UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE VICTOR BABEȘ

TIMIȘOARA
MASTER FORMULAREA ȘI EVALUAREA PRODUSULUI DERMATO-
COSMETIC

Studii experimentale privind efectele farmacodinamice ale

unor extracte vegetale in procesele inflamatorii- rezultate
preliminarii

STUDENT

SONIA-ARLEZIANA CĂ RUNTU
Studii experimentale privind efectele farmacodinamice ale unor extracte
vegetale in procesele inflamatorii- rezultate preliminarii

Metode experimentale in vitro

Linia celulară Caco-2 si tratamentul acesteia cu tincturile mama.
Principiul metodei
Elementele cheie in tehnica culturilor celulare sunt mediul de cultură, condițiile de incubare,
densitatea de creștere, asepsia.
Mediile de cultură pot fi medii naturale: fluide biologice (plasma si serul sanguin, limfa, ser din
cordonul placentar, lichid amniotic), extracte tisulare (extract hepatic, splenic, tumoral, maduva
hematopoietica, embrioni de vitel sau pui) cheagurile din plasma sanguina. Medii artificiale, care
se obtin prin suplimentarea unor medii bazale cu extracte naturale, de tipul serului fetal de
vitel și medii sintetice, care sunt formulate in intregime utilizand substante chimice si nu contin
suplimente naturale.
Mediile naturale reproduc foarte bine conditiile fiziologice si necesarul metabolic al celulelor.
Principalul dezavantaj al acestora este accesibilitatea sursei si reproductibilitatea compozitiei.
Mediile artificiale sunt cele mai ieftine si cele mai uzuale. Pot sustine cresterea mai multor tipuri
de celule. Ca dezavantaj – cunoasterea incompleta a compozitiei serului fetal Mediile sintetice
nu contin adausuri naturale, au o compozitie foarte complexa si bine cunoscuta, reconstituita prin
adaugarea de hormoni, factori de crestere, lipoproteine si alte molecule, cu efecte tintite pentru
cresterea a unui anumit tip de celule. Ca dezavantaj – foarte scumpe si specifice pentru o singura
categorie de celule.
Principalul compus, care modifica valoarea pH in cultura de celule este CO2, produs ca urmare a
metabolismului celular. Eliberarea CO2 din mediu, duce la alcalinizarea mediului, dar in acelasi
timp, in mediu apos, CO2 reactioneaza cu H2O2 , producand acid carbonic, care reduce pH-ul
mediului de cutura. Pentru evitarea modificarii pH-ului prin aceste mechanisme, mediile de
cultura sunt prevazute cu sisteme tampon, specifice, in functie de conditiile de incubare vizate.
Majoritatea mediilor de cultura contin indicator de pH Rosu-fenol.
Sistemul tampon pe baza de NaHCO3 are la baza echilibru gazos al CO2 din conditiile de
incubare si continutul de CO3/HCO3 din mediul de cultura
Conditii de incubare cu atmosfera de 5-10% CO2. Sistem tampon pe baza compozitie in
aminoacizi bazici, mediu L-15, conceput de Leibovitz, are un pH de 7.8, care in lipsa CO2 nu
este deposit. Sistemul tampon de tip chimic, prin folosirea zwiterionilor (molecule, care contin in
acelasi timp, atat grupari acide, cat si grupari alcaline)– HEPES (acid 4-(2-hidroxietil )-1
piperazineetanesulfonic)– MOPS-ului (acid 3-(N-morfolino)propanesulfonic).
Multiplicarea celulelor in cultura duce la epuizarea substantelor nutritive din mediu de cultura si
acidifierea acestuia. Multiplicarea celulelor duce la epuizarea suprafetei de crestere, ceea ce duce
la oprirea diviziunilor prin mecanismul “inhibitiei de contact” in cazul culturilor primare si a
liniilor celulare normale. Intretinerea liniilor celulare in cultura are loc prin schimbarea
perioadica a mediului de cultura.Frecventa de schimbare a mediului depinde de tipul celulelor
(viteza de multiplicare). In cazul celulelor transformate, cu o crestre rapida, pasajul celular se
face la aproximativ fiecare 4-5 zile, iar schimbarea mediului se face la 2-3 zile. In cazul celulelor
cu o crestere lenta pasajul se realizeaza la fiecare 2,3 sau chiar 4 saptammani, iar schimbarea
mediului intre perioadele de subcultivarese face saptamanal.
Mod de lucru
În cadrul acestui studiu a fost utilizată linia celulară de enterocite Caco-2 (American Type Cell
Culture, ATCC; cod CCL-2102), obtinută din colon. Linia celulară a fost menținută la 37 0C in
atmosferă umedă cu 5% CO2 si cultivată in mediul de cultură DMEM cu 10% ser fetal bovin.
Obținerea lizatului celular.
Lizatele celulare obținute în urma tratamentului cu tincturile vegetale au fost dezgheţate şi au
fost sonicate pe gheaţă, timp de 30 secunde de 3 ori cu sonicatorul UP50H Hielscher-Ultrasound
Technology. Probele au fost centrifugate timp de 10 minute la 40C, la 5000 rpm, iar
supernatantul a fost alicotat şi păstrat la -800C în vederea analizării principalilor markeri ai
stresului oxidativ.
Determinarea concentrației proteice prin metoda Bradford.
Principiul metodei
Dozarea proteinelor prin metoda Bradford are la bază recția de culoare dintre reactivul Bradford
și proteine. Compusul colorat are culoarea albastră. Intesitatea culorii este direct proporțională cu
cantitatea de proteine din probă.
În funcție de tipul de probă se realizează
- Degresarea probei
- Precipitatea proteinelor
- Extracția proteinelor (soluție apoasă)
- Dializa extracției
- Ruperea membranei (celulelor, microorganismelor)
- Păstrarea proteinei în soluție la -18 °C sau la -80 °C pentru păstrare mai îndelungată
Din soluția de analizat se prelevă câte 5 µL din fiecare probă, la care se adăugă 250 µL
reactiv Bradford. Probele sunt incubate la temperatura camerei minim 5 minute, maxim 1
oră. Se citește absorbanța la 959 nm. Cantitatea de proteină se calculeaza conform curbei de
calibrare.
Trasarea curbei etalon
Din soluţia stoc de standard de BSA se fac diluţii în tuburi Ependorf de 2 mL după cum
urmează: În cuve de 1mL se pipetează din fiecare soluţie standard câte 5 µL şi 250 µL reactiv
Bradford. Se incubează la temperatura camerei minim 5 minute, maxim 1 oră. Se setează
spectrofotometrul la 595 nm. Se setează instrumentul la zero cu proba blanc. Se măsoară
absorbanţa standardelor şi s-a trasat curba etalon.
Mod de lucru
Concentraţia proteică a lizatelor celulare a fost determinată cu ajutorul reactivului Bradford,
utilizând ca standard o soluţie de albumină serică bovină (BSA) 3 mg/mL. Într-o placă cu 96
godeuri s-au pipetat 250 µL reactiv Bradford şi 5 µL din lizatul celular (diluat corespunzator).
După 15 min de incubare la întuneric, s-a determinat absorbanţa probelor la 595 de nm cu
ajutorul unui cititor de plăci FlexStation 3 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices
LLC).
Evaluarea viabilitatii celulare prin testul MTT.
Principiul metodei
Testul de viabilitate cel mai frecvent utilizat în întreaga lume este testul MTT, descris inițial de
Tim Mosmann în 1983. Acest test colorimetric utilizează reducerea unei sări galbene de
tetrazoliu (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5 bromură de difeniltetrazoliu sau MTT) pentru a măsura
activitatea metabolică celulară ca „proxy” pentru viabilitatea celulară. Celulele viabile conțin
enzime de oxidoreductază dependente de NAD (P) H, care reduc reactivul MTT la formazan, un
produs cristalin insolubil cu o culoare violet profundă. Forma de cristale de formazan se dizolvă
apoi folosind o soluție de solubilizare și se măsoară absorbanța la 500-600 nanometri utilizând
un cititor de plăci. Cu cât soluția este mai întunecată, cu atât este mai mare numărul de celule
active viabile din punct de vedere metabolic.
Efectuarea unui test MTT este destul de ușoară, dar pot fi capcane dacă nu este familiarizat cu
protocolul. Mai jos este o scurtă descriere a pașilor:
1. Se plachează 1000-100.000 celule pe godeu pe o placă cu 96 de godeuri și se incubează
cu stimulul adecvat pentru timpul dorit (de obicei 6-48 ore).
2. Se îndepărtează mediul și se spălă celulele cu PBS.
3. Se adaugă MTT realizat în mediu până la o concentrație finală de 0,5 mg / ml.
4. Se incubează timp de 30 minute până la 4 ore la 37 ° C, până când cristalele de formazan
violet intracelular sunt vizibile sub microscop.
5. Îndepărtați MTT și adăugați soluția de dizolvare și triturați.
6. Se incubează la temperatura camerei sau la 37 ° C timp de 30 minute până la 2 ore, până
când celulele se lizează și se dizolvă cristalele violet.
7. Măsurați absorbanța la 595 nanometri
Mod de lucru
Determinarea viabilităţii celulare a fost realizată cu ajutorul testul colorimetric MTT (bromură de
3-(4,5-dimetitiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu) (Mossman, 1983). Această metodă constă în
reducerea compusului MTT de culoare galbenă, la cristale de formazan violet, de către enzimele
(succinat dehidrogenaze mitocondriale – NAD(P)H dependente) celulelor active metabolic.
Formazanul este apoi solubilizat cu izopropanol 100%, iar concentraţia este determinată
spectrofotometric la lungimea de undă 595 nm. Mediul de cultură a fost îndepărtat din fiecare
godeu şi s-a adăugat câte 0.5 ml de MTT 1 mg/ml. După 2 ore de incubare la 37 oC în incubator
s-a înlăturat soluţia de MTT şi cristalele de formazan au fost solubilizate cu 0.5 mL de
izopropanol per godeu. Absorbanţa a fost citită la 595 nm la un cititor de plăci FlexStation 3
Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices LLC).
Determinarea nivelului speciilor reactive de oxigen (ROS) în prezenţa 5,6-carboxi-
2’7’diclorofluorescein-diacetat la nivelul liniei celulare Caco-2.

Principiul metodei

Inflamația și stresul oxidativ sunt procese pato-fiziologice legate strâns, care apar simultan în
multe afecțiuni bolnave. Recent, interdependența dintre aceste două procese explică paradoxul
antioxidant asociat cu eșecul de a selecta agenții adecvați necesari pentru prevenirea bolilor
cunoscute a fi induse de stresul oxidativ

Specii de oxigen reactiv- Reactive oxygen species (ROS) este o frază folosită pentru a descrie
un număr de molecule reactive și radicali liberi derivați din oxigenul molecular.

Producția de radicali pe bază de oxigen este o problemă pentru toate speciile aerobe.

Aceste molecule, produse ca produse secundare în timpul transportului de electroni mitocondriali

de respirație aerobă sau de enzime oxidoreductază și oxidare catalizată de metal, au potențialul
de a provoca un număr de evenimente dăunătoare.

Se credea inițial că numai celulele fagocitare erau responsabile pentru producerea ROS ca parte a
lor în mecanismele de apărare a celulelor gazdă. Studii recente au demonstrat că ROS au un rol
în semnalizarea celulară, inclusiv; apoptoza; expresia genelor; și activarea cascadelor de
semnalizare celulare . Trebuie remarcat faptul că ROS poate servi atât ca mesageri intra cât și
intercelulari.

Mod de lucru

Detecţia speciilor reactive de oxigen intracelulare a fost evaluată cu compusul fluorescent 5,6-
carboxy-2’7-dichlorodihydrofluorescein-diacetat (carboxy-DCFDA) conform instrucţiunilor
furnizate de producator (Invitrogen-Molecular Probes). Soluţia stoc de 10 mM carboxy-DCFDA
în DMSO a fost diluată pană la o concentraţie de 25µM în tampon Hank’s Balanced Salt
Solution (HBSS). Pentru măsurarea nivelului de specii reactive de oxigen, celulele au fost
însămânţate în plăci cu 6 godeuri şi incubate în condiţii de creştere timp de 24 si 48 de ore. După
tratamentul cu tincturile luate in studiu, celulele au fost incubate 45 min la 37°C cu carboxi
H2DCFDA 10 µM. Mediul în care a fost pus compusul a fost apoi îndepărtat şi celulele au fost
spălate de 2 ori cu tampon HBSS. Intensitatea fluorescenţei a fost citită la 495 nm excitaţie şi
529 nm emisie la un cititor de plăci FlexStation 3 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular
Devices LLC).

Dozarea concentraţiei malondialdehidei (MDA).

Principiul metodei
O metodă precisă şi des utilizată pentru monitorizarea peroxidarii lipidice utilizează ca substanţă
reactivă acidul tiobarbituric (TBA). Aducţii MDA-TBA formaţi în urma reacţiei dintre MDA
existent în proba biologică şi TBA la 37oC pot fi măsuraţi fluorimetric (λ excitare =520 nm, λ
emisie = 549nm).
S-a utilizat ca standard de malondialdehidă o soluţie de 1,1,3,3-tetrametoxipropan 1 mM, din
care s-au realizat diluţii cu concentraţii cuprinde între 0 şi 0.5 mM, diluţii realizat în soluţie de
HCL 0,1N. După adăugarea a 700 µL HCl 0,1M atât la diluţiile care alcătuiesc curba de calibrare
MDA, cât şi la probele care conţin lizate celulare, s-a omogenizat bine şi s-a lăsat în repaus la
temperatura camerei timp de 20 de minute. Apoi s-au adăugat 900 µL TBA 0,025 M şi s-a
incubat 65 de minute la 37oC, timp în care s-au format produşii TBA-MDA. La soluţiile
preparate în cadrul curbei etalon MDA şi la probele lizate s-au adăugat 400µL de PBS, respectiv
400 µL BSA preparată în PBS (concentraţia BSA este fixată în funcţie de concentraţia proteică a
probelor). În urma citirii fluorescenţei fiecărui amestesc de reacţie preparat la fluorimetrul Jasco
FP-6300 s-a obţinut un grafic în care s-a reprezentat concentraţia MDA în funcţie de fluorescenţa
aferentă diluţiilor din soluţia standard MDA. Pe această curbă etalon obţinută s-a realizat o
extrapolare pentru valorile fluorescenţei măsurată în unităţi de fluorescenţă relativă (RFU) pentru
probele obţinute din lizatele celulare, determinându-se astfel concentraţiile MDA conţinute de
acestea. Evaluarea gradului de peroxidare lipidică în fiecare probă de lizat celular s-a făcut prin
raportarea nivelului concentraţiei de MDA obţinută în urma dozării la concentraţia proteică a
probelor.

Dozarea concentrației de glutation redus.

Glutationul este un tripeptid format din acid glutamic, glicina si cisteina. Este cel mai abundent
tiol intracelular cu greutate moleculara mica, 85-90% fiind prezent in citosol, iar restul in diverse
organite: mitocondrii, reticulul endoplasmatic, peroxisomi, matrice nucleara. [ CITATION Naz09 \l
1048 ]

In celula glutationul exista in principal (>98%) in forma tiolica redusa (GSH), dar datorita
reziduurilor de cisteina care pot fi usor oxidate nonenzimatic de diferite substante electrofile
(radicalii liberi, speciile reactive de oxigen si azot) este, de asemenea, prezent in forma oxidata
ca disulfit glutation (GSSG). Dupa sinteza, este distribuit la nivelul compartimentelor
intracelulare si in spatiul extracelular pentru utilizarea de catre alte celule si tesuturi. Raportul
GSH/GSSG este folosit ca un indicator al starii redox celulare si are in conditii fiziologice o
valoare >9. Cu exceptia acizilor biliari, care pot contine pana la 10 mmol/L GSH, concentratiile
extracelulare de GSH sunt relativ scazute (2-20 mol/L in plasma) [ CITATION Naz09 \l 1048 ]

Mod de lucru – Determinarea concentraţiei de glutation redus (GSH) s-a realizat cu kitul
Glutathione Assay Kit de la Sigma. Metoda presupune o analiză în care GSH determină o
reducere a 5,5’-ditiobis-2 nitrobenzoic acid (DTNB) cu formarea acidului 5-tio-2 nitrobenzoic
(TNB). Rata reacţiei este proporţională cu concentraţia glutationului până la 2 µM. Lizatele
celulare au fost deproteinizate cu 5% acid 5-sulfosalicilic (SSA) (1:1) şi centrifugate la 3000 x g
timp de 5 minute la 4oC pentru a îndepărta proteinele precipitate. Din supernatantul obţinut au
fost preluaţi 10 µL, peste care s-au adăugat 150 µL de mix realizat din 8 ml de soluţie tampon
(tampon fosfat de potasiu 100 mM, pH 7; EDTA 1mM) şi 228 µL DTNB 1,5 mg/ml. Absorbanţa
produsului galben obţinut în urma acestei reacţii a fost măsurată la 412 nm la spectrofotometrul
Tecan Genious. Drept standard s-a utilizat o curbă de calibrare realizată cu GSH 50 µM pentru a
determina concentraţia glutationului din probe. Pentru calcularea numărului de nmoli GSH din
probele de analizat s-a realizat o extrapolare pe curba cu standardul de GSH, iar rezultatele au
fost exprimate în nmoli/mg proteină.

Determinarea activitatii ciclooxigenazei 2 (COX-2).

Principiul metodei
Ciclooxigenaza (COX) este o enzima bifunctionala care exprima atat activitate ciclooxigenazica
cat si peroxidazica. Exista 2 forme distincte ale acestei ciclooxigenaze: COX-1 si COX-2.
Ciclooxigenaza-2 este o enzima cheie in conversia acidului arahidonic la prostaglandine (PG) si
alte eicosandoide cum sunt PGE2, PGD2, PGF2α, PGI2 si tromboxan A2. COX-1 este prezent
aproape in toate celulele in timp ce COX-2 este in mod normal nedetectabil dar este indus in
inflamatie si cancer.COX-2 este responsabila pentru biosinteza prostaglandinelor in conditii de
inflamatie acuta.
Mod de lucru- În vederea determinarii activitatii ciclooxigenazei COX-2 s-a urmărit
optimizarea protocolului de lucru utilizand instructiunile producatorului (BioVision). Mai întâi, s-
a realizat o curbă standard utilizand Resorufina (1µM-1pmol/µL), având concentraţii cuprinse
între 0 şi 20 pmol/godeu (şi anume: 0, 4, 8, 12, 16 şi 20 µL) setând cititorul automat de plăci
FlexStation 3 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices LLC) la următoarele lungimi
de undă: 535 nm excitaţie şi 587 nm emisie. Dupa adaugarea acidului arahidonic s-a citit
valoarea fluorescenţei din 15 in 15 secunde timp de 30 minute pentru a se determina cea mai
potrivită perioadă de înregistrare a fluorescenţei. Pe baza acesteia a fost calculată ecuaţia dreptei,
şi selectate concentraţiile care respectau liniaritate. Pe scurt, pentru a masura activitatea COX-2
se urmaresc urmatoarele etape. Un volum de 20 µl lizat celular (celule tratate cu diferite
concentratii de tincturi) se amestecă cu 88 µl mix de reactie care contine Cofactor COX si
inhibitor COX-2 (Celecoxib). Pentru a iniția reacția se adăuga o soluție diluată de acid
arahidonic / NaOH, apoi se citeşte imediat valoarea fluorescenţei (RFU) din 15 în 15 secunde
timp de 30 minute. Ca si control pozitiv se foloseşte dimetilsulfoxid (DMSO). Calculul
rezultatelor se realizează folosind următoarea formulă:
Activitatea COX= B/ ΔT x M (pmoL/min.mg); unde B-reprezinta cantitatea de resorufină din
curba standard (pmol); ΔT ( timpul de incubare -min.); M este cantitatea de proteină adăugată în
godeul de reacție (mg).

Rezultate

Rezultate experimentale model in vitro

Evaluarea viabilitatii celulare prin testul MTT.În vederea evaluării viabilitatii celulare la
nivelul liniei celulare Caco-2, celulele au fost tratate timp de 12, 24, respectiv 48 de ore cu
diferite concentraţii de tincturi. Rezultatele obţinute în urma testului MTT (Figurile 12) a pus în
evidenţă valori ale viabilităţii celulare apropiate de cele ale controlului pentru tinctura obţinute
din Thuja occidentalis indiferent de timpul de incubare.
Figura 1 Viabilitatea celulară evaluată prin testul MTT după incubarea celulelor intestinale Caco-2 timp de 12, 24 şi 48
ore cu diferite concentraţii (5, 25, 50 şi 100 µg/ml) de Thuja occidentalis.

Determinarea nivelului speciilor reactive de oxigen (ROS) în prezenţa 5,6-carboxi-

2’7’diclorofluorescein-diacetat la nivelul liniei celulare Caco-2.

În ceea ce privește generarea speciilor reactive de oxigen (ROS) în urma tratamentului cu

tinctura vegetală s-a observat că, atât în prezența cât și în absența agentului oxidant, nivelul ROS
rămâne la nivelul controlului (Figura 13).

Figura 13. Analiza speciilor reactive de oxigen (ROS) la nivelul celulelor intestinale Caco-2 în
urma tratamentului cu tinctura Thuja occidentalis la concentrații de (25 si 100 µg/mL) pentru
diferite intervale de timp (24 si 48 de ore). Barele verticale reprezintă deviaţia standard.

Dozarea concentraţiei malondialdehidei (MDA). În urma tratamentului cu tinctura selectată s-

au inregistrat cresteri semnificative ale nivelului de MDA (cu aproximativ 20%) pentru tinctura
de Thuja occidentalis (Figura 14) dupa intervalul de 48 de ore în absența agentului oxidant, în
timp ce, în prezența agentului oxidant nivelul MDA revine la nivelul controlului. Ȋn cazul
celorlalte tincturii selectate nivelul MDA se mentine aproape de nivelul controlului atat în
absența, cât și în prezența agentului oxidant.

24h
Thuja occidentalis 48h
250
Nivelul relativ MDA (%)

200

150

100

50

0
Control T25 T100 C H2O2 T25+... T100+...
Figura 14 Nivelul MDA la nivelul celulelor intestinale Caco-2 în urma tratamentului cu tinctura Thuja occidentalis la
concentrații de (25 si 100 µg/mL) pentru diferite intervale de timp (24 si 48 de ore). Barele verticale reprezintă deviaţia
standard.

Dozarea concentrației de glutation redus (GSH) În urma tratării celulelor Caco-2 cu tinctura
selectată (Figura 15) s-au inregistrat usoare cresteri ale nivelului de GSH după intervalul de 24
de ore la toate concentrațiile luate în studiu (atât în absența cât și în prezența agentului oxidant),
în timp ce, la 48 de ore nivelul GSH rămâne aproape de control. Ȋn cazul celulelor tratate cu
tinctura Thuja occidentalis (Figura 15) nivelul de GSH scade usor (cu 10 %) dupa intervalul de
24 de ore (atât în prezența cât și în absența agentului oxidant), in timp ce, dupa intervalul de 48
de ore revine la nivelul controlului.

Figura 15 Concentratia de GSH la nivelul celulelor intestinale Caco-2 în urma tratamentului cu cu tinctura Thuja
occidentalis la concentrații de (25 si 100 µg/mL) pentru diferite intervale de timp (24 si 48 de ore). Barele verticale
reprezintă deviaţia standard.

Efectele tincturii mama de Thuja occidentalis asupra unor paramatrii biochimici

Activitatea aspartat aminotranferazei (AST) si alanil aminotranferazei (ALT) serice, a
gamaglutamil transferazei (GGT), a lactat dehidrogenazei serice (LDH) si a creatininei serice au
fost evaluate spectrofotometric utilizând kituri comerciale pe un analizor automat de biochimie
Mindray, conform instrucțiunilor de producător.
Analiza markerilor hepatici (transaminaze si GGT) (Figura 9), cât și a creatininei serice
(Figura 10), ne relevă faptul că nu sunt modificări semnificative, ceea ce ne indică faptul că atât
funcția hepatică și cea renală nu sunt afectate de administratea substanței toxice (TNBS) si nici a
tincturilor de Thuja occidentalis, mai ales având în vedere faptul că toxicul a fost administrat pe
cale rectală, neavând metabolizare hepatică.
 Activitatea transaminazelor serice (TGO si TGP) si a GGT după tratamentul colitei
Figura 2
cu tinctura de Thuja occidentalis. *p<0,05 faţă de control.

În schimb, activitatea LDH (Figura 10) este semnificativ crescută în cazul grupului căruia
i s-a administrat rectal substanța toxică (TNBS) comparativ cu martorul (p<0,05) și se menține
crescută după administrarea dozei de 5mg/kg de tinctură de Thuja occidentalis. Dozele cele mai
mari (25 si 50 mg/kg) au restabilit activitatea LDH la nivelul martorului.

Figura 3Activitatea
creatininei (CREA) şi lactat dehidrogenazei (LDH) serice după
tratamentul colitei cu tinctura de Thuja occidentalis. *p<0,05 faţă de control.

Discuții
Studiul prezent a fost efectuat pentru a investiga efectul anti-inflamator al extractului de Thuja
occidentalis in vitro asupra celulelor Caco 2, precum si in vivo asupra severității colitei induse de
TNBS la șoareci.

Extractele din plante au devenit un domeniu din ce în ce mai studiat și cercetat. De exemplu,
potențialul imunofarmacologic a speciei Thuja occidentalis, a fost adesea demonstrat atât în
studii effectuate in vitro cât și in vivo. TIncturile sau substanțele foarte diluate sunt mai puțin
studiate dar există un interes in creștere in cazul acestor formulari datorită costului lor redus și a
eficienței biologice. Bellavite și colab. au menționat in 2006, studii ce conțineau cercetare
fundamentală asupra celulelor sistemului imunitar si a inflamației. Noi am testat tinctura mamă
de Thuja occidentalis găsind că prezintă răspunsuri diferite când este testată în diferite doze.
Am utlizat pentru modelul experimental in vitro , linia celulară Caco-2 si tratamentul acesteia cu
tinctura mama, am urmărit obținerea lizatului cellular în urma tratamentului cu tinctura vegetală
de Thuja occidentalis. Determinarea viabilităţii celulare a fost realizată cu ajutorul testului
colorimetric MTT iar concentraţia proteică a lizatelor celulare a fost determinată cu ajutorul
reactivului Bradford. Detecţia speciilor reactive de oxigen intracelulare a fost evaluată cu
compusul fluorescent 5,6-carboxy-2’7-dichlorodihydrofluorescein-diacetat (carboxy-DCFDA).

Oliveira și colab., 2011 abordează într-un articol, dezvoltările asupra descoperirilor de

medicamente și pe noi ‚ținte terapeutice ca tincturile diluate care se comportă ca modificatori ai
răspunsului biologic. In acest studiu ei testează un anumit număr de tincturi diluate (Aconitum
napellus, Arsenicum album, Conium maculatum, Echinaceaea purpurea), printe care și Thuja
occidentalis evidențiând faptul că acestea prezintă diferite răspunsuri când sunt testate în diferite
concentrații.

Efectele tincturilor au fost investigate in trei combinații pe celule umane și de șoareci. Au

determinat viabilitatea celulară și ciclul celular in urma tratamentului in vitro, folosind linia
celulară K562, HT-29 și macrofage pentru a determina dacă tratamentul ar putea induce
apoptoză și/sau modificări în ciclul celular. Au concluzionat că niciuna dintre tincturile
investigate nu prezintă efecte citotoxice nici nu au afectat ciclul celular.
Bibliografie
1. A. Akcan, C. Kucuk, E. Sozuer, D. Esel, H. Akyildiz, H. Akgun, S. Muhtaroglu, Y. Aritas, Melatonin
reduces bacterial translocation and apoptosis in trinitrobenzene sulphonic acid-induced colitis of rats
World J. Gastroenterol., 14 (2008), pp. 918-924
2. Aya M. Westbrook, Akos Szakmary , Robert H. Schiestl, “Mechanisms of intestinal inflammation
and development of associated cancers:Lessons learned from mouse models”- Mutation Research
705 (2010) 40–59
3. C. Becker, A.J. Watson, M.F. Neurath Complex roles of caspases in the pathogenesis of
inflammatory bowel disease Gastroenterology, 144 (2013), pp. 283-293
4. Buchwalow I., Werner Bocker, Immunohistochemistry Basics and Methods- Springer 2010

5. Burisch J., Tine Jess , Matteo Martinato , Peter L. Lakatos, “The burden of inflammatory bowel
disease in Europe”, Journal of Crohn's and Colitis (2013) 7, 322–337
6. Baran D. 1991. Arbor vitae, a guarantee of health. Revista Medico-Chirurgicala a Societatii de
Medici si Naturalisti din Iasi, 95:347–9.
7. Berlin J, Witte L, Schubert W, Wray V. 1984. Determination and quantification of monoterpenoids
secreted into the medium of cell cultures of Thuja occidentalis. Phytochemistry, 23:1277–9.
8. Biswas R, Mandal SK, Dutta S, Bhattacharyya SS, Boujedaini N, Khuda-Bukhsh AR. 2011. Thujone-
Rich Fraction of Thuja occidentalis Demonstrates Major Anti-Cancer Potentials: Evidences from in
vitro Studies on A375 Cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2011:16.
9. British Herbal Pharmacopoeia. 1983. Thuja. British Herbal Medicine Association, West Yorks, UK,
210–1.
10. Chang LC, Song LL, Park EJ, et al. 2000. Bioactive constituents of Thuja occidentalis. Journal of
Natural Product, 63:1235–8.

11. R.K. Cross, K.T. Wilson Nitric oxide in inflammatory bowel disease Inflamm. Bowel Dis., 9 (2003),
pp. 179-189
12. Dev SK, Shukla A, Choudhury PK, Singh GK. 2015. Analgesic and anti-nociceptive activity of
hydroethanolic extract of Capparis decidua Linn. Asian Journal of Pharmacy and Pharmacology,
1(1): 40-44.
13. Diculescu, M. Boala Crohn în practica clinică, . (Editura Cartea Universitară, Bucureşti, 2003).
14. Dubey SK, Batra A. 2008. Hepatoprotective activity from ethanol fraction of Thuja occidentalis Linn.
Asian Journal of Research in Chemistry, 1:32–35.
15. Dubey SK, Batra, A. 2009. Antioxidant activity of Thuja occidentalis linn. Asian Journal of
Pharmaceutical and Clinical Research, 2: 73–76.
16. Agustina Tri Endharti,corresponding author1,2 Adisti Wulandari,2 Anik Listyana,2 Eviana
Norahmawati,3 and Sofy Permana, Dendrophthoe pentandra (L.) Miq extract effectively inhibits
inflammation, proliferation and induces p53 expression on colitis-associated colon cancer, BMC
Complement Altern Med. 2016; 16: 374.

17. C. Fiocchi Inflammatory bowel disease: etiology and pathogenesis Gastroenterology, 115 (1998), pp.
182-205

18. Gheorghe, C. et al. Epidemiology of inflammatory bowel disease in adults who refer to
gastroenterology care in Romania. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 16, 1153–1159 (2004).

19. Greenstein, A. J., Sachar, D. B., Smith, H., Janowitz, H. D. & Aufses, A. H., Jr. A comparison of
cancer risk in Crohn’s disease and ulcerative colitis. Cancer 48, 2742–2745 (1981).
20. Gillen, C. D., Walmsley, R. S., Prior, P., Andrews, H. A. & Allan, R. N. Ulcerative colitis and
Crohn’s disease: a comparison of the colorectal cancer risk in extensive colitis. Gut 35, 1590–1592
(1994).
21. Hansel R, Keller R, Rimpler H, Schneider G. 1994. Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis:
Drogen P -Z (Thuja), 5th edn. Springer Verlag, Berlin, pp 955–66.
22. Harnischfeger G, Stolze H. 1983. Bewährte Pflanzendrogen in Wissenschaft und Medizin. Notamed
Verlag, Bad Homburg/Melsungen, pp 250–9.
23. Kappelman, M. D. et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn’s disease and ulcerative
colitis in the United States. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 5, 1424–1429 (2007).
24. Kiesler P., Ivan J. Fuss, and Warren Strober, “Experimental Models of Inflammatory Bowel
Diseases”,CMGH,2015.
25. Kokate CK. 1999. Ed.Practical pharmacognosy. 4th ed. Vallabha Prakashan, New Delhi. pp. 149-56.
26. Kumar V, Singh PN, Bhattacharya SK. 2001. Anti- inflammatory and analgesic activity of
Indian Hypericum perforatum L. Indian Journal of Experimental Biology, 19: 339-343. 

27. Loftus, E. V. Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease: incidence, prevalence, and
environmental influences. Gastroenterology 126, 1504–1517 (2004).

28. Madaus G. 1938. Lehrbuch der Biologischen Heilmittel. Vol. III. Thuja occidentalis. Thieme Verlag,
Leipzig, pp 2698–701.
29. Maswadeh HM, Semreen MH, Naddaf AR. 2006. Anti-inflammatory activity of Achillea and Ruscus
topical gel on carrageenan-induced paw edema in rats. Acta Poloniae Pharmaceutica-Drug Research,
63: 277e80.
30. Millspaugh CF. 1974. American Medicinal Plants. Thuja. Dover Publications, New York.
31. Nwaehujor CO, Ezeja MI, Udeh NE, Okoye DN, Udegbunam RI. 2014. Anti-inflammatory and anti-
oxidant activities of Mallotus oppositifolius (Geisel) methanol leaf extracts. Arabian Journal of
Chemistry, 7(5): 805–810.

32. Rubin, G. P., Hungin, A. P. S., Kelly, P. J. & Ling, J. Inflammatory bowel disease: epidemiology and
management in an English general practice population. Aliment. Pharmacol. Ther. 14, 1553–1559
(2000).
33. Sen T, Nag-Chaudhari AK. 1991. Anti-inflammatory evaluation of Plunchea indicia roots extract.
Journal of Ethnopharmacology, 33: 135–141.
34. Shibata M, Ohkubo T, Takahashi H, Inoki R. 1989. Modified formalin test: characteristic biphasic
pain response. Pain, 38: 347–352.
35. Shimada K. 1956. Contribution to anatomy of the central nervous system of the Japanese upon the
vermal arbour vitae. Okajimas Folia Anatomica Japonica, 28: 207–27.

36. Shivananda, S. et al. Incidence of inflammatory bowel disease across Europe: is there adifference
between north and south? Results of the European Collaborative Study on Inflammatory Bowel
Disease (ECIBD).Gut 39, 690–697 (1996).
37. Shreedhara CS, Vaidya VP, Vagdevi HM, Latha KP, Muralikrishna KS, Krupanidhi AM. 2009.
Screening of Bauhinia purpurea Linn. for analgesic and anti-inflammatory activities. Indian Journal
of Pharmacology, 41:75-79. 
38. Shukla A. Garg S. Garg A. Mourya P. Jain CP. 2016. Investigations on hydroalcoholic extract
of Zizyphus oenoplis for analgesic and anti-nociceptive activity. Asian Journal of Pharmacy and
Pharmacology, 2(1): 15-18.
39. Sonnenberg, A., Amnon, S. & Genta, R. M. Tu1274 The Geographic Distributions of Microscopic
Colitis and Inflammatory Bowel Disease Within the United States are Different. Gastroenterology
142, S–790 (2012).

40. Sakamoto, N. et al. Dietary risk factors for inflammatory bowel disease: a multicenter casecontrol
study in Japan. Inflamm. Bowel Dis. 11, 154–163 (2005).

41. Sheehan, A. L., Warren, B. F., Gear, M. W. L. & Shepherd, N. A. Fatwrapping in Crohn’s disease:
Pathological basis and relevance to surgical practice. Br. J. Surg. 79, 955–958 (1992).
42. Tjolsen A, Berge OG, Hunskaar S, Rosland JH, Hole K. 1992. The formalin test: an evaluation of the
method. Pain, 51: 5–17.
43. Suresh Janadri1*, Yogesh H. S. Gowda2, Evaluation of analgesic and anti-inflammatory activity of
Thuja occidentalis leaves in chemically induced animal models, 2016 | Vol: 1(1) | Issue: 1 (March-
April)
44. Vane JR, Botting RM. 1996. Mechanism of action of anti-inflammatory drugs. Scandanavian Journal
of Rheumatology, 25(102): 9–21.

45. Van Assche, G. et al. Second European evidencebased consensus on the diagnosis and management
of ulcerative colitis part 3: special situations. J. Crohns. Colitis 7, 1–33 (2013).
46. White HL, Glassman AT. 1974. A simple radiochemical assay for prostaglandin synthetase.
Prostaglandins, 7: 123–129.

47. Weedon, D. D., Shorter, R. G., Ilstrup, D. M., Huizenga, K. A. & Taylor, W. F. Crohn’s disease and
cancer. N. Engl. J. Med. 289, 1099–1103 (1973).
48. Yang Yang, Jiao He, Yuan Suo, Le Lv, Jingjing Wang, Chuanchuan Huo, Zongwei Zheng, Ziye
Wang, Jing Li, Wenji Sun, Yongmin Zhang, Anti-inflammatory effect of taurocholate on TNBS-
induced ulcerative colitis in mice, Biomedicine & Pharmacotherapy 81 (2016) 424–430
49. YvonneHagenlocherAngelaHöselStephan C.BischoffAxelLorentz, Cinnamon extract reduces
symptoms, inflammatory mediators and mast cell markers in murine IL-10−/− colitis, The Journal of
Nutritional Biochemistry Volume 30, April 2016, Pages 85-92

50. Zărnescu O., Histologie animală generală- editua universității Bucuresti 2012.