MECANISMELE GENETICE CARE STAU LA BAZA GENERARIL DIVERSITATH IMUNOGLOBULINELOR Receptorul pentru antigen al limfocitului B este molecula de imunoglobulina (Ig). Studiile enzimatice efectuate in anii °60 au condus la elucidarea structurii sale, format din doud lanturi grele (H — de la Heavy) identice si doua lanturi usoare identice (L~ de la Light). inca de pe atunci devenise evident ci cele doud capete ale acestei glicoproteine poseda functii diferite. Recunoasterea antigenului este efectuatA cu ajutorul capatului amino-terminal, in timp ce capitul carboxi-terminal este implicat in ceea ce denumim functii “biologice” Lanturile au fost impartite ca atare intr-o porfiune variabild (N-terminala) si 0 portiune constanta (C-terminala). Fiecare molecula de imunoglobulind poseda dou situsuri identice de legare a antigenului, iar Ia formarea fiecdruia participa atdt partea variabila a lantului L cat si partea variabili a lanfului H. Astazi stim c& portiunea din imunoglobulind dedicat legirii antigenului, numita paratop, este extrem de redusi ca dimensiuni, find aleatuita din doar cijiva aminoacizi, localizati in asa numitele regiuni hipervariabile. Nici antigenul mu participa Ta legare in intregul su, ci cu o porfiune corespunzatoare din punct de vedere dimensional, numiti epitop. Adancirea studiilor de structura a relevat organizarea moleculei in domenii “globulare”, formate din cite doua straturi opuse, unite prin intermediul unei legaturi disulfidice intra-lang si a unei legituri hidrofobe. Fiecare dintre straturi este format dintr-un numar de foi f pliate, antiparalele, unite prin bucle de conexiune. Totodata, analiza comparativa a unui numér mare de lanturi a evidentiat cd diferenjele dintre acestea nu se regisesc dispuse aleator in structura primara a proteinei ci sunt restranse la nivelul catorva portiuni inguste, numite regiur hipervariabile, La nivelul domeniului globular, regiunile hipervariabile se regasesc in regiunea buclelor de conexiune dintre foile B pliate' Fiecare limfocit B poseda pe suprafata sa imunoglobuline cu 0 specificitate unica, astfel ca fiecare limfocit B este capabil si raspunda unui epitop unic. Acest aspect a fost infeles si acceptat odati cu teoria selecfiei clonale. Antigenele pitrunse in organism vor se/ecta acele clone de limfocite care au specificititile potrivite, le vor aetiva gi vor induce proliferarea lor. © parte din aceste limfocite se vor diferentia in plasmocite, celule care mu mai exprima imunoglobuline pe suprafafai deoarece sintetizeazi lanturi grele mai scurte si sunt astfel incapabile de a mai insera aceste molecule in membrana. in schimb, plasmocitele vor secreta imunoglobulincle, iar aceasté variant solubild a receptorului pentru antigen al limfocitului B capita numele de anticorp. Anticorpii sunt si ei capabili si recunoasca antigenele in mod specific, conducand la formarea de complexe antigen-anticorp (complexe imune). Imunoglobulinele reprezintd componentul central al receptorului pentru antigen al limfocitului B (BCR ~ B cell recepior), ciruia i se alitura moleculele constante Iga si Ig, cu rol in transmiterea intracelulara a semnalului interceptat de receptor. Se estimeaza c& sistemul imun al mamiferelor este capabil s@ sintetizeze mai mult de 0!” imunoglobuline (anticorpi) diferite”, un numéar imens de molecule, care depageste cu mult numirul de gene pe care genomul uman il poate pune la dispozitie. Se pune firesc intrebarea: cum este posibila sinteza numarului imens de imunoglobuline. O prima teorie (germ-line theory ~ teoria liniei germinale) estima c& doar aproximativ 15% dintre genele unui genom haploid sunt alocate codificarii imunoglobulinelor, fara si poata oferi insi nici o explicatie pentru modalitatea de a forma, cu un numar limitat de gene, un numér atét de mare de " Existenjaregiunilorhipervarable a fost pus in evident de ctre Wu i Kabat tn diapramele care le posrttnumete. Analia regiunilor ‘rail a elevate din punct de vodere al situ primate, diereatele dire anus se reises la nivel unor porn inguste, demamite (CDR (complementarity determining region, i inp cs, ia afaraacestor (eguni cade), freee dntrelanjur nu sun acs pe dear ls fel de marete Tolan spevitiitiilrdiferite pe care le poste produce sister imon este cunoscu sub mumele de Repertori Imunologt.structuri diferite, Alte teorii ulterioare (somatic variation theories — teoriile variatiei somatice) susfineau cf, intr-adevar, din totalul genelor din genom, doar un numa limitat erau dedicate imunoglobulinelor, dar ci, prin recombindri si mutatii, acestea erau capabile si duc la diversitate. Din picate insd, nici aceste teorii nu au reusit sa raspunda la intrebarea ridicata de studiile structurale, care au evidenfiat ci moleculele de anticorpi manifesti nu numai diversitate la capatul N-terminal dar si constangé catre capatul C-terminal. Astfel, a aparut pentru prima oari (Dreyer si Benett, 1965) ideea ci exist gene separate pentru regiunea variabild $i respectiv regiunea constantd, iat aceste gene reusese sa se uneascd la nivelul ADN-ului pentru a forma o secvenfi continua. Mai mult decat atit, intuitia celor doi se apropie foarte mult de realitatea cunoscuta astizi si anume cA pentru partea variabila exist’ disponibile sute de gene, in timp ce pentru partea constanti ¢ necesari doar una, ‘Au trebuit si treacd ins mai bine de 10 ani pentru ca progresul tehnologic sa poata evidentia (Susumu Tonegawa, 1976) existenfa unor gene separate pentru regiunea variabila si constant, ca si rearanjarea genelor in cursul diferentierii limfocitelor B. Pe mésuri ce a devenit posibili clonarea si secventializarea genelor, s-a dovedit cd procesul este si mai complex. 1. FORMAREA LANTURILOR USOARE_ Imunoglobulinele pot utiliza dou’ tipuri de lanturi L, denumite kappa (k) si respectiv lambda (A) in functie de partea constant, Partea constant’ si partea variabila a lanturilor usoare sunt aproximativ egale din punct de vedere al dimensiunii. © moleculdi de imunoglobulina poate folosi fie lanturi k, fie lanturi 2. (dar nu ambele simuttan), far ca aceasta si afecteze in vreun fel functionalitatea receptorului sau a anticorpului.. Fiecare dintre ccle dousi lanturi usoare este codificat de gene distincte, situate pe cromosomi diferigi: setul de gene care codificd lantul k se giseste situat pe cromosomul 2 iar genele lantului usor A se gasesc situate pe cromosomul 22. Prima optiune a limfocitului B este reprezentata intotdeauna de lantul ugor k. Partea variabili a lantului k (incepind de la capatul N-terminal) are o lungime de 108 aminoacizi si este codificati de dou segmente genice distincte: segmentul genic V (variabila) codifica primii 95 de aminoacizi si segmentul genic J (joining — unire) codified aminoacizii 96-108. + Analiza genici a relevat ca in genomul celulelor germinale umane exist aproximativ 75 de segmente genice V, diferite, fiecare dintre ele putand codifica pentru un segment initial distinct al domeniului variabil k. Aceste gene variabile sunt aranjate in mod liniar, separate prin introni i precedate (in plus fata de promotori) de o seeventa exonica denumita Leader (conduciitoare), situata in aval fata de promotor si care va codifiea un scurt peptid care are rolul de a introduce si ghida lanful ce se sintetizeaza in reticulul endoplasmatic. Acest peptid leader va fi insa clivat de la nivelul lantului sintetizat, inainte sa aiba loc asamblarea anjurilor usoare si grele. + Lao oarecare distan(a de grupul genelor V, spre capatul telomeric al ADN-ului, se gaseste grupul celor 6 segmente genice i, dupa care, separata printr-un intron foarte lung, se wiseste singura gen pentru regiunea constanta Cj, care codificd intreaga portiune constant a lantului k Formarea langului k incepe prin aducerea unui segment genic V, $i a unui segment genic J, in imediata vecinatate unul fata de celalalt, fenomen numit rearanjare genici. Genele sunt rearanjate si unite datorité existenfei la cele doud capete a unor secvente intronice denumite RSS (Recombination Signal Sequences — secvenfe semnal de recombinare). Procesul este mediat de enzimele codificate de genele RAG-I si RAG-2 (recombination activation genes ~ gene de activare a recombinarii). Aceste enzime actioneaza exclusiv la nivelul limfocitelor, iar prezenfa lor simultana este indispensabila pentru buna functionare a procesului.(a) Nucleotide sequence of RSSs CACAG1TG~[23 DpP-ACAAAAACC GGTTTTTGT4R2 bpp CACTGTG GTGTCAC423 bpETGTTTTTGG = CCAAAAACA412 bp -GTGACAG Heptamer Nonamer Nonamer Heptamer ‘Tworturn RSS ‘One-turn RSS in cursul procesului de rearanjare, cele doua segmente genice V si J, alese in mod complet aleatoriu, vor fi unite, dand nastere unei seevente genice continue; totodatd, intregul material genetic care se gisea intre cele doud gene va fi excizat si indepartat. Astfel, ADN-ul limfocitului B care a suferit o rearanjare a genelor lantului k va confine urmatoarele regiuni, incepand dinspre centromer ciitre telomer: toate segmentele genice Vi de dinaintea celei selectate, promotor-ul si exonul Leader (L) al segmentului genic Vj. ales, un intron, segmentul genic continu Vidk urmat de segmentele genice J, neselectate, un intron si gena pentru regiunea constant. Secventa rearanjata a lantului usor este apoi transcrisd de catre 0 ARN-polimeraza, incepand de la segmentul L pand la semnalul stop de dupa gena pentru regiunea constanta, generiind astfel un transcript ARN primar. Urmeazi apoi un proces de tdiere (matisare) a ARNm precursor, prin care sunt indepartate seeventele necodante si un proces de poliadenilare a genei constante, Rezulta astfel ARNm matur care va pardsi nucleul gi se va lega ulterior la nivelul ribosomilor. Aici are loc translafia gi proteina ce se sintetizeazi va fi dirijatd, de catre segmentul Leader de la nivelul capatului N-terminal, in interiorul Iumenului reticulului endoplasmatic rugos (RER). in RER, secventa Leader este indepartat’ iar lanjul usor va putea, abia acum, si se asGenele lanfului usor 2 se gisesc situate Ia om pe cromosomul 22. Locusul % uman confine aproximativ 75 de segmente genice V;, si 4 segmente genice J, despre care se stie c& sunt functionale (pe Kanga altele nefuncjionale, numite pseudogene). Organizarea locusului 2 este diferita de cea pentru k, fiecare segment genic J, fiind asociat cu céte un segment genic C, distinct. Sinteza lanfului 2. este similara in principiu cu cea a lanqului k: printr-o rearanjare aleatorie, mediata de RAGI si RAG2, un segment genic V;, (care codificd primii 97 de aminoacizi) este unit cu o un segment genic J, (care codificd urmitorii 13 aminoacizi ai regiunii variabile), dar ADN-ul rearanjat va utiliza mai departe acea gena C, asociati segmentului genic J ales. 1g! Gormiine DNA wid Git, ies Primary RNA Transcript Vat oat a mRNA aici — Ae i Protein 2, FORMAREA LANTURILOR GRELE, Genele lanfului greu (H) sunt situate la om situate pe cromosomul 14. Organizarea acestor gene este mai complexa decat cea a genelor ce codificd lanjurile usoare (L) deoarece existd un segment genic suplimentar D, care codifica 0 porfiune a regiunii variabile. Astfel, segmentul genic Vj (cu o lungime de aprox. 300 baze azotate) codificd primi 94 de aminoacizi segmentul genic Jj; (cu 0 lungime de aprox. 30-40 de baze azotate) secventa curprinsa intre aminoacizii 98-113; secventa intermediara, extrem de scurti (95-97), este codificat de un segment genic denumit Dy (Diversitate) (cu 0 lungime de aprox. 9-23 de baze azotate). Prin secvenfializarea direct a genelor de pe cromosomul 14, astazi stim cd existi, incepand de la telomer spre centromer, un grup de 130 de segmente genice Vi, urmate de un grup de 27 de segmente genice Dx, apoi, la 0 oarecare distant, 6 segmente genice Jy functionale.erect ey te pra Soe : © : 1% inte pins cette tog ge apa. alta caracteristicd ce particularizeaza genele lanturilor grele este prezenta in genomul celulelor germinale a unor gene multiple ce codificd regiunea constanra. Partea constant a lanjului greu este responsabila pentru conferirea asa numitelor fiuncfii “biologice” ale anticorpilor, iar conservarea acestor importante functii efectorii este realizata prin mentinerea ‘unui numar limitat de gene pentru regiunea constant. Human igh Locus De OWT et HK SH Haman ig/Locus vat t BBV seqmints D sega Spre deosebire de partea constanté a lanturilor usoare, regiunea situata spre capatul C-terminal a lanurilor grele este cea care hotaraste incadrarea intregii imunoglobuline intr-una din cele 5 clase (isotip)’. Grupul genelor Cy (fiecare dintre ele flancate de introni) este separat de genele Ju printr-un intron lung. In plus, fiecare gen Cy este format din mai multi exoni si introni. Fiecare dintre exoni codificd cate un domeniu distinct al regiunii constante. Genele regiunii > parca constant lanl eeu, cscs de oanumith gend constant, pete incadearea neg imunoglobulne Tntrana din ele S clase (Gsotipun): A.D. EG, M. Deft exit 9 part dstinte de lan gel, cea ce permite distneia unor elas i subelase: IgG, IgG, eG, Ta eA, IgA, HEM. IgD, IgEconstante sunt aranjate intr-o anumiti ordine, iar acest aranjament secvential mu este intémplitor, fiind in directa legatura cu ordinea exprimarii claselor de imunoglobuline in cursul diferensierii limfocitului B si a raspunsului inifial in IgM la contactul cu un antigen. Pentru a genera o gend transcriptibild pentru lantul greu sunt necesare rearanjaii distinete. In aceeasi manieri intimplitoare descrisd anterior, un segment genic Dy oarecare este adus in imediata proximitate a unui segment genic Jy. Langa segmentul DiJy care rezulta astfel este adusd unul din segmentele genice Vy. Rearanjarile de la nivelul ADN-ului cromosomului 14 vor conduce la urmatoarea suecesiune, dinspre telomer ctre centromer: segmentele genice Vi neselectate, promotor-ul segmentului genic Vy selectat, exonul Leader, un scurt intron, segmentul continuu VDJ, un alt intron, segmentele genice Jy neselectate, un intron lung si intreaga serie de gene constante. Odatd rearanjarile terminate, 0 ARN polimeraza se va lega la promotor si va transcrie intreaga secventd (inclusiv intronii). in acest proces de transcriptie sunt antrenate si primele doud gene constante, care sunt Cy si Cs, Rezulta astfel un transcript ARN primar care va urma un proces de matisare si poliadenilare diferentiati. Matisarea ARN- ului va conduce in acest caz nu numai la eliminarea intronilor ci gi la separarea genelor Cy $i C5, Daca intr-o prima etapa, segmentul VDJ va fuziona cu C, si astfel primul lant greu sintetizat de limfocitul B va fi un lant greu 4 (iar prima imunoglobulina produsa va fi IgM), in etapa imediat urmatoare, segmentul VDJ se va asocia, intt-o manieri cvasialternativa, att cu gena C, cat si cu gena Cs. Consecinfa acestui proces particular va fi exprimarea simultand, pe suprafaja aceleiasi celule B, atat de IgM, cat si de IgD, avand ins aceeasi specificitate, determinata de aceeasi combinatie distinct VDJ. 3. MECANISMUL REARANJARILOR GENELOR CARE CODIFICA PENTRU REGIUNEA VARIABILA Rearanjarile genelor decurg asa cum au fost descrise mai sus, dar se pot pune firese doua intrebari: cum se face oare cd genele sunt asamblate in mod corect, intotdeauna 0 gen Vi este asociaté cu o gen’ Dy simu direct cu gena Jy? Cum se face ci asocierea genelor se produce prin unirea segmentelor genice in ordinea corecta 5*-3" si de ce nu © posibila rearanjarea a dou gene din acelasi grup (V, D sau J)? infelegerea mecanismului a aparut odata cu identificarea a dou secvente conservate la nivelul ADN-ului din genomul celulelor germinale, fiecare dintre ele constind dintr-un heptamer palindromic si un nonamer bogat in Asi T, separate de cdtre o secventa neconservata, formata fie din 12, fie din 23 de perechi de baze azotate. Lungimea acestor “distantieri” corespunde fie unei spire, fie a doua spire complete a helix-ului ADN. Aceste seevente sunt intronice gi se gisesc dupa fiecare segment genic V, inaintea fiecdrui segment genic J si la ambele capete ale segmentelor genice D. Intronii descrisi functioneaza ca finte de recunoastere — secvenfe semnal ~ pentru enzimele responsabile pentru rearanjarea genelor si sunt denumite RSS (Recombination Signal Sequence). Rearanjarea genelor este rezultatul actiunii mai multor enzime, denumite generic ‘recombinaze”. Primele astfel de recombinaze responsabile pentru procesele care au loc in limfocite au fost descrise in 1990: genele RAG1 si RAG2 (Recombination Activating Gene) codified proteine care, doar dac& acfioneaz impreuna, sunt capabile si induc’ rearanjarea VDJ sau VI" Rearanjirile genelor V(D)J — destinate parjilor variabile a imunoglobulinelor — pot fi “productive” sau “non-productive”. O rearanjare productive este aceea care va conduce la 0 seeventa VJ sau VDJ care si poatd fi transcrisi si apoi translata in intregime. O rearanjare neproductiva decaleazi cadrul de lectura generand codoni stop care vor bloca translatia iar * Recombinazele codices de cite RAGI si RAG, stu de ens TAT (Teeminaldeoxinucleidil Transferzs) sunt singurele care se ssese doa in limfocitecelulele vor fi eliminate prin apoptoza. Desi se considera ca tdierea ADN-ului se face in mod precis la jonctiunea dintre exon si intronul RSS, procesul ulterior de fuziune a segmentelor genice este adesea imperfect, Aceasta imprecizie reprezinti 0 sabie cu doua taisuri. Pe de o parte, confera un imens avantaj limfocitelor, conducdnd la generarea unui surplus de diversitate, dar, pe de alta parte, poate conduce la rearanjari neproductive Limfocitele sunt celule somatice diploide si contin deci atat cromosomi materi cat si paterni. Toate genele implicate in codificarea lanturilor pentru imunoglobuline (ca si cele pentru TCR ~T cell receptor, receptorul pentru antigen al limfocitului T) sunt gene dominante, Cu toate acestea, limfocitelor nu li se permite decit utilizarea alelelor de pe un singur cromosom. Fenomenul (unic limfocitelor), a fost denumit “excluzie alelicd”. Singura rearanjare care are oc simultan pe ambii cromosomi este cea dintre genele Dy, si Jy, toate celelalte desfagurandu- se fie pe un cromosom, fie pe cel pereche. in acest fel, fiecare limfocit va retine doar cate 0 rearanjare productivé VDI si respectiv VJ, astfel incat vor fi produse lanturi usoare si grele avand 0 parte variabila identicd. Asamblarea lor va conduce in final la obfinerea de receptori pentru antigen cu o specificitate unica. 4. FACTORI CARE CONTRIBUIE LA GENERAREA DIVERSITATIL IMUNOGLOBULINELOR Privind retrospectiv catre primele doua teorii emise cu privire la diversitatea receptorilor pentru antigen, teoria liniei germinale si teoria somatic’, constatim cA fiecare dintre cle confine elemente validate ulterior experimental. Prezentim in continuare 0 sintezi a mecanismelor care determina, in ultima instanf@, obfinerea acestui numar remarcabil de receptori pentru antigene: (1) in primul rind trebuie remarcat cA, spre deosebire de oricare alte proteine sintetizate in organism, codificarea lanturilor imunoglobulinelor este asigurata de mai multe gene, care, ulterior, vor fi asamblate intr-o secvenfa contigua. (2) Fiecare dintre aceste gene este aleas& dintr-un rezervor genic alcatuit din mai multe gene, perfect individualizate. Cel mai bine reprezentat, din acest punct de vedere, este grupul segmentelor genice V, atit cel destinat lanturilor grele cat si usoare. (3) Mecanismul cel mai important, care creeaza el insusi diversitate si ofera in plus posibilitatea interventiei unor mecanisme suplimentare ulterioare, este reprezentat de rearanjarile aleatorii, guvernate de recombinaze. Faptul cA aceste reasortiri genice se produc intr-o 0 maniera intamplatoare, fird s existe reguli care sa impund combinatii particulare, las practic posibilitatea formarii oricdrei combinatii de gene’. (4) Paratopul imunoglobulinelor este format din combinatia partii variabile a unui lany grew sia par(ii variabile a unui lanj usor. Asocierea dintre un lant greu si unul usor este de asemenea aleaiorie; intr-o celula B oarecare, intamplarea poate conduce Ia sinteza unor lanturi H_ i L oarecare, iar acestea, odati asamblate, vor eonduce la 0 combinatie particulara’. (5) Imprecizia unirii genelor conduce la ceea ce a fost denumita «diversitate jonctionala” sau “flexibilitate jonctionala”. Asa cum menfionam anterior, taierea dintre RSS si secventa codanta pare si fie precisa, in schimb, unirea secvenjelor codante este, cel mai adesea, 5 Un ealeulsmplu ne ast fin cazul lange gzele, dac orice genase poate combing cu orice gens J si spot ex orice gen V, numa Hoe a Cleavage of haepin 2 ‘generates sites for the ~ addition of Pauucleotides Repair enzymes add ‘complementary nucleotides Se So 5.2 In ultimele stadii ale rearanjarii VDJ, odata taiat acul de par, cele doua catene ale ADN- ului sunt taiate de catre exonucleaze inainte de a fi reparate de catre ligaze. Se intimpla frecvent ca exonucleazele sa taie chiar din seeventele codante. Dupa ce ADN-ul a fost reparat, secventa genelor rearanjate difera de cea din germline”. 53 Regiunea N de adifie este creati cu ajutorul unei enzime numite TAT (terminal deoxinucleotidil transferaze). Rolul TaT este acela de a adauga nucleotide la capetele genei D in cursul unirii acesteia la gena J sau la gena V. Numarul maxim de baze azotate pe care enzima le poate alipi genei D este de 15, dar numérul de nucleotide transferat este aleator gi astfel se formeaza seevente complet diferite. (b) Namucleotide addition Hairpin my CFE BQ Carl Cleavage of hairpin 7 swencrates sites forthe \ addition of Pnucleotides SS ol TAP adds Nucleotides Repair enzymes add + complementary nucleotides Se ea AG CTIA TATUCeea ce este important de subliniat in acest moment este c& diversitatea jonctionalé, aditia in regiunea P si in regiunea N si delefiile conduc la aparitia unor seevente genice complet noi, care nu existau initial in genomul celulelor germinale. Aceste mecanisme sunt cele care reusesc A ridice diversitatea Ig-nelor pana la ciffa avansat& anterior, de aproximativ 10'° specificitati diferite. (6) Unalt mecanism implicat in generarea diversitiii este constituit de mutajiile somatice ce se produc intimplitor, printr-un mecanism inc& neelucidat, la nivelul genelor rearanjate (VJ sau VDJ). Un clement deosebit este reprezentat de frecventa crescutd (hipermutatii) cu care aceste mutafii apar, de cel pufin o suti de mii de ori mai inalté decat frecventa cu care apar mutafiile spontane la nivelul oricdtor alte gene’. Acest fenomen este caracteristic limfocitelor B mature care raspund fata de un antigen si are potentialul de a genera maturafie de afinitate. ASOCIEREA GENEI CONSTANTE $I COMUTAREA DE CLASA Organizarea genelor ce codificd partea constant’ a lanjurilor este diferita de cea responsabila pentru partea variabila. In cazul lanfurilor usoare, exist o singura gen& Cy si mai multe gene ©, dar partea constanta a lanfurilor usoare nu influenfeazi nici paratopul si nici clasa imunoglobulinei respective. De mult mai mare importanta este insi partea constanti a lanjurilor grele, responsabila pentru determinarea isotipului si a functiilor numite “biologice” ale anticorpilor. Genele pentru regiunile constante sunt mult mai lungi decét cele pentru regiunile variabile, fiind aledtuite dintr-o serie de exoni distincti ce codifica fiecare in parte domeniile extracelulare, regiunea “balama” (acolo unde este cazul), _domeniul ‘transmembranar si coada intracitoplasmatica. O caracteristicd a genelor Cy este prezenfa unor gene multiple in genomul celulelor germinale, corespunzatoare fiecarei clase si subclase de imunoglobuline, Ultima gen Jy este separata de prima gen Cy printr-un intron foarte lung. in plus, fiecare gena Cy este precedata nu numai de promotor, dar si de un amplificator al transcriptiei (enhancer) precum si de cate © secvent& intronicd denumiti “switch” (comutare), caracteristica fiecdrei gene in parte; 0 exceptie notabili este reprezentata de gena Cy, lipsita de secventa de comutare. Secventele de comutare sunt destul de lungi, fiind alcdtuite din mai multe motive repetitive, Rolul acestor introni este acela de a permite asocierea la acest nivel a unor recombinaze care sunt diferite pentru fiecare clasa in parte in timpul diferenfierii limfocitului B, genele Cy si Cs, cele mai apropiate de genele J, sunt primele transcrise. Ca un element particular, ambele gene sunt transcrise simultan, probabil tocmai datorita absenfei secvenjei de comutare din fata genei Cs, precum si a distantei de numai 5 kb dintre cele doud gene. Astfel, transcriptul primar, cu o lungime de aproximativ 15 kb, conjine genele VDIC,Cs, Dintre cele patru situsuri de poliadenilare, primele doua sunt asociate genei C,, iar celelalte dowd genei Cs. Dac& transcriptul primar este clivat si poliadenilarea are loc la nivelul situsului 2, atunci ARN-ul mesager va confine intreaga secventa a genei C, si va rezulta astfel forma membranard a lantului. Daca insa poliadenilarea se face la nivelul situsului 4, atunci, prin tdierea ARN-ului, secventa C,, va fi inlaturata si se va ajunge la ARNm care codificd pentru forma membranara a lanfului Cs. Acest proces se produce simultan, astfel c& seeventa VDJ are posibilitatea si se unease’, de 0 maniera alternativa si cu gena Cy si cu gena Cs. in consecinta, limfocitele B mature dar naive vor * Se pute ed enumite motive de nucleotide si seevene palinromice de la nvelu gener reuranjate (VJ sau VDJ) sunt tn mod particular suscepti in fate acest mecensm, in infoctele B mature find afectatepreferengalacelesecveae care eodifie regiunilehipervarabile {CDE In mod normal hipermuafile somatie at loc in cena germinal (dec in organelelimfaide secundse), ca 0 conseing a expuneri Ta antigen; acee ifocite care au receptorul cu ea mal mare aintate pentru anigenulrespestiv vor fi selecate in mod preferential, vor spre tot dinte acestea se vor dferenfia si ealulle cu memorie. Proces a fost denumit"marurape de afntaeexprima simultan pe suprafaa atat IgM cét si IgD, dar cu aceeasi specificitate, determinata de clitre aceeasi combinatie VDJ. Dupa stimularca antigenic insa, expresia [gD este pierdutd, iar IgM tinde sa fie inlocuité, in cele mai multe cazuri, cu un alt isotip, fenomen denumit “comutare de clas”. Astfel, gena Cy. va fi inlocuitd cu o alta, situatd spre capatul 3” al ADN-ului. Trebuie subliniat ins& ca acest proces are loc in timpul vietii adulte a limfocitului B si noi rearanjari genice nu mai sunt posibile; odat ce limfocitul a ajuns la o anumiti reasortare productiva, aceasta va deveni permanent pentru celula in cauz. Astfel, comutarea de clas nu influenteaz specificitatea imunoglobulinei respective. De asemenea, trebuie precizat c4 procesul de comutare de clasi are loc in contextul unui rspuns imun fat de un antigen T-dependent, cu alte cuvinte, un raspuns imun in care sunt implicate si limfocitele T helper, prin intermediul anumitor seturi de citokine si molecule de suprafata®, | os & CeO Sa Sn See Sa * Raspunsl fal de antigenele T independent, in abseta intervene limoitelorT helper, mu conduce nic a memorieimunotoged inci Ia comutare de cass6, SECRETIA ANTICORPILOR in cazul cand limfocitul B s-a diferenfiat in plasmocit, sinteza imunoglobulinelor de suprafata este inlocuité de cea de anticorpi. Diferenfa nu se regdseste la partea variabila (in mod esential, specificitatea anticorpilor este aceeasi cu a imunoglobulinelor de pe suprafaja limfocitelor B stimulate inifial) ci la nivelul secventei situata spre capaitul C-terminal al partii constante, Posibilitatea sintezei unei forme sau a alteia se datoreaza existen{ei unor exoni suplimentari, denumisi MI si M2, localizati in aval de exonul responsabil pentru ultimul domeniu extracelular constant. Exonul MI codificd porfiunea transmembranard, iar M2 portiunea intracitoplasmaticd. Daca poliadenilarea se produce la nivelul situsului 1 de la hivelul transcriptului primar, atunci exonii M1 si M2 sunt pierduti gi se va ajunge la forma secretata a langului greu respectiv. DNA Cut Cn2 ONS Gude MY M2 Polyarsenylation Polyaden ylation ‘3 of ME ‘Fof Se Primary tanseript Cut Cuz Oud Oude MY M2 mem | RNA eplising Primary tanseript s MIM2 . Chi Gye cus Gaee C eee i [rvs sotcna Membrane-bound IgM Se * pv a TCs mmANA or. Rayna | ‘Secreted IgM in coneluzie, formarea imunoglobulinelor este consecinja unui proces genetic absolut distinct, unic receptorilor pentru antigene, cu o muljime de excepfii de la regula. Astfel, un singur peptid va trebui codificat de mai multe gene, iat elementul principal al intregului proces este reprezentat de rearanjarea la intimplare a mai multor gene destinate regiunii variabile. in plus, genele care codificd pentru regiunile constante sunt fuzionate doar la nivel de ARN, ceca ce va crea premizele asocieri alternative ale genelor Cu si C8, intr-o prima instant si apoi ale comutarii de clasa. in ciuda faptului cd genele implicate in formarea imunoglobulinelor sunt dominante, datorita excluziei alelice vor putea fi exprimate doar alele de pe un cromosom sau altul.MECANISMELE GENETICE CARE STAU LA BAZA GENERARIL DIVERSITATI TCR intre imunoglobuline si receptorul pentru antigen al celulei T (TCR) exist multe asemanéri din punet de vedere structural. Domeniile extracelulare care alcdtuiesc cele doug lanturi sunt, ca si la Tg, constante si variable, intreaga portiune extracelulara a TCR seamand cu fragmentul Fab al anticorpilor’,iar componenta dedicata recunoasterii este asociaté cu molecula constant’ CD3 (analoga Iga. si IgB, cu rol in transmiterea intracelulard a semnalului). Mecanismul de formare a receptorului pentru antigen al limfocitelor T prezinta foarte multe aspecte extrem de asemfintoare cu cel al formarii imunoglobulinelor, implicand, in esenfi, rearanjiti genice V(D)I si diversitate jonctionala. Analiza lanturilor TCR demonstreazi de asemenea existenfa regiunilor hipervariabile, responsabile pentru formarea efectiva a situsului de interacfiune al receptorului. Din aceste motive, am ales s ne concentrim in special asupra diferentelor de formare a celor dou categorii de receptori. O prima deosebire notabila este reprezentata de existenfa a doud tipuri de TCR: TCR 1 (78) si TCR 2 (a). Indiferent de tipul de TCR, acesta este asociat la nivel transmembranar, prin legaturi electrostatice, cu aceeasi molecula CD3. Exist 4 familii de gene la nivelul ADN-ului din genomul celulelor germinale, dedicate céte unui anumit tip de lant. Genele care codifica lanturile c si 8 sunt grupate pe cromosomul 14 (in alt& regiune decat genele pentru lantul greu al imunoglobulinelor), iar genele lanturilor B si y pe cromosomul 7. Localizarea particulara a genelor 5 nu este intmplitoare. Atunci cind celula reuseste sii ajunga la o rearanjare productiva a genelor pentru lantul a, genele lantului 8 sunt deletate; astfel, la nivelul unui anumit limfocit T, nu poate exista o expresie simultana de TCR af si TOR 76. ‘A, Human TORA Locus. Vat Va2 5 ieeeett2| A, Human TCRB Locus vet v2 vBn~48 Dp Bie cbt Dp2 Up2t.7) CBZ EB * Domeniul Cy nu este organizat ca un domenis globular. Conformajia TCR pare safe mai sigigl deci a Ig dati ineretunior dite lomeilefedru lan, posi i datoritadterente! dine istemol de ecunoastere a Ag propria icin receptor.‘A. Human TORG Locus oe oil 9 tt iw ws 1 Wit Wy2s iy Ot Hua) OR SySy EY g un A. Human TCRD Locus Vo. Jo. Ve V8.3 CDSS EIS EB CB VA (VBS-10 y= u we 13 4 40 Reasortarea genelor se face sub influenta enzimelor codificate de aceleasi RAG si RAG2, sistemul de recunoastere a genelor este reprezentat de aceeasi__secvenfi heptamer/distantier/nonamer, fuziunea secventelor genice conduce la imprecizie jonctionali, la care se adauga imprecizia inserfionald. Existenja mai multor gene D sau J, grupate distinct, poate conduce la unele diferente de rearanjare'", ‘AL TCRA Sistemul distinct de repartizare al RSS-urilor in cazul genelor TCR permite ca segmente genice V sa fuzioneze direct cu segmente genice J. Spre deosebire insa de segmentele genice D utilizate de limfocitele B (flancate de RSS-uri formate din cate 12 nucleotide si care astfel nu pot fuziona unele cu altele), pana la 3 segmentele genice D ale TCR-ului uman pot fuziona, inainte de unirea cu segmentul genic J. Ca urmare, desi numarul de gene din grupul V este mai mic decat cel de la Ig, repertoriul TCR este mai mare decat al imunogloblinelor, tocmai datoriti. unei enorme variabilititi jonctionale si insertionale (regiune N de adiie, regiune P de aditie). Aceleasi mecanisme reprezinta, in acelasi timp, si un factor de risc, putand conduce la rearanjéri neproductive care fie fac produsul nefunctional, fie fac ca secvena de ADN si nu mai poatd fi citita (introducerea unor codoni stop). diferent importantd intre procesele de formare ale celor doi receptori este aceea ca, in urma activarii antigenice, genele TCR nu sufera hipermutatii somatice. Absenja mutatiilor intamplitoare reprezinta o masurd de siguran{a impotriva aparitiei limfocitelor autoreactive, cu atat mai importanta cu cét limfocitele T au un sistem de recunoastere particular, care vizeazi nu doar antigenul - non-self - ci si molecula de MHC (Major Histocompatibility Complex — Complex Major de Histocompatibilitate) ~self - care prezinta acest antigen. © Astfel, duc in cazul genlor lanl ese seas gens Dr, aceasta se va putea asocia doar co gent J din al doles grup. Dac este alas ind gen D,, eurnjarea va pea asoca, inu-o mane alestore fc o gen din primul grup, edn ldo,Formarea TCR incepe in corticala timusului, intr-o etapa de dezvoltare a timocitelor"' cand acestea si-au cistigat expresia moleculei CD3, enzima TUT este de asemenea prezenta, dar nici una dintre moleculele co-receptor (CD4 si CD8) nu au aparut ined — motiv pentru care celulele sunt denumite dublu negative (DN). Primele gene care incep s4 se rearanjeze, mai mult sau mai putin simultan, sunt cele pentru Ianfurile B si 7. Dac genele 7 sufera o reasortare productiva, incepe si rearanjarea genelor 3. Daca atat genele pentru Ianturile y cat si cele pentru lanjurile 6 sunt rearanjate productiv, cu alte cuvinte transcriptia poate avea loc si poate incepe sinteza lanfurilor, alte rearanjari nu vor ‘mai avea loc si acele timocite vor raméne 76 si se vor dezvolta, pe 0 cale diferiti, in celule DN, CD3+ 76. Acestea vor reprezenta aproximativ 5% din totalul timocitelor la adult. Majoritatea timocitelor dublu negative aleg insa o alta cale de dezvoltare. Daca rearanjarile y si/sau § nu sunt functionale, vor continua rearanjarile . Odati ce celula a ajuns la o rearanjare TCRB productivi sunt suprimate alte rearanjiri ale lanturilor B-TCR (componenta a fenomenului de excluzie alelica). Astfel sunt selectate acele timocite care exprima lantul B pentru 0 expansiune si maturare ulterioara. Din acest moment, pot fi declangate rearanjarile pentru lantul a, iar acele timocite care vor ajunge la rearanjairi productive vor fi capabile si exprime pe suprafafi un TCR af complet format, chiar daca la nivele scizute. Timocitele sunt in continuare dublu pozitive si se gasesc la nivelul corticalei profunde a timusului. De aici incolo, aceste celule vor suferi o serie de procese complexe, cunoscute sub numele de selectie pozitiva si negativa. Selecfia pozitiva are loc Ia nivelul corticalei profunde, sub influenta celulelor epiteliale corticale. Acele timocite care sunt capabile si recunoascd prin intermediul TCR-ului moleculele MHC (cu 0 afinitate medie) sunt selectate pozitiv, vor supravietui si vor primi semnale care le vor determina s& prolifereze. Consecinta acestui fenomen este ceea ce se numeste “restrictie MHC”, sau, cu alte cuvinte, capacitatea limfocitelor T de a recunoaste antigenul doar in contextul moleculelor MHC proprii organismului respectiv, Celulele care nu corespund acestui criteriu sunt eliminate prin apoptoza. Excluzia alelicd funcfioneaz’ cu maxima strictete in cazul formérii imunoglobulinelor. In cazul TCR-ului ins, dacd pentru lanful B excluzia alelica pare s& reprezinte regula, in cazul lanfurilor a este mai putin strict®. in cazul in care se produc rearanjari productive pe ambii cromosomi, cele doua lanturi « diferite vor conduce la existenta simultand a doua TCR-uri cu specificitaji antigenice diferite. Desi nu exist’ un consens asupra numarului de astfel de limfocite T mature circulante, se pare cd in astfel de situatii doar unul dintre cei doi receptori reuseste si treacd de procesele de selectie (in special de selectia pozitiva si ca urmare si fie MHC-limitat). ‘Numarul celulelor care posed un receptor corespunzitor din acest punct de vedere este mic si, ca urmare, o serie din celulele care nu au fost selectate pozitiv au posibilitatea sa igi reia rearanjarile pentru lanful o.. Daca noua rearanjare va fi productiva, exista potenjialul de a conduce Ia 0 noua specificitate, Acest fenomen este denumit “editare” iar timocitul cdruia i se oferd aceasta sansa va trebui sf treaci din nou prin procesul de selectie pozitiva. La nivelul jonctiunii cortico-medulare, unde se gasesc celule cu origine hematogena (macrofage si celule dendritice) si mai departe in corticala medulara, sub influenta celulelor epiteliale de la acest nivel, are loc procesul de selectie negativa'”. Eliminarea prin procesul de selectie negativa a timocitelor care poarta receptori de mare afinitate pentru molecule MHC self singure sau pentru antigenul self prezentate de MHC, conduce la tolerant fata de self. ° Lfocitele Tain mas, elt in pln proses de diferente, sunt denumitetimocte » Seecia porte a linfoctului B are alt sents exprimares unui reeepter intermedi; sletia negativa se reer is de asemenes la climinarealimfocitelr B autoreactiveDeoarece procesul are loc in timus, este denumit toleranga central. Sunt astfel practic climinate fizic un numar important de limfocite autoreactive'’. Recunoasterea unui tip de MHC sau altul are o consecint& suplimentara: acele timocite care au recunoscut un MHC I se vor diferenfia in continuare in limfocite T citotoxice (CD8+ CD4-), iar cele care au recunoscut MHC II se vor diferentia in limfocite T helper (CD4+ CD8-), TABLE 9-1 TCR MULTIGENE FAMILIES IN HUMANS No. of gene segments ‘Chromosome location iv) D 1 c 4 50 70 1 4 3 3 3 1 7 ST 2 B 2 7 4 5 2 “The B-chain gene segments are located between the V, and J, segments. "There are two repeats each containing 1 Dy 6 oF 7 jy and 1 Cy. There are two fepeats, cach containing 2 oF 5 J, and I C, SOURCE: Data ftom PAH Moss et aly 1992, An. Rev: Imemunet 10:7. " Aceat proces mu este perfect a eontaua in porifre, dar act vor ft implicate mai degra alte mecanisme decitindvesrea apoptozsi ccileoe