UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE INGINERIE MEDICALĂ

SPECIALIZAREA BIOMATERIALE SI DISPOZITIVE MEDICALE

Lucrare de Laborator Nr. 1

Applicații ale Nanobiomaterialelor (I)

Obținerea unor pansamente multifunctionale cu suprafață

modificată pe bază de nanoparticule de argint
pentru reducerea colonizării bacteriilor
Gram-pozitive și Gram-negative
 Obținerea unor pansamente multifunctionale cu suprafață modificată pe bază de
nanoparticule de argint pentru reducerea colonizării bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative

1. Preambul și Scopul lucrării

Microorganismele reprezintă una dintre cele mai răspândite specii din univers.
Mecanismul lor de dezvoltare și apărare le oferă posibilitatea de a prolifera și a se matura în
diferite condiții de mediu. Așadar, acestea pot fi găsite în aer, sol, apă și nu în ultimul rând în
organismul uman. Microorganismele prezente pe suprafața sau în interiorul corpului uman
pot avea un scop benefic asupra organismului, dacă ne gândim spre exemplu la cele care se
găsesc în flora intestinală, însă multe dintre ele au de fapt un efect dăunător în mediul
fiziologic, ducând la dezvoltarea infecțiilor sau a diverse boli ce necesită un tratament
adecvat. În cazul în care prezența agenților patogeni nu este depistată la timp sau se aplică un
tratament neadecvat, aceștia pot prolifera și pot duce la formarea biofilmului, un adevărat
habitat ce prezintă o rezistență crescută în condiții extreme. Problema majoră a formării
biofilmului este reprezentată de existența microorganismelor în alimente sau de o posibilă
contaminare fie a dispozitivelor medicale, externe sau implantabile, fie a suprafețelor
instrumentarului chirurgical. Datorită rezistenței crescute pe care microorganismele o capătă
după formarea biofilmului, eficiența terapeutică a medicamentelor poate scădea drastic.
Eradicarea biofilmului este în general realizată prin procedee de desprindere mecanică sau
despindere chimică utilizând diverși compuși chimici. Metoda chimică de eliminare a
microorganismelor de pe diverse suprafețe este considerată o metodă nesigură din cauza
influenței factorilor de mediu, dar și din cauza unui posibil risc biologic. Un exemplu concret
ar fi procesul de îndepărtare a microorgansimelor din apă, care se realizează prin utilizarea
unor dezinfectanți pe bază de clor, ce au demonstrat o carcinogenicitate ridicată. Având în
vedere aceste posibile riscuri, în momentul actual direcția principală în cercetare are la bază
ideea de prevenire a formării biofilmelor prin utilizarea unor materiale cu efect antibacterian/
antifungic, între care putem aminti nanoparticulele de argint.
Scopul lucrării prezente este de a studia efectele pe care nanoparticulele de argint le
au asupra bacteriilor Gram- pozitive și Gram- negative, precum și asupra fungilor în ideea
utilizării acestora pentru diverse tipuri de pansamente medicale.

2. Materiale și metode
2.1. Materiale necesare
Azotat de argint (AgNO3), D-glucoză (C6H12O6), hidroxid de sodiu (NaOH) și clorură
de sodiu (NaCl), sectiuni de pansament textil (1 cm x 1 cm).

2.2. Sinteza nanoparticulelor de argint

Obținerea experimentală a nanoparticulelor este posibilă prin metoda reducerii chimice a
precursorului metalic, implicând prepararea în prealabil a două soluții. Soluția de azotat de
argint este obținută prin dizolvarea a 0,1 g AgNO 3 în 100 ml apă ultrapură. Cea de a doua
soluție este obținută prin dizolvarea a 1 g D-glucoză și 4 g NaOH în 400 ml apă ultrapură,
sub agitare continuă la temperatura de 80 ̊ C.
Ulterior, soluția de azotat de argint va fi adăugată în soluția de agent reducător prin
picurare, sub agitare continuă. Pe parcursul acestei etape va fi evidentă modificarea culorii
soluției obținute, aspect corelat cu formarea particulelor de argint. O cantitate de 30 g NaCl
va fi ulterior adăugată pentru destabilizarea suspensiei, iar prin filtrarea soluției obținute va fi
posibilă colectarea nanoparticulelor astfel sintetizate. Particulele de argint vor fi supuse unui
triplu tratament de spălare cu acetonă și uscate la temperatura camerei.
2.3. Obținerea pansamentelor cu suprafață modificată
Pentru obținerea pansamentelor cu suprafață modificată, modul de lucru este cel descris la
punctul anterior cu mici optimizări: secțiunile de pansament sunt adăugate în soluția bazică
de glucoză, reacția de reducere decurgând în același mod.

2
 Lucrare de Laborator Nr. 1 | Applicații ale Nanobiomaterialelor (I)

2.4. Metode de caracterizare

2.4.1. Difracția de raze X (XRD)
Pentru determinarea structurii cristalografice a nanoparticulelor obținute am utilizat
tehnica difracției de raze X. În scopul obținerii unui fascicul monocromatic, radiația X emisă
de un tub catodic este filtrată, apoi colimată în scopul formării unui fascicul convergent și
ulterior este direcționată către proba imobilizată pe un suport rotativ aflat în incinta de
difracție.
În urma interacției radiației X cu proba, rețeaua cristalografică a probei determină
difracția radiației, iar propagarea radiaților difractate este influențată de distanța dintre atomii
celulei elementare. Efectul de difracție caracteristic probei investigate se formează prin
interferarea pozitivă a difracțiilor individuale ale tuturor atomilor rețelei cristalografice, în
conformitate cu legea lui Bragg ce stabilește o relație de proporționalitate între lungimea de
undă λ, caracteristică radiației electromagnetice și distanța dintre planele reticulare, d,
respectiv valoarea unghiului θ, sub care radiația X interacționează cu planele probei.
Înregistrarea radiației difractate este posibilă datorită detectorului Geiger-Müller, aflat pe
același ax rotativ cu suportul probei, caracterizat de o viteză unghiulară dublă față de cea a
goniometrului pe care este poziționată proba. Impulsurile detectorului sunt ulterior preluate
de către programul de achizițiecare aplică semnalelor primite modelul matematic al
transformatei Fourier, asigurând conversia și amplificarea impulsurilor. Înregistrarea
impulsurilor obținute se face sub forma difractogramelor, unde maximele ascuțite sunt
asociate unghiurilor de difracție a radiației X. Difracția de radiații X (XRD) este o tehnică de
analiză rapidă și reproductibilă, ce permite obținerea informațiilor calitative și cantitative
despre proba supusă analizei.
Investigarea cristalinității nanopulberii de argint sintetizate a fost realizată prin
intermediul tehnicii de difracție, utilizând un difractometru model Schimadzu XRD 6000.
Determinările experimentale au fost făcute la temperatura camerei, pentru valori ale
unghiului Bragg de 2θ cuprinse între 10 ̊ și 80 ̊, cu electrod de Cu și radiație de tip K α, care
are λ= 1,056 Å (15 mP și 30 kV)

2.4.2. Microscopie electronică de baleiaj (SEM)

Ca urmare a coliziunilor între electronii primari, elctronii și ionii găsiți în
microstructura materialului, bombardarea în vid a unei probe cu un fascicul de electroni
determină încetinirea vitezei de propagare a fasciculului incident. Ca urmarea a acestui
impact, energia cinetică a electronilor incidenți este transferată electronilor aflați pe straturile
orbitale ale probei iradiate, favorizând astfel expulzarea acestora din învelișul electronic în
interiorul materialului, sub forma de electroni secundari, caracterizați de energii mai mici de
50 eV. Ulterior, electronii secundari rezutați sunt transportați prin probă către suprafața
materialului, urmând a fi eliberați la interfața probă- vid. Prin înregistrarea intensităților la
care sunt împrăștiați electronii secundari este posibilă obținerea unor imagini virtuale asociate
texturii materialului iradiat, în care contrastul micrografiei obținute se datorează topografiei
probei. Zonele mai înalte ale probei favorizează interacții mai puternice cu fasciulul incident
de electroni, deci emiterea unui număr mai mare de electroni secundari, asigurând o imagine
mai luminoasă în zonele mai înalte ale probei. SEM este considerată o tehnică neinvazivă de
investigarea a morfologiei materialelor, oferind posibilitatea obținerii de informații într-un
timp redus și oferind avantajele unei rezoluții spațiale de 50-100 nm, respectiv unei măriri
între 20-30.000 ori a probei de analizat.
În scopul investigării morfologiei și dimensiunii stratului de argint depus, probele au
fost secționate cu ajutorul unui disc de diamanat, fixate pe un suport și introduse în incinta de
analiză a unui microscop electronic de baleaj, achiziționat de la compania FEI (Oregon,

3
 Obținerea unor pansamente multifunctionale cu suprafață modificată pe bază de
nanoparticule de argint pentru reducerea colonizării bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative

SUA). Imaginile obținute au fost realizate prin înregistrarea fasciculului de electroni

secundari rezultat, cu energie de 30 keV.

2.4.3. Microscopie electronică de transmisie (TEM) și difracția de electroni pe arie

selectată (SAED)
Microscopia electronică de transmisie este o metodă ce permite investigarea
morfologică și dimensională a nanoparticulelor de argint. Electronii produși de un tun de
electroni sunt direcționați prin intermediul unor lentile magnetice sau electrostatice către
proba ce se dorește a fi analizată și se obțin imagini pe un ecran cu florescență. Calitatea
imaginilor obținute cu ajutorul TEM și implicit, calitatea informațiilor privind microstructura
probei analizate, sunt dependente de contrastul imaginilor rezultate, care la rândul lor sunt
influențate de energia caracteristică a fasciculului incident de electroni și de capacitatea
probei de a asigura dispersia diferențiată a electronilor, dependentă de grosimea probei și de
numărul atomic Z caracteristic. Având în vedere lungimea de undă caracteristică fasciculului
de electroni și aperturile specifice sistemului optic al microscopului ce asigură un grad ridicat
de convergență a fasciculului, rezoluția spațială caracteristică microscopului poate atinge
valori de ordinul Å, ceea ce permite obținerea informațiilor privind morfologia, dimensiunea
și structura materialelor la nivel atomic, evidențierea rețelelor cristalografice și a eventualelor
defecte structurale de la acest nivel, dar și date privind compoziția probei .Difracția de
electroni pe arie selectată este o metodă ce permite analizarea particularităților cristaline a
unui material, în interiorul unui microscop electronic prin transmisie, o tehnica ce este
similară din punct de vedere al principiulului cu metoda difracției de radiații X, cu deosebirea
că radiația incidentă este reprezentată de un fascicul de electroni, iar analizarea probei este
realizată pe zone cu dimensiuni de ordinul nanometrilor. Considerând faptul că distanțele
interatomice prezintă valori puțin mai mari decât lungimea de undă a fasciculului de electroni
care interacționează proba, atomii probei iradiate acționează similar unei rețele de difracție
pentru electronii incidenți și asigură împrăștierea acestora și înregistrarea unei imagini
caracteristice undelor difractate, de diferite intensități, sub formă de puncte, inele concentrice
sau linii. Distribuția specifică a fasciculului de electroni difractat permite obținerea de
informații foarte utile despre proba investigata, cum ar fi natura cristalină sau amorfă,
identificarea sistemului cristalografic și eventuale defecte cristaline, identificarea
compozițională a probei.
Proba a fost amplasată pe o grilă de cupru acoperită cu carbon și lăsată să se usuce la
temperatura camerei.
În scopul obținerii imaginilor TEM și SEM, am folosit un microscop electronic de
transmisie de înaltă rezoluție de tip Tecnai TM G2 F30 S-TWIN echipat cu SAED, achiziționat
de la compania FEI (Oregon, SUA). Acest microscop funcționează în modul de transmisie la
o tensiune de 300 kV, rezoluția punctuală și de linie garantate având valorile de 2Å, respectiv
1Å. Analiza SAED a fost apoi reefectuată în câmp luminos cu ajutorul aceluiași microscop.

2.4.4. Microscopie de infraroșu (IRM)

Principiile microscopiei optice și a spectrometriei în infraroșu au permis dezvoltarea
unei noi metode investigare a materialelor prin intermediul microscopiei în infraroșu (IRM).
Este o tehnică neinvazivă, ce asigură obținerea unor informații considerabile legate de
compoziția chimică și distribuția moleculară a materialelor analizate, dar oferă informații și
despre uniformitatea structurală și identificarea unor posibile defecte.
Metoda presupune în primă fază plasarea probei pe un detector confecționat dintr-un
aliaj mercur- cadmiu- telur. Ulterior, proba se iradiază cu unde electromagnetice din
domeniul infraroșu și înregistrarea se face la nivelul interferometrului a unui set de spectre de
absorbție a radiației infraroșu corespunzătoare fiecărui element al detectorului, obținându-se

4
 Lucrare de Laborator Nr. 1 | Applicații ale Nanobiomaterialelor (I)

la final o hartă în infraroșu a zonei investigate în care fiecărui pixel al figurii îi este asociată o
suprafață de 5,5 μm2 a probei și un anumit număr de spectre de absorbție în infraroșu.
Dimensiunea elementelor detectorului microscopului poate varia de la 16x16 pixeli, până la
256x 256 pixeli, ceea ce asigură posibilitatea de înregistrare a unui număr individual de
spectre în IR cuprins între 256 – 65,536 nm. Microscopul în IR permite colectarea datelor
pentru probe subțiri, cu o dimensiune până la maxim 20 mm, operarea în modul de
transmisie, reflexie și reflexie totală atenuată, iar colectarea datelor poate fi făcută pe
suprafețe pătrate cu dimensiuni laterale de 7-12 μm, respectiv 20 μm pentru modulul ATR.
Calitatea hărților obținute prin această metodă depinde foarte mult atât de aspectele
instrumentului de analiză cât și de caracteristicile materialului analizat, precum grosime,
omogenitate structurală și chimică.
Cartografierea în IR a filmelor nanostructurate obținute experimental a fost posibilă
prin utilizarea unui echipament de tip Nicolet iN10 MX FT-IR Microscope, dotat cu un
detector de timp MCT răcit cu azot lichid, ce permite efectuarea măsurătorilor în domeniul
4000- 600 cm-1. Înregistrarea colecției de spectre a fost realizată în modul reflexie, la o
rezoluție de 4 cm-1. Pentru fiecare spectru obținut au fost efectuate 32 scanări, care au fost
ulterior suprapuse și convertite în absorbanță utilizând softul OmincPicta (Thermo
Scientific).

2.4.5. Biocompatibilitatea in vitro

Linia celulară L929 de tip fibroblaste de şoarece creşte în cultură în monostrat şi este
recomandată pentru testele de evaluare a biocompatibilităţii unor materiale, datorită
sensibilităţii crescute pe care o manifestă. Cultivarea celulelor s-a realizat în mediu Minimum
Essential Media (MEM), cu 10% ser bovin fetal (FBS) şi 1% antibiotice (neomicină şi
penicilină-streptomicină), în condiţii standard, la 37±2 oC, 5±1% CO2, umiditate mai mare de
90%.
Dezgheţarea celulelor:
Celulele sunt plasate în criotubur și prezervate prin înghețare în mediu cu azot lichid. Pentru a
fi utilizate, criotubul dorit trebuie scos cu atenție din criostatul cu azot lichid, iar celulele trebuie să fie
dezghețate rapid într-o baie cu apă, în incubatorul cu CO 2, la 37oC. Celulele se transferă apoi într-
un flas și se adaugă mediu de cultură MEM 1-% FBS și neomicină-penicilină-streptomicină
1% încălzit în prealabil la 37oC, cu atenție pentru a preveni inducerea de șoc
osmotic.Cantitatea de mediu în funcţie de dimensiune flask: 5 ml pentru flask de 25 cm 2, 10
ml pentru flask de 75 cm2. Flaskul se plasează într-un incubator ce menţine cultura în condiţii
standard 37±2oC, 5±1% CO2, umiditate mai mare de 90%. Mediul de cultură se schimbă la 2-
3 zile.
Pregătirea monostratului celular utilizat în experiment:
După 3-5 zile în condiţii standard, după ce au ajuns la confluenţă celulele trebuiesc
plasate în noi recipiente. Pentru experimentul de evaluare a proliferării celulare cu săruri de
tetrazolium, s-au utilizat plăci de 96 de godeuri, în care au fost însămânţate 5000 celule/
godeu, iar, pentru experimentul de evaluare calitativă a morfologiei celulare şi a integrităţii
citoscheletului celular prin tehnici de fluorescenţă, s-au utilizat plăci de 24 de godeuri, în care
au fost plasate câte o lamelă de sticlă rotundă, cu diametrul de 10 mm şi pe care au fost
însămânţate câte 5000 celule. În acest scop, au fost parcurse următoarele etape:
E1: Îndepărtarea în totalitate a mediului de cultură din flask;
E2: Adăugare 1 ml soluţie tripsină 0,25%;
E3: Se incubează pentru 2-3 minute pentru a permite enzimei să acţioneze;
E4: Pipetare energică pentru îndepărtarea tuturor celulelor ataşate;
E5: Adăugare suspensie celulară peste un volum de mediu de cultură DMEM 10%
FBS și neomicină-pencicilină-streptomicină 1% în proporţie de 1:3;

5
 Obținerea unor pansamente multifunctionale cu suprafață modificată pe bază de
nanoparticule de argint pentru reducerea colonizării bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative

E6: Numărare celule;

E7: Spălare prin centrifugare (10 min, 1050 rpm, 4oC);
E8: Resuspendare celule în mediu astfel încât să se asigure concentraţia dorită de
celule; incubare în condiţii standard pentru 24 h.

2.4.5.1. Evaluarea cantitativă a proliferării celulare utilizând testul cu săruri de

tetrazolium (MTT);
MTT (bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu) este o sare de
tetrazoliu ce este redusă la formazan în celulele vii, în citosol, de către esteraze. Substanţa
rezultată în urma procesului poate fi citită la o anumită lungime de undă, în funcţie de
absorbanţa obţinută putându-se stabili cantitativ (%) proliferarea/ viabilitatea celulelor din
suspensia cuantificată. Pentru evaluarea biocompatibilităţii probelor obţinute asupra culturilor
celulare de tip L929 fibroblast, utilizând această metodă, s-a urmărit scăderea viabilităţii
celulare, asociată cu efectul citotoxic pe care îl au sistemele proiectate asupra celulelor în
cultură. În acest scop, s-au parcurs următoarele etape:
E1: Pregătirea probelor şi efectuarea diluţiilor corespunzătoare
 prin suspendarea pulberilor în mediu de cultură MEM 10% FBS și neomicină-
pencicilină-streptomicină 1% pentru a obţine soluţii cu diferite concentraţii;
 efectuarea unor extracte în mediu de cultură MEM 10% FBS și neomicină-
pencicilină-streptomicină 1%, în condiţii standard 37±2oC, 5±1% CO2,
umiditate mai mare de 90%.
E2: Înlocuirea mediului de cultură existent în godeuri cu un volum corespunzător (100
𝜇L/ godeu) din proba pregătită anterior;
E3: Incubarea în condiţii standard (37±2oC, 5±1% CO2, umiditate mai mare de 90%)
pentru 24, 48, respectiv 72 h;
E4: Adăugarea a câte 10 𝜇L soluţie 5 mg/mL MTT în PBS;
E5: Incubare în condiţii standard (37±2oC, 5±1% CO2, umiditate mai mare de 90%)
pentru 2 h;
E6: Adăugare 100 𝜇L soluţie soluţie de solubilizare (izopropanol acid) în fiecare
godeu; pipetare energică pentru solubilizarea cristalelor de formazan;
E7: Citire la spectrofotometrul TECAN la o lungime de undă de 570 nm.

2.4.5.2. evaluarea calitativă a morfologiei celulare şi a integrităţii citoscheletului

celular, prin colorarea filamentelor de actină cu Phalloidin şi vizualizare prin tehnica de
microscopie în fluorescenţă.
E1: Spălare lamele cu 0,5 mL PBS;
E2: Fixare cu 0,5 mL soluţie 3,7% paraformaldehidă în PBS, timp de 5 minute;
E3: Spălare, de 3 ori, cu câte 0,5 mL PBS;
E4: Permeabilizare celule cu câte 0,5 mL Triton X în PBS, pentru 10 minute;
E5: Spălare, de 3 ori, cu câte 0,5 mL PBS;
E6: Colorare cu 50 ug/mL Phalloidin-FITC, pentru 40 minute, întuneric;
E7: Spălare, de 3 ori, cu câte 0,5 mL PBS;
E8: Montare pe lamă, sigilare;
E9: Vizualizare la microscop în fluorescenţă.

2.4.6. Biodistribuția in vivo a nanoparticulelor de argint

În scopul evaluării distribuției in vivo a nanoparticulelor de argint depuse pe
pansamente din poliester, au fost realizate investigări din punct de vedere microscopic
privind aspectele histologice ale principalelor organe interne ale șoriceilor de laborator testați.
În acest sens, a fost realizată o soluție de nanoparticule de argint de concetrație 1 mg/ml,

6
 Lucrare de Laborator Nr. 1 | Applicații ale Nanobiomaterialelor (I)

obținută prin dispersarea nanostructurilor în apă ultrapură. Ulterior, soluția a fost sterilizată
prin iradiere cu UV timp de 30 minute. Protocolul de lucru a presupus în primă fază
administrarea interperitoneală a câte doi șoricei cu 200 µl din dispersia obținută, respectiv a
alți doi șoricei control cu câte 200 µl ser fiziologic. La intervale de 7, respectiv 14 zile după
administrare, animalele de laborator au fost anesteziate și ulterior sacrificate pentru recoltarea
organelor vitale (creier, miocard, plămân, ficat, rinichi, pancreas și splină). Pentru a îndepărta
sângele existent, organele au fost tratate cu o soluție tampon de fosfat salin (PBS) și
conservate în soluție de formaldehidă 10%, pH între 7,2 și 7,4, timp de 72 ore, la temperatura
camerei. Fragmentele de organe au fost ulterior prelucrate pentru includerea în parafină, etapă
esențială în vederea obținerii unor piese anatomice adecvate pentru cercetările histologice.
Includere în parafină a fost efectuată prin câteva etape descrise mai departe: deshidratare,
clarificare, parafinare, includere în bloc de parafină, secționarea blocului de parafină, lipirea
secțiunilor microscopice pe lame și uscarea.
Etapa de deshidratare: Fragmentele de organe fixate în formol au fost spălate sub jet
de apă, timp de 2-4 ore și trecute apoi succesiv printr-o baterie de flacoane cu concentrații
crescătoare de etanol – 750, 900, 960 (două băi) și etanol absolut (trei băi) – fiecare proces
având durata de 75 de minute. Pentru a preveni evaporarea şi hidratarea reactivilor utilizați,
deshidratarea probelor recoltate a fost realizată în vase închise etanş, cu o capacitate suficient
de mare, astfe încât volumul agentului de deshidratare să fie de 10-20 de ori mai mare decât
volumul probelor. La trecerea fragmentelor de organe dintr-un flacon cu etanol în altul,
acestea au fost ușor tamponate cu hârtie de filtru, pentru a evitaimpurificarea băilor
următoare.
Etapa de clarificare: Eliminarea etanolului din probele deshidratate a fost realizată
cu ajutorul xilenului – hidrocarbură aromatică, volatilă, miscibilă cu parafina, ușor de
îndepărtat din probele histologice prin introducere în termostat. Clarificarea a fost realizată la
temperatura camerei, prin introducerea pieselor histologice în flacoane de stică înguste și
înalte, prevăzute cu dop rodat sau cu capac etanș, cu conținut de xilen de aproximativ 20 de
ori mai mare decât volumul probelor de analizat. Pe măsură au fost impregnate cu xilen,
fragmentele tisulare recoltate au căpătat un aspect translucid – din acest moment, piesele au
fost tratate timp de încă 15 minute într-o baie proaspătă cu xilen.
Etapa de parafinare: Operația de parafinare – realizată în scopul obținerii unei
consistențe omogene a pieselor histologice – a fost realizată la termostat, la o temperatură cu
2-30C mai mare decât punctul de topire al parafinei (56 0C). Pentru utilizare, parafina a fost
topită în etuvă – la temperatură de 60-700C – iar pentru mărirea elasticității a fost amestecată
ulterior cu diferite cantități de ceară de albine (în proporție de 5-10%), în scopul obținerii a
trei băi diferite de parafină, ce au fost filtrate în etuvă (la aceeași temperatură la care a fost
topită parafina). Pentru băile de parafină au fost utilizate recipiente scunde din sticlă, fără
capac și cu diametru mare, în care au fost imersate fragmentele de organe, trecerea dintr-o
baie de parafină în alta realizându-se rapid (pentru a evita solidificarea parafinei).
Etapa de includere în bloc de parafină: În această etapă, probele histologice
îmbibate cu parafină topită au fost înglobate în blocuri de parafină solidificate, de consistenţă
omogenă. Piesele histologice din ultima baie de parafină au fost transferate – cu ajutorul unei
pense încălzită în flacără – în mici matrițe de plastic, în care au fost turnate în prealabil
cantități reduse de parafină topită. Ulterior, matrițele au fost umplute cu parafină și, pentru a
putea trece la pasul următor al procesului, s-a așteptat solidificarea completă a blocurilor
obținute. Includerea în parafină a fragmentelor tisulate prelevate a fost realizată cu ajutorul
unei staţii de tip SLEE – compusă din dispenser automat de parafină, cu plită încălzită (SLEE
MPS/P1) şi cu plită răcită (SLEE MPS/C) – achiziționată de la compania SLEE Medical
GmbH (Mainz, Germania).

7
 Obținerea unor pansamente multifunctionale cu suprafață modificată pe bază de
nanoparticule de argint pentru reducerea colonizării bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative

Etapa secționării blocului de parafină: Pentru secționarea blocurilor de parafină

obținute, acestea au fost montate cu fața corespunzătoare probei spre cuțitul microtomului, iar
cu partea opusă au fost prinse de port-obiect. Primele secțiuni, cu grosimea de 20-25 μm, au
fost realizate doar prin parafină, pentru verificarea corectitudinii panglicii de secțiune. În
momentul în care banda de secțiune a fost rectilinie, iar blocul de parafină a fost suficient de
mult secționat astfel încât cuțitul microtomului să ajungă la proba histologică, au fost
realizate secțiuni cu grosimea de 5 μm. Secțiunile astfel obținute au fost îndepărtate de pe
cuțitul microtomului cu ajutorul unei pensule și asezate cu fața lucioasă (dinspre cuțit) pe o
placă neîncălzită. Secționarea blocurilor de parafină a fost posibilă prin utilizarea unui
microtom motorizat de tip MICROM HM355s, achiziționat de la compania MICROM
International GmbH (Walldorf, Germania).
Etapa lipirii secțiunilor microscopice pe lame și uscarea: Cele mai bune secțiuni
anterior obținute au fost detașate de pe plăcile neîncălzite cu ajutorul unui bisturiu și
transferate cu fața lucioasă în jos, într-un cristalizor cu apă distilată, încălzită la 400C, folosit
pentru etalarea secțiunilor microscopice. Sub acțiunea căldurii, secţiunile s-au destins şi apoi
au fost culese pe rând de pe lamele port-obiect. Lamele de sticlă – perfect curate și degresate
– au fost introduse în cristalizor, plasate oblic sub secțiuni, apoi au fost scoase încet din apă și
tamponate ușor cu hârtie de filtru, urmând a fi ulterior așezate pe un stativ. După un timp
scurt de contact cu aerul, stativul cu lame a fost introdus la termostat, timp de 12-14 ore,
pentru a asigura uscarea perfectă a lamelor.
Pentru evidențierea microscopică a aspectelor histologice ale secțiunilor preparate,
acestea au fost supuse tehnicii de colorare cu Hematoxilina-Eozină (HE).
Examinarea microscopică a lamelor histologice, preparate printr-un protocol de lucru
adecvat, a fost efectuată prin utilizarea unui microscop optic binocular de tip Nikon Eclipse
55i, achiziționat de la compania Apidrag (București, România), folosind obiectivele x10, x20,
x40 sau x100. Achiziția și prelucrarea imaginilor a fost realizată prin cuplarea unei camere
video de înaltă rezoluție și calitate, model Nikon DS-Fi1, achiziționată de la aceași companie
ca microscopul optic, și prin utilizarea pachetului de programe Image-Pro Plus vs. 6.0,
achiziționat de la compania MediaCybernetics (Marlow, Buckinghamshire, Marea Britanie).

2.4.7. Evaluarea potențialului antimicrobian

Pentru testarea efectului suprafetelor obtinute asupra producerii de biofilme,
pansamentele obtinute au fost sterilizate prin expunere la radiatii UV timp de 20 min pe
fiecare parte. Cate un fragment de material steril a fost depus individual intr-un godeu al unei
placi cu 6 godeuri sterile. Peste materialele depuse, in godeuri s-au adaugat 2 mL mediu
lichid (bullion simplu) si ulterior 50 μL suspensie microbiana de densitate 0.5 McFarland.
Placile cu 6 godeuri astfel pregatite, au fost incubate le 37 oC timp de 24h. Dupa incubare
materialele au fost spalate cu AFS si mediul a fost schimbat, pentru dezvoltarea biofilmelor
dezvoltate pe acestea. Placutele au fost incubate pentru diferite perioade de timp (24, 48 si
respective 72h). Dupa expirarea fiecarei perioade de incubare luate in calcul, esantionul pe
care s-a dezvoltat biofilmul a fost spalat cu AFS si depus intr-un tub steril intr-un mL AFS.
Tubul a fost vortexat energic timp de 30 sec pentru desprinderea celulelor din biofilm.
Suspensia celulara obtinuta a fost diluata si diferite dilutii au fost insamantate pe placi cu
mediu de cultura solidificat in vederea obtinerii si cuantificarii numarului de unitati
formatoare de cololonii.

8
 Lucrare de Laborator Nr. 1 | Applicații ale Nanobiomaterialelor (I)

3. Rezultate și discuții
3.1. DRX
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

Figura 1. Difracția de raze X pentru PaN/NanoAg

3.2. SEM

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

9
 Obținerea unor pansamente multifunctionale cu suprafață modificată pe bază de
nanoparticule de argint pentru reducerea colonizării bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

Figura 2. Micrografii SEM pentru PaN/NanoAg, la mariri de 500x respectiv 5000x

Figura 3. Micrografii SEM înregistrate pentru PaN/NanoAg, la o mărire 100000x

3.3. TEM și SAED

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

10
 Lucrare de Laborator Nr. 1 | Applicații ale Nanobiomaterialelor (I)

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

Figura 4. Microscopie electronică prin transmisie pentru PaN/NanoAg

Figura 5. Imagini a) HR-TEM, b)SAED pentru PaN/NanoAg

3.4. IR
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

11
 Obținerea unor pansamente multifunctionale cu suprafață modificată pe bază de
nanoparticule de argint pentru reducerea colonizării bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

Figura 6. Spectrele FT-IR iregistratepentru PaN/NanoAg

Figura 7. Cartografiere IR iregistratapentru PaN/NanoAg,

unde: a) 2908 cm-1si b)1736 cm-1

3.5. Biocompatibilitate in vitro

3.5.1. Evaluarea cantitativă a proliferării celulare utilizând testul pe bază de săruri de

tetrazolium.

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

12
 Lucrare de Laborator Nr. 1 | Applicații ale Nanobiomaterialelor (I)

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

Figura 8. Viabilitatea celulară în funcţie de concentraţia de nanoparticule

3.5.2. Evaluarea calitatitvă a morfologiei celulare și a integritații citoscheletului cellular,

prin colorarea filamentelor de actină cu Phalloidin și vizualizare prin tehnica de
microscopie de fluorescență.

13
 Obținerea unor pansamente multifunctionale cu suprafață modificată pe bază de
nanoparticule de argint pentru reducerea colonizării bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative

Figura 9. Imagini de microscopie în fluorescență la 24h de la tratarea celulelor cu

PaN/NanoAg

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

3.6. Determinarea biodistribuției nanoparticulelor de argint in vivo

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

Figura10. Aspecte histologice ale țesutului nervos recoltat la 7 zile (HE):x200, respectiv la 14 zile (HE):x400.

Figura 11. Țesut hepatic recoltat la 7 zile (HE):x400, respectiv la 14 zile (HE):x400.

14
 Lucrare de Laborator Nr. 1 | Applicații ale Nanobiomaterialelor (I)

Figura12. Aspecte histologice ale țesutului cardiac recoltat la 7 zile (HE):x200, respectiv la 14 zile (HE):x400.

Figura 13. Țesut pulmonar recoltat la 7 zile (HE):x400, respectiv la 14 zile (HE):x200 și (HE):x400.

Figura 14.Țesut renal recoltat la 7 zile (HE):x400, respectiv la 14 zile (HE):x200 și (HE):x400.

15
 Obținerea unor pansamente multifunctionale cu suprafață modificată pe bază de
nanoparticule de argint pentru reducerea colonizării bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative

Figura15. Țesut splenic recoltat la 7 zile (HE): x1000, , respectiv la 14 zile (HE):x200 și (HE):x400.
3.7. Evaluarea potențialului antimicrobian

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

Figura 16. Evidențierea UFC/ml în cazul P. aeurugionsa

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

16
 Lucrare de Laborator Nr. 1 | Applicații ale Nanobiomaterialelor (I)

Figura 17. Evidențierea UFC/ml în cazul S. aureus

Figura 18. Evidențierea UFC/ml în cazul C. albicans

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
Concluzii
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

17
 Obținerea unor pansamente multifunctionale cu suprafață modificată pe bază de
nanoparticule de argint pentru reducerea colonizării bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative

___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

18