Diagnostic molecular

Lucrare practică - partea 1

 Extracția acizilor nucleici (ARN)
utilizând kitul „RNeasy Mini kit” (Qiagen)
• Echipamente de analiză
• hotă cu flux laminar biohazard, clasa a II a
• balanţă tehnică
• balanţă analitică
• vortex
• microcentrifugă hettich
• aparat pentru producere gheaţă
• congelator -850c ,
• pipetă automată monocanal 100-1000 µl,
• pipetă automată monocanal 0,5–10 µl,
• pipetă automată monocanal 2–20 µl,
• pipetă automată monocanal 20-200 µl,
• combină frigorifică
• frigider-congelator
• cuptor cu microunde,
• omogenizator Sartorius
 Extracția acizilor nucleici (ARN)
utilizând kitul „RNeasy Mini kit” (Qiagen)
• Spaţiul de lucru
• Procedura se desfăşoară în următoarele spaţii de lucru:
• camera de pregătire probe - pregătirea probelor în vederea efectuării analizei ;
• camera de extracţie a acizilor nucleici - etapa de extracţie acizi nucleici;
• Materiale necesare
• Kitul pentru extracţie acizi nucleici – „RNeasy Mini kit” (Qiagen) ; Se păstrează
la temperatura camerei, iar componentele sale se reconstituie şi se utilizează
conform instrucţiunilor din prospect.
• În momentul deschiderii se reconstituie tamponul RPE (11ml RPE conc.+ 44ml
etanol absolut puriss p.a. min. 99,8%, din import), conform prospectului kitului.
Etapele protocolului de extracție
 Extracția acizilor nucleici (ARN)
utilizând kitul „RNeasy Mini kit” (Qiagen)
• Pregătirea probelor de organe
• Probele de organe se lasă să se decongeleze treptat. Organele refrigerate se
pot prelucra imediat.
• După identificare, probele se scot individual din ambalaje
• Din fiecare organ se prelevează o porţiune de aproximativ 1 cm3, cu o pensă şi
o lamă de bisturiu de unică folosinţă, care se plasează într-o placă Petri.
• În efectuarea protocolului de extracție, mai întâi, se prepară soluția de liză,
prin adăugarea la fiecare 1 ml tampon RLT a 10 µl β – Mercaptoetanol.
Ulterior, în tuburile precântărite se distribuie un fragment de țesut de
aproximativ 30 mg pentru fiecare probă de analizat și 600µl soluție de liză.
 Extracția acizilor nucleici (ARN)
utilizând kitul „RNeasy Mini kit” (Qiagen)
• Pregătirea probelor de organe
• Se introduc tuburile în omogenizatorul Sartorius şi se rulează programul
prestabilit : 2 min de secunde la 3000 de rpm
• Apoi tuburile se centrifughează timp de 3 min. la 14000 rpm
• Pentru precipitarea ARN-ului, 600µl din supernatantul obținut se transferă într-
un tub de 2 ml peste care se adaugă 600µl etanol 50%.
• Din amestecul format se iau câte 650µl soluție și se depun în coloanele Rneasy
din tuburile de colectare furnizate de producătorul kit-ului.
• Tuburile se centrifughează timp de 30 de secunde la 10000rpm.
• Acest pas se realizează până la epuizarea amestecului, iar supernatantul din
tubul colector se elimină după fiecare centrifugare.
 Extracția acizilor nucleici (ARN)
utilizând kitul „RNeasy Mini kit” (Qiagen)
• Spălarea membranei de siliciu se face prin efectuarea a trei cicluri succesive
cu două tampoane de spălare: RW1 și RPE. Centrifugarea tuburilor după
primele două spălări se face conform acelorași parametri utilizați anterior,
iar după ultima spălare aceasta se face la 10000 rpm timp de 2 minute.
• Pentru eliminarea eventualelor reziduuri de reagenți de pe mebrana de
siliciu se tranferă coloana RNeasy într-un nou tub colector și se
centrifugheză la viteză maximă timp de 1 minut.
• Pentru desprinderea ARN-ului de pe membrana de siliciu (eluție) se
plasează coloana RNeasy într-un tub Eppendorf de 1.5 ml, după care se
depun 40 µl apă fără nucleaze (RNase free water) direct pe membrană și se
centrifughează timp de un minut la 10000rpm. Acestă etapă se repetă, iar
la final se face stochează ARN-ul la -800C
 Amplificarea acizilor nucleici prin
tehnica rt-PCR
• Etapa de revers-transcripție
• Pentru transcripția ARN-ului în ADNc (ADN complementar),
într-o primă etapă, produșii de extracție (ARN total) sunt supuși
procesului de denaturare în prezența unui primer aleatoriu –
random hexamer.
• Ulterior, pentru sinteza ADNc, complexul nou format
(ARN/primer) este supus unor cicluri succesive de temperaturi
în prezența inhibitorilor de RN-aze, a deoxinucleotidelor și a
reverstranscriptazei.
• Acestea sunt efectuate în 12 µl volum final/reacție conform
datelor descrise în tabel
• Pentru realizarea reacției se utilizează aparatul BioRad MJ Mini
 Amplificarea acizilor nucleici prin
tehnica rt-PCR
• Revers-transcripția: reactivi și program de amplificare
Etapele de lucru Reactivi/reacție Programul termic RT
Etapă Temperatură Durată Nr. de
cicluri

Denaturare ARN - 5 µl ARN total Denaturare 700C 5' 1

- 2.5 µl random hexamer
Final 40C ∞

- 7.5 µl ARN/primer Hibridizare 250C 5' 1

- 2.4 µl Tampon 5x (+MgCl2)
Sinteză 420C 60' 1
Sinteza ANDc - 1.2 µl dNTP mix
- 0.3 µl RN-aze inhibitor Inactivarea RT 700C 15' 1
- 0.6 µl RT
Final 40C ∞

• După finalizarea reacției de revers-transcripție produsul ADNc se stochează la

temperatura de -200C.