METODE DE DIAGNOSTIC

MOLECULAR
 Secvențierea ADN-ului
• Metoda se bazează pe acțiunea ADN-
polimerazelor de a sintetiza o a doua catenă
complementară secvenței de ADN matriță:
• Adăugarea de di-deoxinucleotide (ddNTP,
lipsite 3'-OH necesară pentru formarea
legăturii fosfodiester între 2 nucleotide)
într-o concentrație scăzută pentru a se
amesteca, termină prelungirea polimerului
ADN la puncte aleatorii.
• O serie de fragmente terminate la puncte
aleatorii în secvența de ADN sunt apoi
generate și analizate dând succesiunea ADN.
• Coloranți dichlororhodamine sunt folosiți pentru a marca ddNTP. Fiecare
ddNTP este marcat cu o anumită variantă colorant, cu diferite lungimi de
undă de emisie (de exemplu culoare diferită), rezultând într-o singură reacție
generatoare fragmente aleatorii, fiecare fragment fiind marcat cu un colorant
care corespunde bazei terminal.
• Aceste fragmente sunt separate folosind electroforeza în gel capilar.
• Detectarea se face prin intermediul unui laser ce emite la diferite lungimi de
undă corespunzătoare pentru a detecta orice fluorescență.
• Se generează o urmă cromatografică a patru lungimi de undă de emisie (care
corespund celor patru ddNTP marcate).
Analiza filogenetică
• este reprezentarea istoriei
evolutive a unei specii sau grup
de specii înrudite;
• este prezentată sub forma unui
arbore filogenetic;
Scopul analizei filogenetice
• Permite obținerea de informații privind procesele de evoluție
• Se bazează pe vizualizarea relațiilor de evoluție folosind structuri
arborescente:
• Relațiile de evoluție corespund unor ramuri în arbori
• Lungimea ramurilor reflectă gradul de disimilaritate între entitățile analizate
(de exemplu secvențe de aminoacizi)
• Construirea arborelui se bazează pe:
• Construirea unei matrici de distanțe sau alinierea multiplă a secvențelor
• Gruparea succesivă a secvențelor similare
Scopul analizei filogenetice
• Este utilă în urmărirea schimbărilor ce intervin în speciile care
evoluează rapid (virusuri, bacterii, miceți, paraziți).
• De exemplu în cazul virusurilor ce induc gripa este de interes să se
poată:
• Studia schimbarea rapidă a genelor
• Prezice structura viitoare a virusului
• Produce un vaccin corespunzător
• Construirea unui arbore filogenetic are ca scop identificarea structurii
arborescente care reflectă procesul de evoluție pornind de la setul de
specii (secvențe).
• Tipuri de metode:
❑ Bazate pe distanțe (Distance based)
❑ Bazate pe minimizarea structurii (Maximum parsimony)
❑ Bazate pe metoda verosimilității maxime (Maximum likelihood)
 EXEMPLU

Aplicații ale metodei în diagnosticul de laborator

Genbank –număr de identificare
• MG944824.1
• LR899193.1
• AY452486.1
• MF380358.1
• EF011111.1
• LN808677.1
• MN229279