Activarea limfocitelor I. Activarea limfocitelor T Activarea limfocitelor T naive se realizeaza ca urmare a unei succesiuni bine stabilite de evenimente, iar un singur semnal de activare nu va fi suficient pentru a declansa proliferarea si ulterior diferentierea acestor celule. Pentru inceput, vor fi prezentate conditiile de activare ale limfocitelor Th. 1. Primul semnal de activare, semnalul fiziologie, este reprezentat de catre Ag. Acesta este reprezentat in fapt de un fragment peptidic, rezultat din procesarea antigenclor exogene si prezentat in cupa MHC Il de pe suprafata unui APC. Singurul APC profesional care poate activa in mod eficient limfocitele Th naive este reprezentat de DC mature. In plus, este nevoie de o interactiune sustinuta intre complexele MHC I/Ag si un numar suficient de molecule TCR. Pentru ca o astfel de interactiune sa poata avea insa loc in mod. eficient, este nevoie ca cele doua celule sa fie mentinute in contact si, intt-o prima etapa, acest rol este jucat de moleculele de adeziune. Importanta actiunii moleculelor de adeziune (prezentate mai jos) in mentinerea contactului dintre cele doua celule devine cu atat mai evidenta cu cat datele experimentale atesta ca este necesara 0 semnalizare sustinuta de pana la 30 h pentru a obtine activarea completa a limfocitelor Th naive'. In plus, va fi nevoie de legarea a 8 000-30 000 de molecule TCR la cca 50-100 complexe MHC. UA ICAM3 ICAMS- UAT ICANT At Lat toawet 1 Tost cosa «Cha miowag TO coe CD110C018 ICA cpa ‘Cosel BT-ET2 cna Interfata de contact dintre limfocitele T si APC este denumita sinapsa imunologica sau SMAC (supramolecular activation complex). Limfocitele T incep sa se ,catere” pe suprafata APC- ului si modificarile scheletului de actina initiate de moleculele de adeziune, vor fi ulterior amplificate cu ajutorul moleculelor co-stimulatoare (la care ne vom referi ulterior). » Stimularea tranzitorie a TCR nu va conduce la activarea ci la inducerea anergiei limfocitelor T.LFA-I este o integrina, adica 0 molecula de adeziune care favorizeaza contactul intre celule ssau intre celule si matricea extracelulara. LFA-1 se poate lega la moleculele ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102) si ICAM-3 (CD50) Moleculele ICAM fac parte din superfamilia Ig-nelor. Nivelul de expresie al ICAM-1 este amplificat de citokine pro-inflamatorii. Logica cresterii numarului de molecule ICAM-1 pe suprafata APC-urilor este aceea de a incetini limfocitele T care exprima LFA-1 exact in zona in care ar fi nevoie de scanare a prezentei antigenului. Legarea LFA-I/ICAM-1 este amplificata dupa semnalizarea prin TCR, stabilizand suplimentar contactul dintre limfocitul T si celula partener. CD2 (LFA-2) este de asemenea un membru al superfamiliei Ig-nelor si este exprimat precoce pe suprafata timocitelor. Functioneaza ca o molecula de adeziune intercelulara, legand cu mare afinitate LFA-3, care apartine de asemenea superfamiliei Ig-nelor si este exprimata pe diverse tipuri celulare, inclusiv APC-uri. Legarea dintre CD2 si LFA-3 stabilizeaza celulele partener astfel incat acestea sa formeze un conjugat (Th-APC sau Te-celula tinta). Formarea conjugatului ofera un timp suplimentar TCR-ului sa scaneze peptidele prezentate de MHC. In plus, in cazul limfocitelor B, legarea LFA-3 de catre CD2 determina cresterea expresici moleculei CD40 (despre care vom arata ca joaca un rol de co-stimulare in cazul limfocitelor B). Experimente efectuate in anii ’90 au aratat ca declansarea unui semnal de catre un limfocit T naiv este posibila atunci cand minimum 3 molecule TCR sunt aduse impreuna, determinand obtinerea unei structuri stabile TCR/CDR/MHC-peptid. Acest model de activare a fost denumit modelul de ,oligomerizare”. Procesul incepe insa practic pe suprafata APC-urilor, cu dimerizarea moleculelor de MHC Il, care astfel vor impune legarea a doua molecule de TCR, care apoi vor oligomeriza, proces realizat cu ajutorul domeniilor Ve. Ulterior, s-a aratat ca numeroase molecule TCR pot fi angajate succesiv de catre relativ putine complexe MHC-Ag, generand in acest fel o succesiune sustinuta de semnale necesare pentru activarea limfocitelor T naive. S-a estimat astfel ca aproximativ 18 000 - 20 000 de molecule TCR sunt de obicei declansate de catre aproximativ 100 de complexe MHC-Ag, cea ce arata ca fiecare MHC poate interactiona succesiv cu aproximativ 180 - 200 de molecule TCR distincte de pe suprafata acelui limfocit T*. 2 Moleculele TCR care au fost angajate se asociaza cu agregate fosfolipidice bistratificate (rafts), cu care formeaza astfel platforme pentru recrutarea (si deci aducerea impreuna) si activarea de molecule aditionaleICOS (inducible costimulator) are o structura si functii similare cu cele ale CD28, dar recent s-a descoperit ca ligandul ICOS (ICOS L), desi asemanator cu moleculele B7, nu poate fi legat nici de CD28, nici de CTLA-4, ci doar de ICOS. Asa cum ii spune numele, ICOS este insa exprimat doar dupa co-stimularea prin CD28. De asemenea, in timp ce CD28 conduce la cresterea productiei de IL-2, ICOS va determina cresterea sintezei de IL-10, 0 citokina importanta pentru diferentierea limfocitelor B. In paralel, stabilizeaza mARN-ul_ pentru CD40L (asa cum CD28 stabilizeaza mARN-ul pentru IL-2). Se crede ca ICOS este necesar pentru promovarea secretiei de IL-4 si astfel pentru definitivarea diferentierii limfocitelor Th. CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte associated molecule 4°) este un homodimer care are 0 omologie de structura de cca 75% cu CD28, in schimb prezinta o afinitate de legare pentru moleculele B7 de 10-20 de ori mai mare. CTLA-4 nu este exprimat constitutiv ci va apare pe suprafata limfocitelor T dupa legarea TCR. Se crede ca afinitatea crescuta a CTLA-4 pentru B7 face in asa fel incat practic dislocuieste CD28 si blocheaza semnalul activator declansat de aceasta, blocand astfel diviziunea celulara in faza tranzitici de la stadiul Gj, la stadiul S. In plus, CTLA-4 poate recruta tirozin-fosfataza SHP-2 la nivel membranar, iar aceasta enzima se Teaga la un motiv ITIM (inhibitor) al cozii intracitoplasmatice a CTLA-4, cea ce va reversa activarea limfocitelor T printr-o cascada de evenimente pe care 0 vom prezenta ulterior. Expresia CTLA-4 este controlata atent, pentru ca este important ca molecula sa nu fie exprimata prematur. Majoritatea acestor molecule sunt retinute in compartimentul Golgi al limfocitului in repaus, iar la 2 ore de la legarea TCR-ului, moleculele CTLA-4 sunt reorientate catre interfata cu APC-ul, continuand sa se acumuleze in vezicule pana la 6 ore de la legarea TCR-ului. Iesirea din acest compartiment se va face doar la 48-72 h de la evenimentul activator. > B7 Family Ligands (¢028 Family Receptors PDL-I se leaga la PD-1, exprimata pe limfocite T activate, limfocite B si celulele mieloide. Legarea PD-1 de pe suprafata limfocitelor T conduce la un semnal care blocheaza productia de IL-2 mediata de TCR si astfel blocheaza proliferarea limfocitelor T. Legarea PDL-1 de pe surpafata monocitelor de catre PD-1 de pe suprafata limfocitelor CD4+ activate conduce la secretia de IL-10 de catre monocite. 3 In ciuda numelui, molecula este exprimata atat de limfocitele Th cat si de cele Te.Pe de alta parte, necesitatea ca 0 anumita molecula MHC sa poata stimula atat de multe molecule TCR implica faptul ca MHC-Ag trebuie sa se si desprinda foarte repede de TCR odata ce semnalul initial de fosforilare a fost furnizat. Aceasta balanta on-off” este deci foarte importanta pentru activare. Daca legarea peptidului antigenic este slaba, disocierea se face mai rapid decat in cazul agonistului uzual si activarea nu se mai produce. Sistemul furnizeaza insa si un paradox, deoarece aceasta inseamna ca un peptid agonist care se disociaza foarte incet, refuzand sa ,elibereze” TCR-ul in timp util, va face ca acel complex MHC-Ag sa nu poata fi folosit in continuare de un numar adecvat de molecule TCR pentru a obtine semnalizarea in serie descrisa mai sus. Moleculele TCR de pe suprafata intregului limfocit T se deplaseaza catre polul de interactiune cu cella partener. In mod similar, pe suprafata APC-ului se realizeaza concentrarea moleculelor MHC II catre zona de membrana care participa la formarea SMAC. In procesul de legare intervin de asemenea si moleculele co-receptor. In cazul limfocitelor Th, moleculele CD4 se leaga la domeniul B2 al MHC II. Se crede ca efectul este, in primul rand, unul de crestere a aviditatii de legare si astfel de descrestere a vitezei de desprindere a TCR- ului de MHC-Ag. In plus insa, fiecare dintre moleculele co-receptor este asociata, la partea intracelulara, cu protein tirozin kinaze (PTK) din familia sre. 2, Semnalul co-stimulator Activarea completa a limfocitelor T va necesita mai departe si semnale co-stimulatorii. Cea mai importanta pereche de molecule din acest punct de vedere este cea formata de CD28 de pe suprafata limfocitelor si B-7 de pe suprafata APC-urilor. Legarea CD28 este critica pentru activarea limfocitelor naive, caci, in absenta co-stimularii, angajarea TCR va conduce la apoptoza sau anergie. CD28 este un homodimer, membru al superfamiliei Ig-nelor, exprimat constitutiv pe limfocitele activate sau in repaus, pe aproape toate limfocitele Th si pe aproximativ jumatate dintre limfocitele Te umane. Odata cu angajarea TCR, expresia CD28 este amplificata rapid, iar celulele ies din faza Go si intra in ciclul celular. In final, efectele legarii CD28 se vor reflecta in secretia de citokine, precum si a receptorilor pentru aceste citokine. Nu in ultimul rand, CD28 induce expresia unor alte molecule co-stimulatorii sau reglatoare, cum ar fi ICOS, 4-IBB si CTLA-4, precum si a moleculei CD40-L, foarte importanta pentru interactiunea dintre limfocitele T si B. CD28 se leaga cu afinitate moderata la doi liganzi denumiti B7-1 (CD80) si B7-2 (CD86), intre aceste doua molecule existand © homologie de structura de doar 25%. Expresia amandurora este amplificata pe suprafata APC-urilor ca urmare a interactiunii cu limfocite T, dar cu kinetici diferite: B7-2 creste rapid si expresia poate fi sustinuta timp de 96 de ore, in timp ce B7-I apare doar dupa 48 de ore si rezista aproximativ 72 de ore. Ca urmare a interactiunii CD40-CD40L, pe suprafata limfocitelor B va fi amplificata expresia ambelor molecule, in timp ce pe suprafata DC aceasta interactiune (la care se adauga IFNy si GM- CSF) conduce la cresterea B7-. B7-1 si2 au functii partial redundante: co-stimulare a limfocitelor T in procesul de proliferare si secretie de IL-2 si IFNy. Angajarea B7-2 va conduce insa la inducerea secretiei de IL-4 intr- © masura semnificativ mai mare decat B7-1, iar aceasta citokina va induce diferentierea limfocitelor Th in limfocite efector Th. De asemenea, B7-2 va determina cresterea secretiei de limfotoxina a (cu efecte similare ale TNF — tumor necrosis factor), in timp ce B7-1 favorizeaza secretia de GM-CSF. necesare activarii. Intregul complex membranar format din TCR-ul stimulat de antigen, CD3, molecule de adeziune, molecule co-stimulatorii si alte molecule de semnalizare asociate acestor rafts” formeaza imunosom-ul”.PDL-I se poate lega B7-1 (cu afinitate intermediara intre CD29 si CTLA~4) dar nu si la B7- P55 CD40L este un membru al superfamiliei TNFR (receptor pentru TNF). Legarea la molecula CD40 de pe suprafata APC-urilor reprezinta o etapa importanta de pregatire a limfocitelor naive pentru activare. Tot din familia TNFR mai mentionam moleculele 4-1BB si OX40, cu rol in co-stimularea limfocitelor T. CD27 este un homodimer exprimat de majoritatea limfocitelor Th si Te resting din sangele periferic. Consecinta a activarii antigenice, expresia CD27 este amplificata, Ligandul lui CD27 este CD70, exprimat atat de limfocitele T cat si de limfocitele B ca raspuns la stimularea antigenica. Interactiunea dintre aceste doua molecule pare sa favorizeze procesul proliferativ, fara o influenta majora insa asupra secretiei de IL-2. Se crede astfel ca rolul ui CD27 in activarea limfocitelor T naive este minor, in schimb este important pentru generarea de limfocite T cu memorie. 3. Semnalul 3: citokine Odata ce limfocitul T a primit primele doua semnale activatoare poate acum progresa catre transcriptia a sute de gene necesare pentru a sustine procesele de proliferare si diferentiere. Din punct de vedere al proliferarii, aceste gene au fost clasificate in functie de cat de repede apar produsii lor dupa angajarea TCR. Produsii genelor imediate pot fi detectati in mai putin de 30 de minute, in general, aceste gene codand pentru componenti ai factorilor de transcriptie nucleara, necesari pentru stimularea transcriptiei unor gene precoce sau tardive implicate in proliferare. Produsii genelor precoce sunt detectati in 30 min — 24 h de la stimularea TCR, incluzand aici 1L-2, dar si IL-3, IL-4, IL-5, IFNy, chemokine, factori de crestere. Produsii genelor tardive sunt exprimati dupa 48 h de la stimularea TCR si codeaza pentru noi molecule de adeziune (care permit migrarea in tesuturi) sau factori citotoxici si alte molecule necesare pentru functia efectorie a limfocitelor T. Limfocitele T activate trebuie mai intai sa prolifereze pentru a se putea diferentia in celule cu memorie si celule efector, astfel incat inducerea secretiei de citokine care sustin diviziunea celulara si supravietuirea, precum si expresia receptorilor pentru aceste citokine este critica pentru raspunsul imun. O prima astfel de citokina este IL-2, dar si o serie de alte citokine (in special IL-15°) contribuie la expansiunea clonala a limfocitelor T activate. IL-2 R de mare afinitate este un heterotrimer, format din lanturile a, B si y. Majoritatea limfocitelor T mature exprima heterodimerul By. Dupa receptionarea primelor 2 semnale activatorii, expresia IL-2 Ra este stimulata, ceea ce conduce la asamblarea receptorului de mare afinitate. In cazul limfocitelor Th, actiunea IL-2 este una autocrina, absenta citokinei conducand la apoptoza, ceea ce arata ca in vivo este nevoie de o prezenta continua, sustinuta, a acestei citokine (sau a unci citokine compensatorii). Astfel, limfocitul respectiv poate progresa in ciclul celular si va prolifera Transcriptia IL-2 este controlata pe mai multe niveluri. Regiunea enhancer a promotorului genei contine mai multe motive de legare, destinate unor factori transcriptionali diferiti (NFAT, NF-kB, AP-I, Oct-1) si transcriptia genei depinde de care astfel de factor transcriptional si care motiv structural vor fi implicate. “ Inhibitorii de PD-1 (Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab) si CTLA-4 ([pilimumab) constituie subiecti a multiple triatur clinic, aflate in plina desfasurare, cu rezultate extrem de incurajatoare. STL-15 R prezinta doua lanturi in comun cu IL-2 R, precum si o eale de semnalizare comuna,Calea de semnalizare intracelulara declansata de legarea TCR Rezultatul anagajarii unui numar suficient de molecule TCR si a formarii SMAC este reprezentat de recrutarea de proteine cu rol de transducere a semnalului si activarea unor domenii cu rol de semnalizare din cadrul acestor molecule. In fapt, este vorba despre multiple cai de semnalizare care sunt declansate prin legarea TCR, cai ce se vor interpatrunde (cross- talk si feed-back) apoi cu cele declansate de moleculele co-receptor si co-stimulatorii. La acestea se adauga si moleculele adaptor”, proteine non-enzimatice, localizate la nivelul agregatelor fosfo-lipidice (rafts) care permit unor diferite molecule cu rol in transducerea semnalului sa interactioneze fizic intre ele. [=] Adaptors =D Enzymes — {) Tranecripton factors EL) Exchange factors Lanturile CD3 nu prezinta proprietati catalitice intrinseci, in schimb contin motive ITAM si astfel servesc ca substrat pentru fosforilarea aa de tirozina de catre protein tirozin kinaze de tip sre cum ar fi Ick si fon. In conditii de repaus, aceste kinaze sunt mentinute inactive ca urmare a faptului ca sunt ele insele fosforilate Ia nivelul unui anumit particular reziduu de tirozina de la capatul C-terminal. La cateva minute de la legarea TCR, la complexul TCR/CD3 se asociaza si molecula co-receptor, la randul ei asociata cu kinaza Ick inactiva,care astfel formeaza un agregat cu TCR si ,rafts”. In mod similar, fim fosforilat este recrutat Ja nivelul lanturilor ¢ ale CD3. Activarea celor 2 kinaze va fi efectuata de catre molecula CD45, o fosfataza cu dimensiuni mari, molecula exprimata pe suprafata tuturor leucocitelor®. Odata defosforilate, /ck si fon se vor activa si vor fosforila mai departe tirozine de la nivelul motivelor ITAM, proces denumit de unii autori ,,activarea motivelor ITAM” si care permite in continuare recrutarea tirozin kinazei ZAP-70 (zeta associated protein 70). ZAP-70 este inrudita cu kinaza syk exprimata de catre limfocitele B, dar este exprimata de catre limfocitele T’. Odata ce ZAP-70 este legata la complexul de semnalizare, kinazele src o vor fosforila in continuare, activandu-i astfel activitatea catalitica si permitand-i, intr-o prima instanta, sa se autofosforileze. Ulterior, ZAP-70 va determina fosforilarea unor molecule ce fac parte dintr- un complex denumit adaptor si care vor furniza legaturile esentiale catre molecule intermediare ce transduc semnalul TCR si determina reorganizarea citoscheletului de actina. Una dintre cele mai importante molecule care interactioneaza cu ZAP-70 se numeste Vavl, cel putin pentru ca are in componenta un domeniu care se leaga la citoscheletul de actina, Dupa legarea TCR, Vavl si ZAP-70 activate, precum si CD3{ fosforilate se asociaza cu citoscheletul, determinand coalescenta raft-urilor si asamblarea SMAC. © alta enzima importanta activata de catre ZAP-70 este fosfolipaza C-y1 (PLC-yl). Recrutarea unui set intreg de molecule adaptor® va permite in final fosforilarea unor tirozine si activarea PLC-y1, care astfel va putea hidroliza un lipid membranar denumit phosphatidyl inositol 4,5 dipshosphate (PIP2) in mesagerii secundari inositol 1,4,5-triposphate (IP3) si 1,2 diacylglycerol (DAG). 1P3 intracelular se leaga la un canal de calciu, determinand eliberarea Ca’ din depozitele intracelulare din ER. Calciul mobilizat se va lega si va activa o proteina ubiquitara denumita calmodulina, In prezenta unor cantitati crescute de Ca’, complexul calmodulina-Ca*” va activa mai departe o serin/threonin fosfataza denumita calcineurina. Odata activata, calcineurina isi va exercita functia si va defosforila forma citoplasmatica, inactiva, a unor membri ai familiei NFAT, in special NFATe — citoplasmatic. NFATc defosforilat va putea acum sa traverseze membrana nucleara si sa se lege la factorul transcriptional nuclear AP-1, cu care sa formeze o entitate denumita NFATn — nuclear. Acesta este capabil sa interactioneze cu motive specifice prezente la nivelul promotorilor unor gene Precoce, necesare pentru activarea limfocitului T° Ca” actioneaza si asupra DAG, care astfel va activa o serin/threonin kinaza numita protein kinaza C (PKC). Una dintre isoformele acesteia (PKC0) va fi recrutata la nivelul raft-urilor si va declansa 0 cascada de fosforilari ce vor culmina cu activarea factorului transcriptional NF- KB. Acesta este necesar pentru activarea inductiei maximale a transcriptiei de IL-2. Fosforilarea de catre ZAP-70 a proteinei adaptor LAT determina in continuare recrutarea unei kinaze denumita phosphatydil inositol-3 kinaza (PI3K) la nivelul membranei celulei T. PI3K. fosforileaza PIP; si il converteste in phosphatidyl inositol 3,4,5-triphosphate (PIP3), cea ce © CD45 poate fi exprimata in mai multe isoforme (care rezulta prin splicing alternativ), cu dimensiuni care variaza intre 180 si 220 kDa, in functie de starea de activare a celulei. Isoforma CD45RO are o greutate ‘moleculara mica, find codata de 0 gena din care lipsese exonit 4, 5 si 6, le care se adauga un nivel scazut de glicozilare. Acasta isoforma este observata in stadiile tardive de activare si este utilizata pentru a distinge limfocitete T cu memorie. Se pare ca CD4SRO se asociaza mai puternic cu CD4 si CDR, cea ce afecteaza eficienta fosforilarii Ick si fyn. Ligandul lui CD4S nu este cunoscut inca (daca exista vreun ligand), dar importanta acestui marker pan-leucocitar este subliniata de faptul ca inactivarea CD45 conduce nu doar la blocarea activari limfocitelor T mature, dar si a dezvoltari timice. * ZAP-10 este mentinuta inactiva in limfocitele T resting de catre o tirozin fosfataza denumita SHP-1 si care continue un domeniu SH2 similar cu al ZAP-70. "La ZAP-70 se leaga SLP76, apoi GADS si LAT. La aceasta se leaga PLC~y1, iar kinazaitk (din famitia Tee kinazelor) se leaga la SLP76. Ik va activa PLC-y1 prin fosforilarea tirozinei. * NFATn este apoi refosforilata de catre o kinaza din nucleu, GSK3, ceea ce conduce la disocierea NFATe de AAP-I si exportul NFATe inapoi in citoplasma. Ciclosporina A, un imunosupresor, inhiba defosforilarea NFAT si astfel blocheaza activarea limfocitelor T.conduce Ia scaderea productiei de mesageri secundari (DAG si IP3). Astfel, PI3K inhiba activarea PLC-yl. Totodata, PI3K va actiona asupra altor doua cai implicate in activarea limfocitului T: calea de semnalizare prin p38 si calea SAPK/JNK (stress activated protein kinase/c-jun N terminal kinase). Prin actiunea sa de fosforilare, PI3K va conduce in final la activarea factorului de transcriptie c-jun, cu rol in activarea transcriptiei uneui set de gene pro- inflamatorii, printre care TNF si selectina E. Este foarte posibil ca recrutarea si activarea PI3K. sa fie determinate de legarea CD28. Ras este o proteina mica, monomerica, asociata fetei citoplasmatice a membranei celulare si care leaga guanina, Activitatea sa este astfel controlata de statusul de fosforilare a nucleotidelor, de care este responsabil o serie de proteine cunoscute sub numele de GEF (nucleotide exchange factors). Ras-GDP este inactiv si este necesara interventia GEF pentru conversia ras-GDP in ras-GTP. Fosforilarea LAT de catre ZAP-70 conduce la activarea unei astfel de de GEF si mai departe la activarea ras, care va declansa 0 cascada de serin/threonin MAPK kinaze, ce includ raf, MEK si ERK. Aceasta cascada conduce la fosforilarea si activarea a mai multor factori transcriptionali, printre care c-myc si c-fos. Activarea acestor factori conduce la initierea transcriptiei unor noi gene. Angajarea CD28 pare sa scada pragul semnalului necesar pentru activarea limfocitelor T, prin scaderea numarului de molecule TCR care trebuie agregate in SMAC. Experimental s-a aratat astfel ca numarul moleculelor TCR poate sa scada de la un necesar de 8 000 pana la doar 1000-5000, in cazul utilizarii co-stimularii. In prezenta co-stimularii, un limfocit T devine angajat pentru co-stimulare in cca 6 ore, in timp ce in absenta ei are nevoie de cca 30 h. Legarea CD28 la B7 declanseaza fosforilarea reziduurilor de tirozina de la nivelul cozii intracitoplasmatice a CD28 probabil de catre Ick si/sau fim, cea ce mai departe conduce la recrutarea PI3K, care va genera PIP; si alti mediatori fosfolipidici, CD28 determina de asemenea hiperfosforilarea Vavl. Se va produce o reorganizare a citoscheletului de actina mediata de molecula rac si agregarea raft-urile membranare in jurul complexului TCR/CD3. Aceste rafi-uri contin elemente ale cailor ras/MAPK si SAPK/JNK, care vor conduce la activarea factorilor nucleari de transcriptie c-fos si c-jun, care se vor combina pentru a forma AP-1, AP-1 se leaga la anumite motive din promotorul genei IL-2, determinand stabilizarea mARN-ului IL-2, precum si cresterea expresiei genei anti-apoptotice bel-xL In plus, se crede ca angajarea CD28 contribuie la o reducerea expresiei IkB si astfel la inlaturarea unui reglator negativ cheie al NF-KB. Semnalizarea prin NF-kB contribuie la expresia a numeroase citokine, inclusiv IL-2, IL-4, IL-6, IFNy, MIP-a sau a receptorilor pentru IL-2, IL-12, a CXCRS. Nu in ultimul rand, nu trebuie uitat ca CD28 contribuie la expresia de alte molecule co- stimulatorii Molecula CTLA-4 reverseaza activarea limfocitelor'T prin defosforilarea CD3¢ si posibil a Ick, fun, ZAP-70, Vav1Il. _Activarea limfocitelor B data ce un limfocit B matur naiv ajunge in periferie va supravietui cateva zile, dupa care va intra in apoptoza. Singura sansa de salvare e reprezentata de contactul cu antigenul, mai precis, spus de activarea limfocitului. In plus, soarta limfocitelor B va depinde si de natura antigenului pe care il intalneste. Daca antigenul este T dependent si limfocitul B este activat cu succes de catre limfocitul Th cu care interactioneaza, atunci urmeaza proliferarea si diferenticrea limfocitului B, astfel incat sa devina capabil sa efectueze hipermutatii somatice si comutarea de clasa, Vor fi produse atat plasmocite cat si celule cu memorie si va fi obtinut un raspuns imun umoral. Daca antigenul intalnit este unul T independent, vor fi generate plasmocite, dar nu se va produce comutare de clasa, astfel incat plasmocitele vor secreta anticorpi de clasa M si nu vor apare celule cu memorie. Daca receptorul celulei B se leaga la tun auto-Ag (care nu a fost intalnit in maduva osoasa, in cursul procesului de selectie negativa), acel limfocit B va fi fie deletat prin apoptoza, fie i se va induce o stare de anergie. In mod similar limfocitelor Th, activarea limfocitelor B de catre un antigen T dependent va necesita 3 semnale: 1. legarea antigenului, 2. receptionarea semnalelor co-stimulatorii si 3. receptionarea citokinelor secretate de limfocitele Th. © Antigen binding ®© Contain ® cytokine help Activated Boll B call clonal expaneion and ‘differentiation Boa (Teal mic taco 0 Come Coie Bro ree Sw SrmingSemnalul activator BCR complet de pe suprafata unui limfocit B matur naiv din periferie consta din IgM membranar asociat cu proteinele accesorii de semnalizare, denumite Iga si IgB (complexul CD79). Un astfel de limfocit B se afla in faza denumita ,cognitiva”, in care este capabil atat sa recunoasca dar sa si reactioneze fata de un antigen specific care este legat de receptor. Datele experimentale arata ca este necesara interceptarea mai multor molecule BCR pentru a putea declansa un semnal activator care sa conduca la productia de noi proteine necesare pentur activarea completa a celulei Intr-un minut de la un astfel de eveniment, este transmis un semnal de catre Iga si Ig, cu ajutorul kinazelor src (fim, lym, bik) agregate in jurul bazei citoplasmatice a BCR. Activarea srk kinazelor se face prin defosforilarea de catre enzima CD45 a reziduului C-terminal de tirozina. CE DAdeptom ED Erayes (>) Tmnsattion 644 eminent « Phosphate Odata activate, aceste PTK. vor fosforila aa de tirozina situati la nivelul motivelor ITAM apartinand moleculelor Iga si IgB. Fosforilarea tirozinei poate fi detectata si la 30 de secunde de la stimularea BCR si atinge un maximum in 3-5 minute, Fosforilarea tirozinelor va conduce la recrutarea de noi PTK la acest complex, cum ar fi kinaza syk sau kinaza Bik (Bruton’s tyrosine kinase). Odata recrutate, aceste kinaze vor fi la randul lor fosforilate de catre /yn, fim si blk, cea ce va conduce la activarea lor.‘Syk activata va determina in continuare fosforilarea unei proteine adaptor denumita BLNK, ce va servi ca initiator pentru alte molecule, Astfel, vor fi activate mai departe PLC-y1 si ras. Ras activat va induce activarea unei serin-threonin kinaze numita raf, care in schimb va activa © alta kinaza numita MAPK (mitogen activated protein kinase). Calea ras-raf-MAPK de transmitere a semnalului continua prin intermediul altor catorva enzime si culmineaza cu activarea unor diversi factori transcriptionali nucleari care intra in nucleu si influenteaza pattern-ul de expresie genica. PLC-yl activata de catre syk si Bik, cliveaza PIP, in IP; si DAG. IPs determina cresterea concentratiei intracelulare de Ca” din depozitele intracelulare (flux de calciu) si care apoi va activa 0 cascada enzimatica dependenta de calciu. Tot in prezenta Ca” DAG activeaza protein kinaza C (PKC), o serin-threonin kinaza similara functional cu raf. Proteinele fosforilate pe ambele cai vor actiona ca inductori ai transcriptiei, conducand la sinteza de c- mye si c-fos, subunitati cheie ale unor factori transcriptionali. Legarea acestora la diverse secvente ADN va conduce la activarea si reglarea transcriptiei de noi gene, ai caror produsi controleaza proliferarea si diferentierea celulelor B. Rezultatul final al acestei cascade induse de catre antigen este acela ca limfocitul B este pregatit sa receptioneze atat semnalul co-stimulator cat si citokinele produse de limfocitul Th. ARN-ul mesager ce codeaza diferiti factori de transcriptie a fost detectat in cca 60 min de la legarea antigenului, in timp ce modificari vizibile ale morfologiei limfocitelor B pot apare dupa cca 12 h de Ja stimulare. Celula creste in dimensiuni, continutul in ARN creste si limfocitul se misca din faza Go in faza G, a ciclului celular. Este amplificata expresia moleculelor MHC II si a moleculelor co-stimulatorii necesare pentru receptionarea semnatului 2 de la limfocitul Th. De asemenea, incep sa fie exprimati receptorii pentru citokine necesari pentru receptia semnalului 3. cota CDI9 face parte din molecula co-receptor a limfocitului B, impreuna cu CD21 (receptorul pentru complement 2, CR2) si CD81. Rolul fiziologic al CD81 ramane necunoscut inca. CD19 poseda aa de tirozina la nivetul cozii citoplasmatice, aa care vor fi fosforilati ca raspuns Ia angajarea BCR, eveniment ce determina si asocierea lyn si fyn la CD19. Stimularea CD19 se poate realiza si atunci cand CR2 se leaga la un antigen opsonizat cu fragmente ale complementului. Daca aceste doua procese se produc simultan (legarea BCR si a CR2), aceasta inseamna ca receptorul pentru antigen si co-receptorul limfocitului B sunt co-legate(cross-linking), cea ce conduce la o amplificare a semnalului de activare. CD19 ar putea fi de asemenea util si pentru receptionarea ajutorului de la limfocitele Th, consecinta a co-legarii va fi exprimarea FcyRIIB pe suprafata limfocitului B, receptor care va fi situat foarte aproape de BCR si va genera o co-legare ce va transmite un semnal inhibitor celulei, care indica faptul ca este prezenta o cantitate suficienta de anticorp si nu este nevoie de productia unei cantitati suplimentare. Mecanismul de supresie se bazeaza pe interactiunea dintre motivele structurale ITIM din coada citoplasmatica a FeyRIIB si tirozina SHP-1 B. Negative regulation a Semnalul co-activator Daca limfocitele receptioneaza semnalul 1 dar nu si semnalul co-stimulator, devin anergice sau intra in apoptoza. Daca insa sunt furnizate ambele semnale, limfocitele vor deveni capabile sa accepte semnalul 3 (citokinele secretate de limfocitele Th). Doar 0 celula pe deplin activata va putea progresa catre proliferare si diferentiere si mai departe catre functia efectorie. Inainte insa sa receptioneze semnalul co-stimulator, limfocitul B trebuie sa adere stabil la suprafata limfocitului Th activat de catre antigen. Aceste interactiuni asigura ca cele doua celule sa fie mentinute impreuna suficient de mult timp pentru a obtine activarea completa si reciproca Cel mai important contact co-stimulator pentru activarea limfocitului B este furnizat de interactiunea dintre molecula CD40 de pe suprafata celulelor B si CD40L de pe suprafata limfocitelor T. CD40 este o glicoproteina exprimata la un nivel inalt pe suprafata celulelor B mature naive, dar nu si pe plasmocite, in timp ce CD40L va fi exprimat doar pe suprafata limfocitelor Th activate. Dpdv structural, CD40 este un membru al superfamiliei TNFR, iar portiunea intracitoplasmatica este asociata cu cu proteinele de semnalizare TRAF2 si TRAF3 (TNFR-associated factor), care, la randul lor, interactioneaza cu factorul transcriptional NF- kB. Interactiunea CD40-CD40L este esentiala 1a om nu doar pentru activare cat si pentru comutarea de clasa si pentru formarea centrilor germinali. Deficienta in CD40L va conduce la © imunodeficienta in care exista o hiperproductie de IgM.Semnalul 3 Legarea antigenului la suficient de multe molecule BCR, insotita de co-stimularea mediata de CD40 declanseaza inductia expresiei de receptori pentru citokine, in particular IL-4R. Fara legarea acestor citokine cheie, limfocitele B vor suferi o proliferare extrem de limitata. In timp ce unele citokine necesare pentru activarea limfocitelor B sunt secretate de catre macrofage sau DC din vecinatate, majoritatea sunt produse insa de catre limfocitele Th stimulate de catre Ag si care sunt in contact cu limfocitele B. La scurta vreme dupa interventia moleculelor de adeziune si a celor co-stimulatoare, aparatul Golgi este reorganizat in interiorul limfocitelor Th, astfel incat sa ajunga in proximitatea polului de interactiune cu limfocitele B. Eliberarea citokinelor devine astfel mai precisa, mai directionata catre limfocitul B, ceea ce conduce la cresterea eficientei in furnizarea semnalului 3. O astfel de rearanjare a aparatului Golgi nu este observata daca limfocitele B si Th vin in contact in absenta stimularii antigenice. Legarea antigenului specific de catre un numar suficient de molecule BCR de pe suprafata unui limfocit B matur, naiv sau a a unui limfocit B cu memorie, pregateste celula pentru a depasi stadiul Go a ciclului celular catre stadiul G, al blastului. In multe (dar nu in toate) cazuri, legarea IL-4 este evenimentul principal care declanseaza intrarea in acest stadiu. Expunerea continua la IL-4 impinge celula B mai departe in faza S si induce replicarea ADN- ului, ca etapa premergatoare diviziunii celulare. In aceasta etapa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 si ‘TGEB pot actiona pentru inducerea proliferarii limfocitelor B. In timp ce nici o citokina nu este suficienta (in mod individual) pentru activarea celulei B, pe de alta parte, nici una dintre ele nu este esentiala, Comte 8 oa na] 2.4.8 10.70 666 — heme, ess ©2696 10,0 TOFDPe masura ce limfocitele B continua sa se divida, actiunea altor citokine devine importanta pentru inducerea diferentierii celulelor activate in celule cu memorie sau plasmablasti, precursorii imediati ai plasmocitelor. La om, IL-2 si IL-6 induc diferentierea catre plasmocit. Trebuie subliniat ca limfocitele B nu numai ca receptioneaza citokine, dar au si o capacitate limitata de secretie. IL-6 si TNF secretate de catre acestea pot creste efecienta activarii limfocitelor Th, ceea ce in schimb creste productia de citokine esentiale pentru sustinerea proliferarii si diferentierii limfocitelor B. c3d \ Antigen )_~ CR2 (CD21) CD19 TAPA-1 (CD81) \