07/04/2021

Factori de creștere care

controlează hematopoieza

Hematopoieza - procesul de formare a celulelor sanguine

❑ Din celule stem pluripotente se diferențiază celule stem multipotente pe linie mieloidă
(CFU-S) și limfoidă (CFU-L) care vor genera precursorii pentru eritrocite, majoritatea
leucocitelor și trombocite, respectiv precursorii pentru limfocite

1
 07/04/2021

Localizare?

❑ Țesutul mieloid – dispus în cavități osoase -

măduva osoasă/măduvă roșie hematogenă -
formează:
Eritrocite – eritropoieză
Leucocite – leucopoieză
Trombocite – trombocitopoieză
Reprezintă 5% din greutatea corpului

La făt, copil – în toate cavitățile osoase

La adult măduva roșie persistă în:
- epifize oase lungi
- craniu
- stern, coaste, scapule, clavicule
- os coxal
- corpi vertebrali

Măduva galbenă din oase – rezervă de țesut

hematopoietic - prin stimulare pot prolifera
celule nediferențiate celule mieloide

Localizare?

❑ Organe limfoide
- centrale – măduvă, timus
- periferice - noduli limfatici, amigdale, splină

Limfocitele – se formează din celula stem

multipotentă limfoidă cu origine în măduva
hematogenă
Unele migrează în timus limfocite T
Altele se diferențiază în măduvă limfocite B
După diferențiere, migrează în organele limfoide
periferice

❑ Limfocitele B – responsabile de imunitatea umorală, imediată, durată de viață variabilă

❑ Limfocitele T – implicate în imunitatea mediată celular, durată de viață lungă

2
 07/04/2021

Hematopoieza normală se desfășoară în trei compartimente:

Compartiment celule stem multipotente - o mică fracțiune de celule stem suferă
diferențierea la un anumit moment, restul au capacitate de autoreînnoire
Compartiment celule progenitoare – potențial proliferativ ridicat, formează colonii
diferențiate
Compartiment de maturare, funcțional – precede pătrunderea celulelor în circulația
sanguină – singurele identificate morfologic

Hematopoieza normală - produce mai mult de 200 miliarde celule sanguine noi/zi
- intensitate crescută la persoanele afectate de patologii ce
determină pierderea sau distrugerea celulelor sanguine
- necesită - rezerve de nutrienți – fier, vitamina B12, acid folic
- prezența unor proteine care reglează balanța între
reînnoirea celulelor stem, proliferarea și diferențierea cel. hematopoietice – factori de
creștere hematopoietici (FCH)

FCH nu reglează doar hematopoieza ci și activitatea funcțională a celulelor sanguine mature

Denumirea fiecărui FCH derivă de la celula țintă predominantă

Aport inadecvat de nutrienți

deficiența unor celule sanguine funcționale
Lipsa/ineficiența factorilor de creștere

Utilizarea clinică a factorilor de creștere hematopoietici:

- Diverse tipuri de citopenie
Anemie – nr. redus de eritrocite – deficiența cea mai comună
Trombocitopenie – nr. redus de trombocite
Neutropenie – nr. scăzut de neutrofile
Cauze variate: după chimioterapie, datorate patologiilor asociate cu defecte medulare
congenitale/dobândite, după transplant medular, mobilizare de progenitori periferici
- Tratament suport la pacienții cu leucemie

3
 07/04/2021

Factori de creștere hematopoietici

❖ Interleukine (IL)
→ determină producerea și diferențierea limfocitelor, trombocitelor
❖ Factori de stimulare a coloniilor (colony stimulating factors, CSF)
→ determină diferențierea granulocitelor, monocitelor, megakariocitelor
❖ Eritropoietină
→ stimulează diferențierea eritrocitelor
❖ Trombopoietină
→ determină diferențierea plachetelor sanguine

- Sunt glicoproteine ce se deosebesc prin modalitățile de glicozilare

- Majoritatea sunt monomeri (14-24 kDa)
- Au punți disulfurice - adoptarea conformației tridimensionale necesare activit. biologice
- Fiecare factor e codificat de o genă unică care poate fi obținută din diferite surse (linii)
celulare și exprimată în sisteme biologice (bacterii, drojdii) - producere FCH prin
recombinare genetică

Cascada hematopoietică și rolul factorilor de creștere

- FCH sunt cantonați în diferite celule - pot fi eliberați sub acțiunea unor stimuli variați
- Surse celulare principale - limfocite, monocite/macrofage, fibroblaste, cel. endoteliale
- Concentrații serice foarte mici

4
 07/04/2021

Surse celulare și stimuli pentru eliberarea FCH

Factor de creștere Sursa celulară Stimul
G-CSF monocite inducere mediată de lipopolizaharide
fibroblaste activare de către citokine
cel. endoteliale
cel. stem din măduva
hematogenă
GM-CSF limfocite T activare mediată de antigene
monocite inducere mediată de lipopolizaharide
fibroblaste activare de către citokine
cel. endoteliale
M-CSF monocite inducere mediată de antigene
fibroblaste
cel. endoteliale
Eritropoietină rinichi hipoxie, anemie
ficat
Trombopoietină rinichi, ficat activare de către citokine (IL-6)
IL-3 limfocite T activare mediată de antigene

Factori de stimulare a coloniei (colony stimulating factors - CSF)

GRANULOCYTE-COLONY STIMULATING FACTOR (G-CSF) – pluripoietin, CSF-β

• glicoproteină, masa moleculară ≈ 21 kDa

• are un singur situs ce formează o legătură O-glicozidică
• structura tridimensională – stabilizată de 2 leg. disulfurice

➢ Produs de: celule din stroma măduvei osoase, macrofage, fibroblaste

➢ Funcții biologice
• factor de creștere și diferențiere pentru neutrofile și precursorii lor
• activează neutrofilele mature
• acționează sinergic cu alți FCH stimulând creșterea/diferențierea altor celule
progenitoare hematopoietice
• promovează proliferarea și migrarea celulelor endoteliale

5
 07/04/2021

MACROPHAGE COLONY-STIMULATING FACTOR (M-CSF)/ CSF-1

• glicoproteină cu trei potențiale situsuri de N-glicozilare
• structura tridimensională stabilizată de mai multe leg. disulfurice
• la om există trei forme înrudite de M-CSF, toate derivate din aceeași
genă, cu capete C- și N-terminale comune
• forma activă biologic - homodimer
• Există ca proteină integrală în membrana celulară sau ca citokină
solubilă
➢ Produs de: limfocite, monocite, mioblaste, osteoblaste, fibroblaste,
celule endoteliale
➢ Acționează pe macrofage și precursorii acestora
➢ Funcții biologice:
• Factor de creștere, diferențiere și activare a macrofagelor și
precursorilor acestora
• Influențează proliferarea și menținerea altor fagocite mononucleare
(celule dendritice, microglie, osteoclaste)

GRANULOCYTE-MACROPHAGE COLONY STIMULATING FACTOR (GM-CSF)

CSF-α, Pluripoietin-α
• Glicoproteină cu un sigur lanț, 127 aa, masa moleculară ≈ 22kDa
➢ Produs de: macrofage, limfocite T, fibroblaste, celule endoteliale
➢ Acționează pe: celulele progenitoare hematopoietice, granulocite,
monocite, celule endoteliale, megakariocite, limfocite T, celule din
seria eritroidă
➢ Funcții biologice:
• Factor de proliferare/diferențiere a celulelor progenitoare
hematopoietice pentru: neutrofile, macrofage, eosinofile, eritrocite,
megakariocite
• Promovează hematopoieza
• Activează celulele hematopoietice mature determinând:
– creșterea activității fagocitare
– creșterea activității antimicrobiene
– creșterea activității antitumorale
– intensificarea chemotactismului leucocitelor

6
 07/04/2021

Aplicații clinice ale CSF

• rCSF sunt medicamente suport - nu tratează cancerul, dar previn apariția unor
reacții adverse la tratamentul antitumoral, cum ar fi infecțiile
• Necesari doar la pacienții cu risc de a dezvolta neutropenie febrilă în urma
ședințelor de chimioterapie
• Obținuți prin recombinare genetică, administrare în doză de atac, de obicei la 24
ore după tratament
• Frecvent utilizate: filgrastim (Neupogen,Zarxio), sargramostim (Leukine),
pegfilgrastim (Neulasta)

NEUTROPENIE – neutrofile circulante < 1.5x109 celule/L (V.N.- 2.0–7.5x109 celule/L)

• Conduce la infecții frecvente, severe, care necesită adesea spitalizare
• Cauze: chimioterapie antitumorală, transplant medular în leucemia acută și
cronică, anemie aplastică, infecții bacteriene și virale severe, sepsis

FILGRASTIM – produs de referință NEUPOGEN

• G-CSF recombinant human produs de E. coli
• neglicozilat, conține un rest adițional de metionină
la capătul N-terminal
• activitate biologică similară G-CSF nativ
• aprobat pentru neutropenia indusă de chimioterapie în 1991
• sub formă liofilizată
• administrare profilactică sau terapeutică - injecție s.c. 5–10 μg /kg/zi
• concentrație plasmatică peak la 2–8 ore după administrare
• timp de înjumătățire - 2 -5 ore
• bine tolerat, dureri osoase moderate (la 20% dintre pacienți)
• mai multe biosimilare

PEGFILGRASTIM - NEULASTA
• forma PEGilată a filgrastim
• produs în prin recombinare în E.coli și
conjugare cu polietilenglicol (PEG)
• aprobat în 2002 (SUA)
• crește timpul de înjumătățire în
plasmă, reduce frecvența injecțiilor
administrate

7
 07/04/2021

SARGRAMOSTIM – medicament referință LEUKINE

- GM-CSF obținut prin recombinare genetică în
drojdii
- amestec de trei proteine cu mase moleculare
19.5, 16.8 și 15.5 kDa

LEUKINE® - singura formă de GM-CSF aprobată de FDA

• Folosit pentru:
- reconstituire mieloidă după transplant medular
allogen sau autolog, prevenind infecțiile
- îmbunătățirea supraviețuirii după grefare întârziată
- a trata neutropenia indusă de chimioterapie la
pacienții cu leucemie acută mieloidă
- ca o contramăsură medicală pentru tratarea
pacienților iradiați pentru a suprima mielogeneza
osoasă
• Administrare prin infuzie intravenoasă

Transplant autolog vs transplant alogenic

8
 07/04/2021

ERITROPOIETINA (EPO)

• glicoproteină (≈ 40% glucide), 166 aa, masa moleculară ≈ 36 kDa

• trei situsuri de N-glicozilare și unul de O-glicozilare
• citokină atipică – acționează ca un hormon endocrin, nefiind sintetizată
de nici un tip de leucocite

➢ La adulți, sintetizată mai ales în

cel.specializate din rinichi –
răspuns la hipoxie
- în ficat – cantitate minoră

➢ Funcții biologice:
Stimulează și reglează eritropoieza prin:
• crește nr. celulelor obligate să se diferențieze în eritrocite
• accelerează rata de diferențiere a precursorilor eritrocitari
• crește rata de sinteză a Hb în celulele în dezvoltare

9
 07/04/2021

Reglarea producerii de EPO

• Funcție de nivelul de oxigen din

celulele producătoare de EPO, în
raport cu alimentarea cu oxigen
• Debutul hipoxiei → crește ARNm
pentru EPO în celulele
producătoare → crește nivelul
EPO seric
➢ Condiții capabile de a induce
hipoxie și a stimula producerea
de EPO (și eritropoieza):
- deplasarea la altitudine ridicată
- hemoragii
- scăderea fluxului renal
- creșterea afinității Hb pentru O2
- boli pulmonare cronice
- unele boli cardiace

Aplicații terapeutice ale EPO

• aprobată pentru diferite forme de anemie apărute în: insuficiență
renală, artrită reumatoidă, cancer, SIDA, infecții, transplant medular
• prima proteină produsă prin inginerie genetică utilizată în terapie
• utilizată pentru prima dată în 1989 pentru a trata anemia asociată cu
insuficiența renală cronică
➢ rEPO – proteină recombinantă produsă în celule CHO
NEORECORMON – Epoetin beta
• aprobat în 1997 (Roche)
• secvență aa identică EPO umane izolată din urina
pacienților anemici
• seringi preumplute, valabilitate 2 ani la 2–80C
• concentrații variate între 500-50000 UI

• flacon multidoză – pulbere liofilizată albă, solvent pt. soluție injectabilă

• administrată injectabil i.v. sau s.c.
• concentrații serice maxime 8–24 h după administrare s.c.

10
 07/04/2021

Epoetin alfa – EPO umană recombinantă

- pentru tratamentul anemiei la pacienți dializați,
după chimioterapie, înainte de intevenții
ortopedice majore, donatori de sânge
ERYPO®/EPREX® - prima epoetin alfa aprobată în
Europa în 1988
- produsă prin tehnologia ADN recombinant în
celule CHO
- seringi preumplute 2000,4000, 10000, 40000
UI/mL, stocate la 2-8oC
EPOGEN®(Amgen)- aprobată în SUA în 1989
Epoetin alfa – autorizată de EMA (European
Medicines Agency) în 2007
- diferă de primele prin stabilizatorul folosit:
- albumină serică umană
- compus sintetic – polisorbat 80 (din 1998 în
Europa doar epoetin alfa HSA-free)
- formulările sunt bioechivalente

Epoetin Alfa Hexal - „medicament biosimilar”

- similară în proporție foarte mare cu medicamentul de referință Eprex/Erypo
Tolerabilitate Epoetin alfa – bine tolerată în general
- reacții adverse comune: HTA, migrenă, dureri de articulații, coagulare
la locul injectării

DARBEPOETIN-Α (Aranesp, Nespo)

• obținută prin alterarea secvenței de aa din
produsul nativ uman – conține 5 aminoacizi
modificați (N30, T32, V87, N88, T90)
• apar două noi situsuri de N-glicozilare
→ durată de viață prelungită - de 3 ori mai mare
decât epoetin alfa și beta (21h față de 4–6h
pentru molecula nativă)
- bine tolerată
- Efecte adverse asociate tratamentului prelungit la pacienți în stadiul terminal al
insuficienței renale: HTA, risc de evenimente tromboembolice
- după administrare i.v. – sindrom tranzitoriu flu-like
- după administrare s.c. – durere la locul injectării

11
 07/04/2021

TROMBOPOIETINA (TPO)
• Trombocitele - celule necesare hemostazei
• Formate prin diferențierea celulelor stem
medulare într-o linie specifică
• Stadiile terminale - maturarea megakariocitelor
→ mici vezicule înmugurite din membrana
celulară a megakariocitelor se desprind și intră în
circulație - plachete sanguine
TPO – existența sa dovedită în 1990, când a fost
clonat ADCc pentru TPO
• glicoproteină, masa moleculară 60 kDa, 332 aa,
circa șase situsuri de N-glicozilare
➢ Sediul sintezei – ficat, rinichi, mușchi scheletic
➢ Funcții biologice:
• reglator fiziologic primar al formării plachetelor
• controlează proliferarea, diferențierea și
maturarea megakariocitelor și a progenitorilor
acestora
• promovează producerea de plachete sanguine
din megakariocite

Aplicații terapeutice ale TPO

TROMBOCITOPENIA – nr. redus de trombocite
• determină purpură, formarea de echimoze spontan, sângerări prelungite
• indusă de: depresie medulară, chimioterapie, radioterapie, infecții virale
• terapie standard – administrare de 5 unități de plachete

Avantajele terapiei cu TPO:

➢ Siguranță - elimină transmiterea de boli prin tranfuzie
➢ Viață mai lungă, condiții de stocare mai facile
➢ Eficiență – plachetele au antigene de suprafață și pot determina
producere de anticorpi → administrările repetate pot deveni mai puțin
eficiente
• În trialuri clinice – două produse pe bază de TPO recombinant:
➢ Formă glicozilată produsă de o linie celulară mamaliană
➢ Variantă neglicozilată exprimată în E. coli, PEGilată ulterior purificării
- cunoscută ca MGDF (megakaryocyte growth and development factor)

12