Tehnologia obtinerii preparatului microscopic permanent

Fluxul activitatii
Timpi de realizare

1. Recoltarea
2. Fixarea
3.Spalarea
4.Includerea in parafina
5.Sectionarea
6.Colorarea
7.Montarea

1.Recoltarea

Rezectie chirurgicala
Rezectie endoscopica
Biopsie de organ
Punctie cu ac gros
Punctie cu ac fin
Recoltarea la necropsie

Nisa chimica cu exhaustare totala si post de lucru

Workstation - masa de lucru

 
2.Fixarea 

Definitie: proces fizic prin care se ingheata procesele biochimice, pastrandu-se forma celulei si volumul molecular

Mecanismul:
coagularea proteinelor
insolubilizare prin precipitare
formarea produsilor de aditie

Scopul:
conservarea tesutului impotriva putrefactiei
prevenirea pierderii de constituenti celulari
cresterea diferentei optice
marirea rezistentei tesuturilor

Procesarea tesuturilor –
automatic spin tissue processor
Tipuri de fixatori: 
Fizici: aerul, caldura
Chimici:Simpli: formol, acetona, alcool metilic, acid osmic
Amestecuri fixatoare: apoase sau alcoolice
Calitatile fixatorului: Stabilizeaza structurile patrunzand in tesuturi
Nu deformeaza tesutul si nu dizolva constituentii
Distruge microorganismele si extrage enzimele autolitice
Nu-si modifica compozitia si confera consistenta
Produce diferenta optica

Tratamente postfixare (optionale):  Decalcifiere (TCA, EDTA)

Mordansare (substanta ce contribuie la colorare si ameliorarea fixarii)

3.Spalarea
Oprirea fixarii isi indepartarea exesului de substanta fixatoare si eventuale structure false aparute.Se face cu diferite substante in functie de natura
fixatorului folosit: __apa curgatoare pentru formaldehida; __alcool- fixator cu dicromat de potasiu; ___alcool absolut pentru fixatori pe baza de
alcool sau amestecul Carnoy.

 
4.Includerea
Scop: crearea conditiilor petru sectionarea in sectiuni subtiri, plane, transparente
Mecanism :imobilizarea componentelor tisulare, cu pastrarea raporturilor celulare  
Tipuri de mase de incluziune:
Dupa solubilitatea in apa:
Anhidre: parafina (se poate adauga ceara: creste elasticitatea)
Apoase: gelatina
Dupa modul de realizare a includerii:
Penetrarea celulei
Ramane in spatiul interstitial
Etapele includerii:
Deshidratarea in concentratii crescute de alcool:70-80-90-100%
Clarificarea in hidrocarburi aromate sau alcool amilic,chloroform,xilen,benzen,toluen.
Impregnarea = patrunderea in profunzime a parafinei topite-56 grade C,mentinindule apoi in thermostat;
Turnarea blocurilor

Aparat semi-automat de includere la parafina cu placa de racire

Termostat

 
 

 
 

 
 

 
 

 
 

 
 

5.Sectionarea

Microtom manual rotativ cu baie de flotare

Microtom: rotativ sau culisant, manual sau semi – automat

Grosime: 5-7 nm (pentru IHC: 3 nm-imunohistochimic)

Elemente:
suport pentru cutite (lame)
portobiectul
capul mobil
micrometru
Aderarea: cu albumina Meyer

6.Colorarea

Colorarea – autostainer liniar (“robot stainer”) – 10 programe simultane, capacitate

~250 lame/ zi
Scop: cresterea contrastului prin modificarea indicelui de refractie cu coloranti,
care se leaga electrostatic de preparat
Mecanism: penetrarea celulei si atasarea de componentele celulare pentru
diferentierea optica.
Colorantul poate contine:
Grupari cromofore – purtatoare de culoare
Grupari auxocrome – au capacitate de a colora.

Exista 2 tipuri:
a)Ionizate – formeaza legaturi electrochimice cu substratul (schimb de electroni:
cedare – acceptare)  
b)Neionizate – formeaza legaturi de hidrogen cu substratul  

Etape
Deparafinarea  - dizolvarea parafinei cu hidrocarburi aromatice (3 bai succesive)-xilen;
Hidratarea – eliminarea solventilor parafinei (3 bai succesive de alcool cu concentratii scazute timp de 2-5 min.100-90-80-70%)
Colorarea cu solutie apoasa sau alcoolica
Spalarea cu apa distilata pentru indepartarea excesului de colorant
Deshidratare- alcool de 70-80-90-100%;
Clarificarea – indepartarea alcoolului cu xilol
Tipuri de coloratii:
Coloratie progresiva = actiunea colorantului este sistata prin spalare cand s-a evidentiat structura cautata
Coloratie regresiva = actiunea colorantului este prelungita pina la supracolorare, apoi se intervine cu un decolorant (diferentiator), a carui actiune este
oprita prin spalare
 
 

7.Montarea

Montarea – automat de montat lame, capacitate ~ 400 lame / zi

Scop si mecanism:
Protejarea de deteriorari
Conservare si asigurarea unui mediu omogen

Medii de montare:
Naturale
a)Anhidre: balsam de Canada, colofoniu
b)Apoase: glicerina, sirop Apathy
Sintetice: entelan, pertex

 
 
Examinarea preparatului histopatologic

Examinarea preparatului histopatologic