bacteriile (ca şi celelalte microorganisme) au fost clasificate în următoarele categorii:

 psihrofile sau criofile: cresc la 0° C, cu o temperatură optimă la 15° C și maximă la 20° C;

 mezofile: temperatura optimă cuprinsă între 20 și 45° C, minimă 15 - 20° C și maximă 45° C;
 termofile: temperatura minimă în jur de 45° C, iar optimă între 55 și 65° C; temperatura maximă peste 55° C;
  hipertermofile: au temperatura optimă de creștere cuprinsă între 80 și 113° C, nu cresc sub 55° C.

Unele bacterii termofile, ca de exemplu Lactobacillus delbrueckii, utilizat la producerea acidului lactic, necesită pentru dezvoltare o
temperatură de 45° C.

Din punct de vedere industrial, acest fapt constituie un avantaj important, deoarece înlătură posibilitatea contaminării cu alte
microorganisme care se pot dezvolta la această temperatură.
Pentru un proces de biosinteză industrial, temperatura este unul din parametri fizici cei mai importanţi, implicat în optimizarea
procesului.
Variaţiile temperaturii au efect asupra randamentului de transformare al substratului în produsul dorit, cerinţelor nutritive ale
microorganismului, vitezei de creştere.

De exemplu, o tulpină producătoare de penicilină necesită pentru creşterea masei celulare o temperatură de 30° C, pentru respiraţie
21,7 - 28,6° C, iar pentru producerea penicilinei 24,7° C.
pH-ul
Majoritatea bacteriilor sunt neutrofile, crescând preferenţial în mediile neutre sau uşor alcaline (pH = 7 - 7,5).

Există şi bacterii acidofile, care preferă un pH acid (pH = 5 - 5,5) - ex. lactobacilii, streptococii lactici etc.

Altele, se dezvoltă la un pH crescut (pH = 8,5 – 11,5) fiind numite bacterii bazofile.
Preferințele bacteriilor pentru diferite valori ale pH-ului sunt utilizate în biotehnologiile microbiene

Unele bacterii bazofile au numeroase utilizări industriale deoarece produc enzime hidrolitice (proteaze, lipaze) active la pH alcalin
utilizate la obţinerea detergenţilor.

Limitele de pH optime creşterii fiecărui microorganism sunt folosite pentru a reduce posibilitatea contaminării culturilor din
bioreactoare.
Influența pH-ului se răsfrânge asupra vitezei de creștere a microorganismelor și randamentului de conversie a substratului în produși
de biosinteză.
Din aceste motive sunt importante determinarea și corectarea pH-ului la valoarea optimă în fiecare fază a unui proces fermentativ.
Aceasta deoarece în fermentaţia industrială se pot forma CO2 şi acizi organici, care modifică progresiv pH mediului, împiedicând
dezvoltarea microorganismelor.
În alegerea agenţilor de corectare a pH-ului trebuie ţinut cont de compoziţia chimică a mediului, de caracteristicile microorganismului
etc.
În cazul în care valoarea pH-ului este sub cea prescrisă se pot folosi pentru corecţie soluţii de NaOH sau KOH, K2HPO4, NH3 gazos
sau soluţie.
Când valoarea pH-ului este peste cea prescrisă se pot adăuga HCl, H2SO4, HNO3, KH 2PO4.

Folosirea fosfaţilor pentru prepararea mediilor de cultură este indicată deoarece:

 reprezintă singurele substanţe neutralizante care reglează pH-ul în limite optime, fără a avea efect toxic asupra bacteriilor
 reprezentă o sursă de fosfor utilă în metabolismul bacterian.
Oxigenul
Este indispensabil creșterii bacteriilor aerobe, dar în acelaşi timp toxic pentru cele anaerobe.

În funcție de preferințele pentru oxigen, bacteriile pot fi:

 strict aerobe: folosesc exclusiv respiraţia aerobă; pentru a obţine culturi de bacterii aerobe în medii lichide este necesară o
aerare a mediului, realizată prin agitare sau prin barbotarea aerului;
 aerobe facultativ anaerobe: sunt aerobe dar pot crește și în absența oxigenului; au posibilitatea de a obţine energia atât pe
cale oxidativă cât şi prin fermentaţii, cu un randament însă mai scăzut.
 microaerofile: se dezvoltă numai în prezenţa unor concentraţii reduse de O2 (aproximativ 2 - 10 %), folosind exclusiv respiraţia
aerobă;
 strict anaerobe folosesc exclusiv procesele fermentative pentru a obţine energia, dezvoltându-se doar în lipsa oxigenului
datorită lipsei enzimelor (superoxid-dismutaza - SOD, catalaza, peroxidaza) care elimină radicalii toxici de oxigen;
 pentru cultivarea lor se utilizează vase de cultură speciale (anaerostate) care permit eliminarea O2 şi eventuala înlocuire cu un
gaz inert.
 anaerobe aerotolerante: au un metabolism de tip fermentativ, dar rămân viabile în prezenţa oxigenului.
 Concentrația osmotică
Influențează creșterea bacteriilor datorită permeabilității selective a membranei citoplasmatice.

În soluții hipotonice (cu o concentrație osmotică mai mică decât cea intracelulară) apa pătrunde în celulă provocând distrugerea ei.
Cu toate acestea bacteriile pot trăi în medii hipotonice (hipoosmotice) datorită unor adaptări: peretele celular reuşeşte să limiteze
cantitatea de apă ce pătrunde în celulă, prezența corpilor de incluziune, existența unor canale sensibile la presiune.

Atunci când concentraţia soluţiilor din exteriorul celulei este mai mare decât în interiorul celulei (medii hipertonice sau
hiperosmotice), celulele bacteriene suferă fenomenul de plasmoliz ă (pe care se bazează conservarea alimentelor prin saramurare).

Bacteriile care se dezvoltă la concentraţii crescute de NaCl (peste 1%), se numesc halofile şi se întâlnesc în apele marine.

Unele specii pot fi slab halofile (se dezvoltă în prezenţa unei concentraţii de 1-6 % NaCl), altele sunt moderat halofile (capabile să
tolereze concentraţii de 6-15 % NaCl) sau halofile extreme (care necesită NaCl în concentraţii de 15-30 % NaCl)

Apa
Reprezintă un factor important fără de care funcţiile biologice ale microorganismelor nu se pot realiza.

În prezenţa apei sunt activate sistemele enzimatice ale celulei bacteriene, fiind posibilă desfăşurarea activităţii metabolice, creşterea
şi multiplicarea acestora.

Diversitatea taxonomică a bacteriilor utilizate în biotehnologii

Procariotele sunt descrise în două lucrări reprezentative:
 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology
 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.
Aplicații biotehnologice au în prezent doar procariotele încadrate în domeniul Bacteria datorită marii lor versatilități metabolice.

Conform Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology domeniul Bacteria este organizat în 18 grupuri numite filumuri.
Din punct de vedere evolutiv filumul Aquiflex este considerat cel mai primitiv, iar Proteobacteria cel mai avansat.

Cele mai numeroase aplicații biotehnologice le au bacteriile din filumurile Proteobacteria, Firmicutes și Actinobacteria

Filumul Proteobacteria
Numit după zeul grec Proteus care își putea schimba înfățișarea.

Cuprinde o mare diversitate de bacterii patogene precum Escherichia , Salmonella, Vibrio și Helicobacter, bacterii libere (unele
fixatoare de azot), precum și bacterii fotosintetizante roșii.

Include bacterii Gram negative, cu membrana externă alcătuită din lipopolizaharide, unele mobile prin glisare sau datorită prezenței
flagelilor, altele imobile.

Cea mai mare parte a membrilor sunt facultativi sau obligatorii anaerobi și heterotrofi.

Proteobacteria cuprinde cinci diviziuni: α (alfa), β (beta), γ (gama), δ (delta) și ε (epsilon) α-proteobacteria
Unele bacterii sunt utilizate în fermentațiile acetice (Acetobacter și Gluconobacter) sau alcoolice (Zymomonas), altele pot interacționa
cu organismele eucariote: plante (Agrobacterium și Rhizobium) și animale (Rickettsia).
Analiza secvenței ARN 16S a demonstrat că tot în această diviziune s-ar putea încadra și strămoșul mitocondriilor din celulele
animale.
Genurile Acetobacter și Gluconobacter cuprind specii de bacterii acetice care se pot dezvolta la un pH acid (sub 5), fiind utilizate
pentru obținerea:

 acidului acetic (oțetului);

 acidului gluconic din glucoză, acidului galactonic din galactoză, acidului arabonic din arabinoză;
 sorbozei din sorbitol, etapă importantă în obținerea acidului ascorbic (vitamina C);
  celulozei pure prin cultivare în condiții staționare.

Genul Zymomonas cuprinde bacili prezenți în extractele vegetale fermentate bogate în zaharuri (vinul de palmier, cidrul din mere,
extractele din sfeclă de zahăr).

Glucidele sunt fermentate pe calea Entner – Doudoroff (și nu Embden -Meyerhof ca la bacteriile enterice), având etanolul ca produs
final în locul unui amestec de metaboliți (lactat, etanol, acetat și alții).

Din anumite puncte de vedere, utilizarea bacteriilor din acest gen prezintă unele avantaje față de levuri în producerea pe scară largă
a etanolului.

Genul Rhizobium este reprezentat prin bacili Gram negativi, flagelați, chemoheterotrofi aerobi, care formează nodozități fixatoare de
azot cu plantele leguminoase prin invadarea perișorilor absorbanți de pe suprafața rădăcinilor.

Importanța practică este reprezentată de capacitatea acestor bacterii de a transforma azotul în amoniac, utilizat de plante pentru
creștere.

Genul Agrobacterium cuprinde bacili care poartă un plasmid de dimensiuni mari (plasmidul Ti) responsabil de transferul unor gene la
plante.

Odată transferat, ADN-ul bacterian se integrează în ADN-ul cromozomial al plantei, inducând sinteza unor hormoni de creștere și
apariția tumorilor caracteristice.

Capacitatea acestor bacterii de a transfera gene în celulele plantelor reprezintă singurul exemplu de transfer natural al materialului
genetic de la procariote la eucariote cunoscut în prezent.
Acest potențial prezintă implicații biotehnologice uriașe:

 îmbogățirea cu anumiți aminoacizi a semințelor de la cereale,

 transferul genelor pentru fixarea azotului către plante,
 inducerea rezistenței plantelor la boli sau ierbicide prin transferul genelor responsabile.

Diviziunea γ-proteobacteria
Include familia bacteriilor enterice (ex. Escherichia coli ), unele specii ale genului Pseudomonas, precum și familia
Acidithiobacillaceae ai căror reprezentanți chemoautotrofi sunt larg răspândiți în natură.
Escherichia coli, localizată în intestinul animalelor superioare, este cea mai intens studiată bacterie.

Poate sintetiza ATP-ul fie prin degradarea oxidativă a substraturilor organice în prezența oxigenului, fie prin fermentația glucidelor în
condiții anaerobe.
Deoarece se poate dezvolta foarte ușor pe medii de cultură simple și mai ales pentru că este foarte bine cunoscută din punct de
vedere genetic, biochimic și fiziologic, E. coli este preferată pentru obținerea de proteine prin recombinare genetică: insulina și
hormonul de creștere.
Genul Pseudomonas cuprinde specii ca P, aeruginosa, P. putida, P. fluorescens și P. syringae.

Produc compuși fluorescenți de culoare verde-gălbuie, utilizează ca sursă de energie un număr mare de compuși organici (în unele
cazuri peste o sută), larga răspândire în natură.

Pot degrada compuși precum camfor, toluen, octan sau substanțe xenobiotice precum compușii aromatici halogenați, fiind folosite în
decontaminarea zonelor poluate cu substanțe toxice.
Pseudomonas syringae:

Membrana externă conține un complex de proteine capabil să producă cristale de gheață și să înghețe suprafața foliară la
temperaturi apropiate de 0° C, deteriorând-o și favorizând invadarea țesuturilor subiacente.
Prin modificare genetică s- au obținut tulpini care pot produce cristale de gheață la temperaturi mai ridicate, acestea fiind folosite
în prezent pentru obținerea zăpezii artificiale pe pârtiile de schi, obținându-se o reducere semnificativă a costurilor.
Speciile genului Xanthomonas (X. campestris) sunt folosite pentru obținerea polizaharidelor de tipul xantanului utilizat în industria
alimentară precum și pentru recuperarea cu randamente superioare a țițeiului.

Genul Acidithiobacillus cuprinde bacili aerobi, acidofili (pH optim < 4) care își obțin energia prin oxidarea compușilor reduși cu sulf
sau fier (II).

Acidithiobacillus thiooxidans (anterior Thiobacillus thiooxidans) și Acidithiobacillus ferrooxidans (anterior Thiobacillus ferrooxidans)
sunt larg folosite în bio-minerit.
 Filumul Firmicutes
Cuprinde bacterii Gram pozitive, cu un conținut GC (guanină – citozină) mic (sub 50 %)
Numeroase specii au aplicații biotehnologice, fiind sporogene sau nesporogene, cea mai mare parte având perete celular fără
membrană externă.

Filumul este împărțit în trei clase:

 Bacilli,
 Clostridia
 Erysipelotrichia.
Clasa Bacilli (grupul Lactobacillus-Staphylococcus-Bacillus) grupează bacterii facultativ anaerobe, care se dezvoltă atât în absența
cât și în prezența oxigenului.
Bacteriile lactice fermentează glucidele indiferent de prezența sau absența oxigenului, în timp ce bacteriile din genurile
Staphylococcus și Bacillus realizează respirația în prezența oxigenului și fermentația în absența sa.
Genurile Lactobacillus, Pediococcus și Leuconostoc formează grupul bacteriilor lactice care obțin energia prin fermentația glucidelor
simple (glucoză).
În funcție de produșii finali, bacteriile lactice se clasifică în:

 homofermentative – produc doar acidul lactic (Lactobacillus, Pediococcus);

 heterofermentative – la finele fermentației rezultă un amestec de produși: acid lactic, etanol și dioxid de carbon (Leuconostoc).

Utilizarea la nivel industrial a bacteriilor lactice se bazează pe o serie de caracteristici:

 capacitatea de a fermenta rapid și complet materii prime ieftine;

 necesitățile minime legate de sursa de carbon;
 produc cu randamente ridicate izomerul optic dorit al acidului lactic;
 capacitatea de a crește în condiții de pH scăzut și temperaturi ridicate;
 abilitatea de a produce cantități mici de biomasă precum și cantități neglijabile de produși secundari.
Numeroase tulpini sunt utilizate pentru obținerea culturilor starter folosite pentru fabricarea brânzeturilor și produselor lactate
fermentate (unt, lapte bătut, iaurt).
Streptococcus cremoris utilizată pentru obținerea unor sortimente de brânzeturi (Gouda, Cheddar, Camembert).
Aplicațiile biotehnologice ale speciilor din genul Bacillus sunt legate de capacitatea de a produce exo-enzime hidrolitice care pot
degrada proteine (utilizate pentru obținerea detergenților), acizi nucleici, lipide, polizaharide (folosite pentru scindarea amidonului).

Unele specii (Bacillus thuringiensis) pot produce insecticide biologice, iar altele antibiotice obținute în cantități mari la nivel industrial:
bacitracin (Bacillus subtilis) sau polimixina (Bacillus polymyxa).
Clostridium acetobutylicum - utilizarea biotehnologică în scopul obținerii unor produși ca etanol, acetil-metil-carbinol,butanol și
acetonă.
Filumul Actinobacteria
Cuprinde bacterii Gram pozitive având ADN-ul cu un conținut GC mai mare de 50%.

Cea mai mare se găsesc în sol, sunt aerobe, nu prezintă flageli și sunt reprezentate morfologic prin bacili, care uneori se alungesc și
se divid neregulat formând filamente ramificate.

Genul Cellulomonas a fost intens studiat datorită capacității de degradare a celulozei.

Enzimele implicate în această cale metabolică ar putea permite utilizarea celulozei (cel mai răspândit poliglucid în natură) ca materie
primă pentru producerea alcoolului și proteinelor.
Corynebacterium glutamicum este folosită pentru producerea industrială a acidului glutamic.

Mecanismele simple de reglare pentru căile de biosinteză permit utilizarea acestei specii și pentru producerea industrială a altor
aminoacizi.

Genul Streptomyces cuprinde bacterii filamentoase (actinomicete) care au ca principală caracteristică morfologică prezența hifelor
ramificate care formează micelii.

Hifele aeriene (sporofori) poartă spori diferiți de endosporii celorlalte bacterii și formează un miceliu aerian.
Deși au fost inițial încadrate în grupul fungilor datorită prezenței miceliilor, actinomicetele se deosebesc de fungi prin organizarea
procariotă, prin prezența peptidoglicanului în peretele celular și prin dimensiunile mai mici ale hifelor (1-1,5 µ diametru).
Actinomicetele reprezintă cel mai important grup de bacterii din punct de vedere biotehnologic.

Sunt capabile să producă diferite tipuri de metaboliți secundari biologic activi:

 antibiotice (streptomicină, tetraciclină, nistatină cloramfenicol, eritromicină, gentamicină)

 enzime care degradează polimeri de tipul polizaharidelor (amidon, pectine, chitină) sau proteine.

Streptomyces griseus – streptomicină (Waksman, 1944)

Streptomyces aureofaciens – tetraciclină, clortetraciclină

Streptomyces rimosus – oxitetraciclină

Streptomyces venezuelae – cloramfenicol

Streptomyces eritreus – eritromicină

Streptomyces noursei – nistatină