Analiza morfologică a elementelor figurate ale sângelui şi calculul

diferenţiat al formulei leucocitare

Principiu. Examenul microscopic al frotiurilor sanguine uscate,
fixate şi vopsite cu descrierea morfologiei eritrocitelor şi numărarea
diferenţiată a leucocitelor cu calcularea raportului lor procentual.
O condiţie importantă pentru studierea precisă a particularităţilor
morfologice ale celulelor sanguine prezintă prepararea corectă a frotiului
şi colorarea lui calitativă.
Intinderea frotiului

Principiu: Se întinde o picătură de sînge proaspăt recoltată pe o

lamă, în strat subţire, în aşa fel încît elementele să nu fie suprapuse,
pentru a cerceta elementele figurate după colorarea cu metoda
obişnuită panoptică.

Material necesar: lame, curate degrasate (pentru ca frotiul să fie

bun), lamă şlefuită, capilare Pancencov.

Tehnica întinderii frotiului:

Se recoltează o picătură proaspătă de sînge pe o lamă la 1-2 cm de la

margine. Lama şlefuită se aplică pe lamă orizontală, în aşa fel încît
picătura de sînge să se întidă, prin capilaritate, la marginea de contact
dintre cele două lame care fac un unghi de aproximativ 30-45°. Se
imprimă apoi lamei şlefuite o mişcare de translaţie uşoară, ceea ce
permite sîngelui să se întindă într-un strat subţire.

Imediat după întinderea frotiului, lama se agită pentru uscarea

rapidă la aer.

În lăţime, frotiul trebuie să aibă două margini paralele, ceea ce se poate

obţine prin întinderea lamei înainte ca picătura de sînge să cuprindă
întregul unghi dintre cele două lame sau prin întinderea sîngelui cu o
lamă şlefuită avînd un colţ rupt. Frotiul se întinde subţire, astfel ca
elementele să nu fie suprapuse.
 Frotiul bun trebuie să aibă o lungime de 3-4 cm, să fie subţire, de
culoare galbuie, în lăţime să fie amplasat la o distanţă de 1 – 3 mm de
la marginea lamei şi să se termine în lungime cu o «măturiţă»,
neajungând cu 1,5 – 2 cm până la capătul lamei.

Se interzice de a se apăsa pe frotiu, deoarece se distrug elementele

figurate. Frotiul trebuie colorat cît mai curînd întrucît, în lamele nefixate
şi necolorate, celulele se alterează, pierzîdu-şi afinitatea tinctorială.
Fixarea frotiului: Înainte de colorare frotiul sanguin trebuie fixat.
Fixarea are scopul de a denatura proteinele din celule şi păstrarea
structurii supravitale a lor. Pentru fixarea frotiurilor pot fi utilizate
următorii reactivi: alcool metilic;

Soluţie eozinmetilenalbastru (May-Grunvald)

Alcool etilic 96°;

Se acoperă frotiul cu un număr cunoscut de picături din reactivul sus

numit şi se lasă 5-10 min-dacă se foloseşte soluţie May-Grunwald sau
alcool metilic, şi 15-20 min cu alcool etilic de 96%. Apoi lama se spală la
robinet sub jet puternic de apă. Se şterge dosul lamei lăsînd-o în stativ
pentru uscare.

Colorarea frotiurilor de sînge:

Pentru descrierea corectă a morfologiei celulelor sanguine

colorarea frotiurilor ca şi prepararea lor are o importanţă deosebită.

Prima încercare de a colora frotiurile sanguine a fost a lui Ehrlich

(1880) cu aşa – numitul „amestec triacidic” care însă a eşuat.

Romanovski D.(1981) a propus metoda de colorare a frotiurilor

sanguine, care sub diferite modificări se utilizează şi în prezent.
Colorantul lui Romanovski conţinea soluţie albastru de metilen şi
eozină.

În practica curentă pentru colorarea frotiurilor se aplică modificările

Noht, Pappenheim şi Romanovski.

În prezent există echpament automat pentru întinderea şi

colorarea frotiurilor, care permit standartizarea condiţiilor de lucru şi
majoreză calitatea frotiurilor.

Clasa unui element sau gradul lui de maturaţie se stabilesc pe

baza unor criterii, care privesc bazofilia citoplasmei, elementelor tinere,
granulaţia granulocitelor, structura nucleului şi acidofilia eritrocitelor
mature.

Acidofilia granulaţiei eozinofile este datorită alcalinităţii (pH-11)

acestor granulaţii. O celulă bazofilă are pH –acid şi se colorează cu
substanţe bazice. Eritrocitul acidofil are pH-4-5, iar eritrocitul
polihromatofil, are pH mai acid, aproape 3. Coloranţii utilizaţi în
hematologie se clasifică în coloranţi acizi, bazici, neutri.

Coloranţii acizi: eozina,

Coloranţi bazici: albastru de metilen, azur I şi II,

Coloranţi neutri: eozinat de albastru de metilen (sau colorantul May –
Grunwald). Astfel, coloranţii acizi sînt fixaţi de porţiunile alcaline ale
celulei, care deci sunt acidofile, iar coloranţii bazici sînt fixaţi de părţile
acide, deci sunt bazofile.

De exemplu: eozina, colorant acid, este fixată de granulaţiile eozinofile

care sunt alcaline, albastru de metilen colorant bazic este fixat de acidul
ribonucleic din citoplasmă, colorînd-o în albastru- Azurul de metilen
fixează acidul dezoribonucleic din nucleu- azurofil. Cu cît o celulă este
mai tînără cu atît citoplasma ei este mai bazofilă, dat fiind concentraţia
mare de acid ribonucleic. Pe măsura maturării, celula devine tot mai
acidofilă, deoarece scade concentraţia în acid ribonucleic. Limfocitele
conţin o cantitate mică de acid ribonucleic în citoplazmă, pe cînd
plazmocitele au o cantitate mare.

Termenii de eozinofil, oxifil, şi acidofil sunt sinonime care indică

afinitatea faţă de coloranţii acizi.

Tehnica colorării:

Reactivi şi materiale necesare:

Reactivi (pulbere)

Apă distilată neutră,

Pipete Pasteur, pipete gradate.

pH apei distilate trebuie să fie 7 sau 7,2. Apa distilată este de obicei
acidă. Neutralizarea ei se obţine adăugînd citeva picături dintr-o soluţie
slabă alcalină de carbonat de sodiu 1% la 500 ml apă distilată,
încercîndu-se pH cu indicator universal de hirtie sau cu hematoxilină,
pH apei se controlează prin adaos de cîteva cristale de hematoxilină,
colorarea apei în roz este indicaţia de neutralitate (hematoxilina este
violet-albastră în mediul alcalin şi galbenă în mediul acid).
Folosirea apei tamponate: se foloseşte un tampon fosfat ( amestecul
Veize), pH =7,2
- Fosfat monopotasic ( KH2PO4 ) – 0,49 g .
- Fosfat disodic dihidrat (Na2HPO4.2H2O ) – 1,14 g sau fosfat
disodic anhidru (Na2HPO4 ) – 0,909 g.

Se pregăteşte ex tempore soluţia de lucru: se amestecă soluţia I şi II în

părţi egale, apoi se foloseşte 1parte tampon +9 părţi apă.

Pentru fiecare soluţie tampon pH-ul trebuie verificat colorimetric sau

electroionometric.

Dacă valoarea ph-lui nu este cea dorită se va corecta adăugînd fie

soluţie I, fie soluţie II după cum amesteculeste mai alcalin sau mai acid.
Corectarea se face sub controlul pH.

Coloraţia după Noht

Reactive: 1. sol. stock azur II: 1g de colorant pulbere se dizolvă într-un

litru apă distilată. Amestecul se lasă la t 37° în sticle bine închise cu un
dop rodat pe -6-8 zile în termostat sau la temperatura camerei se lasă
timp de 12-14 zile, după ce se întrebuinţează.

2. Soluţie stock Eozinat de Kaliu: 1g de colorant pulbere se dizolvă într-

un litru apă distilată. Amestecul se lasă la t 37° în sticle bine închise cu
un dop rodat pe 3-8 zile în termostat, sau la temperatura camerei se
lasă timp de 12-14 zile după ce se întrebuinţează.

3. Apă tamponată.

4. Soluţie de lucru azur-eozin: Înainte de lucru se amestecă 25 ml

soluţie azur II,

20 ml soluţie eozinat de kaliu şi 55 ml apă tamponată ( proporţia de

coloranţi poate varia şi se determină la pregătirea soluţiilor proaspete
de bază).
Tehnica de colorare: Frotiurile fixate se introduc într-un container-
suport special, ultimul se afundă într-o cuvă cu soluţie de colorant şi se
lasă un timp strict limitat de la 20 până la 45 minute. Containerul se
transferă în altă cuvă cu apă de robinet, apoi frotiurile se aşază vertical
la uscat pe un suport. Dacă lipseşte containerul-suport, atunci frotiurile
după fixare şi uscare se vopsesc fiind plasate pe aşa – numitele "şine" –
construcţie formată din două pipete de sticlă unite între ele cu tuburi
de cauciuc. În acest caz frotiurile se acoperă cu un strat gros (3 – 4 cm3)
de soluţie de colorant.

Coloraţia după Romanovski-Gimze

Coloraţia după Romanovski-Gimze se efectuează ca şi Noht. În calitate

de colorant se foloseşte soluţie concentrat Romanovski-Gimze care este
compusă din azur II şi eozin. Înainte de lucru este necesar de dizolvat
colorantul. Dizolvarea colorantului poate fi diferită şi depinde de
calitatea colorantului. Dizolvarea şi timpul de colorare se stabilesc
experimental prin titrarea colorantului.

Titrarea colorantului Romanovski-Gimze:

Se iau 3 cilindri şi se toarnă:

I cilindru: o picătură colorant concentrat la un ml apă distilată;

II cilindru 2 picături colorant concentrat la un ml apă distilată;

III cilindru 3 picături colorant concentrat la un ml apă distilată;

Cu soluţia de lucru din fiecare cilindru se colorează cîte 5-6 frotiuri cu

diferită durată de timp 20,25, 30, 35, 40 min. frotiurile se
microscopiează şi se selectează frotiul care este mai bine colorat.
Dizolvarea este titrul seriei colorantului, iar durata-expoziţia
permanentă. Aceste date se indică pe eticheta borcanului. Exemplu:
titrul 2 picături-1 ml H2 O2, expoziţie 25 min.

Coloraţia după Pappenheim

Reactive: 1. Soluţie eozin-metilen albastru după May-Grunvald. La lipsa

soluţiei gata de lucru ea se poate pregăti: se dizolvă 1g de colorant
pulbere ]n 1000ml alcool metilic. Soluţia este gata de lucru peste 4 zile.

2. soluţie de lucru azur-eozin după Noht.

Coloraţia Frotiurile nefixate uscate se plasează într-o cuvă cu soluţie

May-Grunvald pe 2-3 min. Containerul cu frotiuri se spală în cuvă cu
apă distilată (sau pe frotiul plasat pe podişor ne vărsînd colorantul se
adaugă apă distilată pe 1 min.). Se plasează containerul cu frotiuri în
cuva cu colorantul azur-eozin după Noht (sau se toarnă colorant pe
frotiu) pe 8-15 min. Colorantul se spală cu apă curgătoare. Frotiurile se
usucă la aer.

În prezent se propune un spectru larg de test-sisteme pentru

colorarea rapidă a frotiurilor de sînge timp de 20-30 secunde.

În prezent se pemite fixarea şi colorarea automată a frotiurilor cu

ajutorul unui echipament special unde se aplică frotiurile nefixate.
Dozarea automată a fixatorului-colorant şi soluţiilor tampoane permite
colorarea standartă şi uniformă a frotiurilor de sînge.

Examinarea frotiului de sînge

Pe frotiu se pune o picătură de ulei de cedru (ricină) şi se fixează

poziţia microscopului folosind obiectivul cu imersie 90, diafragmul
deschis, condensatorul sus. Marginea frotiului se examinează în zig-zag
şi se începe cu extrimitatea frotiului (în sensul lungimii). Lama se
deplasează într-o singură direcţie. Pe măsură ce se întîlnesc leucocitele
în cîmpul microscopic se notează pe un contor. În primul rînd se
apreciază morfologia eritrocitelor, cu deviaţii în dimensiuni, formă şi
gradul de saturaţie cu hemoglobină, depistarea incliziunilor, apoi se
numără formula şi se apreciază morfologia leucocitelor, apoi se
apreciază morfologia trombocitelor.

La numărătoarea formulei leucocitare există 3 grupe de erori:

I repartizarea neuniformă a celulelor în preparat,

II cunoaşterea insuficientă a celulelor (identificarea lor)

III statistica (numărătoarea celulelor)

În frotiul obişnuit leucocitele se repartizează la măturiţă şi la

marginea preparatului şi nu în centru deoarece leucocitele se
deosebesc după proprietăţile lor fizice ( dimensiuni, densitatea relativă,
elasticitate). La margine se repartizează neutrofilele, monocitele,
eozinofilele în centru limfocitele. Deaceea lama se mişcă numai într-o
direcţie. Se numără căteva cîmpuri de vedere de-a lungul marginii, apoi
se întorc în centru şi aşa pînă se numără 100 celule. Frotiul întins greşit
sau fixat şi colorat incomplect este eroarea principală în diferenţierea
celulelor.