II.

BIOTFHNOLOGIA UTILIZARII ELICITORILOR FUNGICI PENTRU IM UNIZAREA

PLANTELOR iM POTRIVA ATACU LU I AG E NTI LOR PATOG EN I

1.1 Elicitorii - defini{ii;i mod de ac{iune -

Necesitatea practicdrii unei agriculturi ecologice Ei interesul crescdnd al consumatorului

.avtzat pentru produsele acesteia, pe fondul unei incidenle mari a atacului unor agenli
'patogeni, au impus abordarea unor studii vizdnd inducerea pe cale biologicd, a unor reaclii
eficiente de apdrare pentru proteclia genotipurilor sensibile. Cercetdrile recente, au stabilit
faptul cd, plantele au capacitatea de a dezvolta rezistenld sistemicd la boli, rezisten{d care
poate fi indusd Din multe puncte de vedere acest sistem de apdrare al plantelor este
comparabil cu r[spunsul organismului uman in cazul vaccindrii, pentru prevenirea unor
infeclii ce produc boli grave.
In acest sens la plante au fost remarcate o serie de substanfe protectoare, produse de
acestea ca rdspuns la infeclia cu diferite microorganisme fitopatogene (virusuri, micoplasme,
bacterii, ciuperci etc.). Aceste substanle au fost denumte fie "elicitori", fie "tonici" ai
plantelor, fie pur Ei simplu "vaccinuri "
Termenul de elicitor este folosit pentru a se face referire la un grup de compugi
structurali care acfioneazd, ca molecule de semnalizare atunci cdnd existd un factor de stres
(secetd, atacul unor agenli patogeni, erbicede etc.). Moleculele acestor substanle se leagd de
proteinele specifice ale receptorilor, localizate in membranele celulare ale plantelor , gener6nd
un rdspuns de apdrare al acestora. Deci elicitorii sunt substanle inductoare de rezistenfd , care
alSturdndu-se r6ceptorilor celulari, prin simularea agentului patogen sau a altui factor de
stres, declanEeazd, mecanismele de proteclie a plantelor qi stimuleazd, producerea de substanle
protectoare. Prin urmare, elicitorii stimuleazd reacfii de apdrare a plantelor, pe baza unui
principiu asemdndtor vaccin[rilor la oameni. Conceptul este simplu gi constd in punerea
preventivd in contact a plantei cu un elicitor capabil de a activa apdrarea naturald a acestora
fald de factorii de stres. Acest elicitor poate fi de origine vegetald (alge, plante sau
microorganisme ), animald ( acizi aminali ), minerale ( oligoelemente) sau sintetice. Cel mai
adesea substanlele de elicitare sunt de tipul fitoalexinelor, fosfolipidelor, fenolilor, enzimelor,
interferonilor etc. Aceste substanle sunt analoge anticorpilor din organismele animele, dar
spre deosebire de aceEtia sinteza lor nu are loc in tot organismul, ci numai in celula infectatd,
ele putdndu-se identifica numai la distantd micd de celulele care le-au sintetizat . Astfel in
timp ce anticorpii animalelor au proprietatea de a precipita numai antigenii care le-au produs
formarea, aparilia acestor substanfe la plante, au ac{iune nespecificd, manifest6ndu-se chiar qi
asupra lesuturilor plantelor care le produc.
Conform celor prezentate mai sus, aceste substanle de elicitare sau elicitori ar putea fi
definili astfel:
Elicitorii sunt compu;i biologici activi , existenli tn extractele de origine vegetald sau
microbiand, care induc reaclii de apdrare cfrnd sunt udministroli unor lesuturi vegetale.
Alte definilii pentu termenul elicitor sunt:
- Substanli care dupd aplicarea pe plantd determind declanqarea mecanismelor sale
naturale de apdrare qi astfel aceasta devine rezistentd fald de un agent patogen fa16
de care in mod normal anterior era sensibild.
- Molecule ce pot provoca plantelor, activarea uneia sau mai multor reaclii de
apdrare ca rdspuns la factorii de stres ( biotic sau abiotic ) rezultAnd o proteclie
fala de aceqtia.
- Substanle naturale sau sintetice, capabile de a induce (sau de a pregdti inducerea)
rezistenlei plantelor tratate f4a de unii bio-agresori
Utllizarea elicitorilor in agricultura ecologicd are drept scop, realizarea de produse
pentru controlul biotehnologic, aplicabil in scopul reducerii consumului de pesticide prin
crearea imunitafli la atacul unor agenli patogeni, conservdrii biodiversitAlii, qi al microflorei

I
 epifitice Ei endofitice, cleEterii qi sigr-rrantei prodr-rselor agro- alimentare, consoliddrii
tolerantei plantelor la condiliile aclverse cle mediu (seceti, salinitate. frig, cald) etc.
In acest context elicitarea, ca reaclie de rezistenfa a plantelor, prezintd un interes
deosebit in reducerea semnillcativi a ac{iunii agenlilor fitopatogeni ce produc boli la plante,
ameliordnd astfel indicii calitativi Ei cantitativi ai producliei. De aceea elicitarea , ca reaclie
de rezistenli a plantelor, a lost intens studiatd in cazul agenlilor fitopatogeni ce apar,tin
bacteriilor qi indeosebi ciupercilor. Aceste studii, au ardtat, cd nu existd un produs chionic
:universal responsabil de reaclia de elicitare la plante. Elicitorul aclioneazd, tn situatii
pafticulare de incompatibilitate qi derivd fie direct de la agentul fitopatogen, fie secundar, ca
rczultat al activitdlii fitopatogenului , dar cu originea in peretele celulei vegetale .

2.2lzolarea, purificarea qi testarea compuqilor fungici de elicitare

Deqi produqii de elicitare pot sd se formeze in urma atacului unei game largi de agenli
patogeni, rdspunsurile de apdrare a plantelor sunt specifice fiecdrei trepte de dezvoltare
sistematice a acestora (virusuri, micoplasme, bacterii, ciuperci etc.) rezistenla fiind indusd ;i
transmisd prin combina{ii ale diferitelor molecule de semnalizare.
De aceea in cele ce urmeazd vom prezenta modul de oblinere a compuqilor fungici de
elicitare (apdrare). in acest caz moleculele semnal vin de la diferite specii de ciuperci extrem
de virulente, ciupercile reprezentAnd grupul cel mai numeros, mai rdspdndit gi mai
pdgubitor de agenli patogeni ai plantelor in general qi a celor de culturd in special.
Pentru objinerea compuEilor fungici de elicitare, respectiv de inducere a rezistenlei
sistemice la diferite specii de plante de cultur5, se parcurg urmdtoarele etape:
a) tzolarea Ei cultivarea de tulpini, aparlindnd unor specii virulente de fungi, pe medii
nutrit ive artificiale ;
b) incubarea tulpinilor de fungi selectate;
c) inocularea tulpinilor fungice seleclionate in mediu lichid de cregtere;
d) oblinerea produsului final de apdrare prin aplicarea procedeelor succesive de filtrare,
microfiltrare gi ultrafiltrare a mediului lichid de creqtere;
e) tratamente cu produsul elicitor, in cultura plantei gazdd .
Izolarea tulpinilo unor specii de ciuperci se realizeaza din diferite organe vegetative
ale plantelor gazdd, (frunze, tulpini, flori, fructe etc.) sau chiar din sol. Operaliunea se
realizeazd, cdt mai aproape de suprafala organului vegetativ infectat al plante. Tulpinile
fungice se cultivd , in eprubete inclinate, pe mediul nutritiv artificial: cartof, dextrozd,, agar
(PDA) Merk, al cdrui pH se corecteazd la la valoarea de 5,6 dupd care se sterrhzeazd. trmp
de 15 minutela 721oC. Aceste culturi se pdstreazd apoi la temperaturi de 2-3 "C.
Incubarea . Pentru creqterea agentului patogen , pe mediu PDA, eprubetele sunt
incubate la termostat la temperatura de 25-27 oC, timp de 30 de ztle.
Inocularea tulpinilor fungice selectionate se face in mediu de cre;tere lichid, care se
prepard dupd urmdtoarea reletd: 9 kg de cartofi, sp61a1i qi decojili se taie in felii subliri de 12
mm, se fierb in apd distilatd in vase de sticld timp de 30 de min, dupd care se strecoard prin
tifon qi se adaugd 20 g zaharozd,ll, amestecdndu-se pdnd cdnd aseasta se dizolvd. in acest
amestec se pun 3 g de biomasd vegetald /1 (sub formd de pulbere oblinutd din uscarea masei
vegetative a plantei gazdd, prin termostatare la 60 de 'C) Biomasa are rol de stimulare a
creEterii tulpinilor fungice. Mediul de creqtere lichid se toarnd in vase de inox prevdzute cu
sistem de agitare mecanicd a confinutului. Dupd realizarca acestui mediu lichid de creqtere,
pH-ul sdu se ajusteazd la 5,6 cu NaOH sau HCl. Acest mediu este menlinut in termostat, la
intuneric, la temperaturi de 25-27 oC timp de21 de zile, fiind agitat mecanic la interval de 12
h timp de 5-7 minute. Inocularea mediului lichid de creqtere, cu tulpinile fungice se
realizeazd, dupd 24 h de la sterilizare, dar acesta poate fi pdstrat la 2-4 oC, maxim 10 zlle
pAnd la inoculare. in acest mediu de cregtere lichid, sunt eliberali compuEii elicitori, cu rol de
semnal de apdrare, reprezentafi de un complex de exometabolili care induc capacitatea de
rezistenld fala de atacul fungilor inoculafi. Calitalile tulpinilor inoculate, influen{eazd
tovat'{€7-i'.'rlit?'/t !itzn76 ?/t t-r,,Ss..t:':;',y'd2- r-/e *{:ri"rtr,re',-n {iw5,*/'cfe9'ter.7)'-z}?-
thrr:l/,t/ /tcfu'd J. .- l,{uPl /
 Obyinerea produsuluifinal. Cultivarea agentului patogen, in mediul lichid prezentat mai
sus. determind eliberarea unui amestec complex de exometabolili specifici, neuniformi ca
stucturd qi greutate moleculard care stimuleazd, reac,tia de apdrare a plantei gazdd, (Fig. 1).
Fracfiile moleculare in care compuqii cu efect elicitor sunt prezenli qi activi, se oblin prin
trecerea succesivd a mediului de cregtere fungicd prin procedee de filtrare, microfiltrare qi
ultrafiltrare tangenliald, oblin6ndu-se un filtrat final (E2). Filtrarea gi microfrltrarea se
realizeazl, printr-o baterie succesivh de cartuqe filtrante care acoperd o arie de separare a
bompuqilor ftrd efect elicitor din mediul de culturd lichid din domeniul 10-103 p pdnd la 1-
10 p, respectiv pentru particule grosiere qi fine din mediul de cultur6 fungicd.
Procedeul de ultrafiltrare permite separarea compuqilor moleculari din domeniul 103 - 10t tr,
responsabili de stabilirea caracterului elicitor. Filtratul colectat se depoziteazd,Ia 4 oC in vase
de plastic inchise etanq la temp de 15 oC, condifii in care iqi pdstreazd stabilitatea timp de 1 pdnd
la 3 luni. Compozilia frltratului reprezintd de fapt compozilia produsului final (filtratul E2),
$rlizat ?n inducerea rezistenlei sistemice a plantelor, fald de agentul pathogen testat.
Compozilia acestui produs conline ca ingredient active: proteine solubile, glucide reducdtoare,
flavonoide, polifenoli, enzime Ei aminoacizi, substanle determinate pri metodologiile clasice.
Produsul final se condilioneazd prin tratare cu CaCOz in conc. lo%.

il icitorl

l.*embrana g3F f -ff1fi

\xtr !r?€E ?
Receptori
pi a sn: ati ce
JL"r&#.S#.# *,s"tg"s*s.at

Raspuns rie aparare

Gen* cle expresie

LJ
C*nrpuri bioactivi

Fig. 1. Formarea compuqilor finali de elicitare

Tratamentele produsul elicitor fungic, perrtru stimularea reacfiei de apdrare a plantelor

cu
gazddse rcalizeazd prin pulverizarea fini cu ajutirul unui atomizor, cu o dispersie de 60-80 p a
particolelor la o distan!6 de 50 de cm deasupra plantelor. Produsul se aplicd preventiv pe planta
gazd6, prin patru tratamente succesive, din care dou6, cu produsul concentrat la interval de
patru zile unui de altul, iar urmdtoarele doud se aplicd cu produsul diluat cu ap6, 50Yolainterval
de doud zile unul de ce151alt. Nu se va aplica produsul in dilufii mai mari sau mai mici decdt
cele recomandate. Acest produs elicitor fungic, nu conline aditivi de tipul inhibitorilor, agenlilor
de imbundtdfire a aderenfei la plante, antispumanfi, coloranfi etc.
In fig. 2 este prezentatd schema practicd de testare a unui elicitor fungic la tomate
(Lycopersicum aesculentum L.). In acest caz, produsul elicitor fungic este oblinut din mediul
cle cultr-rri;ri ciupercit Septoriu lycopersici Speg. pentru mentinere atacuiui acestui agent
patogcn sub pragul economic c1c cl[unare (PED), la uneie genotipuri sensibile.
Prima etopci a teprezentat-o testarea efbctului de elicitare in taza de rdsad a plantelol de
tomate, rezultatele obtinute fiind foarle eficiente qi concludente. Extractele de mono, di ;i
trifosfoinozitoli din mediul unui izolat virulent de Septoria lycopersici au elicitat rezistenla
unor genotipuri sensibile, gradul de atac reducdndu-se de la 80o/o \a plantele infectate artificial
cu rniceliul ciupercii qi netratate cu elicitorul fungic al acesteia, la 20Yo in cazul plantelor
:tratate cu elicitorul fungic al agentului pathogen. In urma acestui experiment rezultd, tbptul cd,
potenlialul genetic de rezistenld la atacul ciupercii Septoria lycopersici, represat in cazul
genotipurilor sensibile, este activat prin intermediul elicitdrii. Se poate aprecia astfel cd
biotehnologia utilizdrii elicitorilor fungici poate constitui o verigd tehnologicd nepoluantd qi
eficientd de combatere a unor agenJi patogeni loarte virulenli, in cadrul practicdrii agriculturii
ecologice.

prec.dTGlA l4{TEslqt.ul,ui Btol-ocllc

Fig. 2. Schema practicl de testare a unui elicitor fungic la tomate

 2.3 Avantajele biotehnologiei elicitorilor fungici in combaterea unor agen{i
patogeni

Ut1lizarca biotehnologiei elicitorilor fungici, in

combaterea unor agenti patogeni la
genotipnrile sensibile de plante cultiwate, prezinld numeroase avantaje, dintre care
mentiondm:
r - tulpinile de ciuperci rzolate prezintd, o relativd stabilitate geneticd;
- stabilitatea tulpinilor fungice permite oblinerea unui produs de protectie a plantelor, cu
proprietdli constante, in condiliile menlinerii parametrilor fizico-chimici;
- izolatele se oblin de pe produse naturale diferite, asigurAndu-se Ei prezenla unor
particularitd!i genetice ;
- nu se introduc specii noi in biotop;
- tulpinile fungice izolate produc exometabolili care intrd ?n compozilia produsului de
apdrare Ei sunt produgi biotici naturali care nu prezintl, efect inhibitor asupra microbiotei
edafice, nu modifici biodiversitatea specificd , sunt netoxici pentru plantd qi nepoluanli pentru
mediu;
- aplicarea produsului de inducere a reacliei sistemice de apdrare a plantei, nu necesitd
condilii speciale, nu necesitd rdnirea plantei, iar cdile de pdtrundere in plantd sunt cele
naturale utilizate in procesele fiziologice normale de respiralie, transpiralie, absor{ie;
- compuqii activi ob1inu1i, prin diversitate Ei complexitate, se adreseazd, unui spectru
larg al receptorilor implicali in inducerea mecanismelor de rezistenld sistemicd la plante;
- aplicarea produsului se face prin dispersie avansatd., fapt ce permite acoperirea unor
suprafele mari, un consum eficient ;i pierderi reduse;
- produsul conline cantitdli foarte mici de compusi activi, dar care sunt suficiente
pentru a sensibiliza membrana citoplasmeticd;
- nu se utrhzeazl biomasa fungicd qi nici procedee tehnice de prelucrare a acesteia;
- efectul produsului asupra plantei este sistemic, se menline in timp gi nu necesitd
repetarea aplicdrii lui dupa precipitalii;
- aplicarea produsului nu influenjeazd. calitatea biologicd a producliei, ci capacitatea de
rezistenld la infectare a produselor agricole depozitate, in absenla aplicdrii de conservanli deci
asigurd proteclia intregii plante, cu efecte care se extind post-recoltare;
- produsul prezintd, compatibilitate ecologicd cu alte produse care indeplinesc cerinlele
de oblinere a etichetei de utilizare in agricultura ecologicd;
- asigurd proteclie impotriva agenlilor patogeni care nu pot fi controlali prin metode
clasice, indeosebi este eficient impotriva acelor agen{i patogeni care prezintd rezistenld la
pesticidele chimice;
- aplicarea lui poate fi asociatd cu stategiile clasice (fungicide) de cornbatere, pentru a
oferi o mai bund acoperire protectivd a plantelor la infecfii;
- asigurd compatibilitatea cu aplicafiile de reintrare in circuit din agricultura durabild.
Bibliografie

l. Beklas, E., Yasemin, H., Eulgern, C., ThomaS ,C., 2015. Elicitore sintetice di
defense dipiante. Plant. Phisiology 5: 804-809.
2. Cogdlniceanu, G., Mitoi, M., Helepenic, F., MaCtei, M., Matei, S., 2010.
Biochemical changes induced in regenerants of Fragaria x Ananassa Duch by the
in vitro treatment with fungal elicitors. Romanian Biotechnilogical Letters - vol.
75,nr.4, pp 5512-5518.
a
J. Dufour, M.C., 2077, Etude de I' efficacite des defenses de differents genotipes de
Vitis induites par elicitation face a la diversite genetique de bioagreseurs
( Plasmopara viticola et Erysiphe necator ) du gene au champ. Physiologia
plantorum ll9 ( 4) 207- 221
4. Fardeau, i.C., Jonis. M., 2003, Phy'tostimulants et eliciteurs poLlr vegetaux :

proprieties et guaranties reglementaires Seminaire sur les recherches en

agriculture biologique . INRA. ACTA, Draveil, 20-21november
5. Larkin Ansen, A., 2010. The organic Farming Manual. P 413.
6. Lateur, M., 2002, Perspectives de lute contre les maladies des arbres fiuitiers a
pepins au moyen de substances naturelles inductrices d'une resistance
systematique. Biotechnologie, agronomie, Societe et Environnement. Vol 6, no 2,
pp 67-77
l. Losano, P.,Nasir, D.,Lins, M.N., Jijakli, L., Fauconnier, H., Ongena, L. M., Deleu,
M., 2076, Interaction des rhamnolipides eliciteurs de Pseudomonas aeruginosa
avec des membranes modeles de plantes. Paper presented at Journee Jeunes
Chercheurs . Condorcet-Reims- France
8. Matei, S., Matei, M., Cogdlniceanu, G., Brezeanu, A., Carasan, M., Helepciuc F.,
2010. In vitro systems for the study of plantdefense respons induced by fungal
elicitors. Ed. Sitech CraiovapT3.
9. Matei, M., Massimo, E., Arimura, Gen-Ichiro., Axel, A., 2072. Elicitori naturali,
efectori qi modulatori ai rdspunsurilor plantelor. Produsul natural. Rapoartele 29
(11) pp. 1269- 1368.
10. Martinez, C., Besnard, O., Baccou, J.C., 7999, Stimulation des deffenses
naturelles des plantes. Cellulases et proteases d'origine biologique: deux exemples
d' eliciteurs. Phytoma no. 521 16-19
11. Pajot,8,2011, Stimulateurs des defenses naturelles des plantes, etat des lieux et
perspectives de recherche et developpement pour securiser leur efficacite sur
terrain. Phytoma no 4I2 : 102-117.
12. Pautot, V., Roboglia, C. Pernollet, J.C., lgg2,Laresistance des plantes aux agents
pathogens. Phytorna no. 521,10-15