DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC

REACŢII ANTIGEN - ANTICORP

Asocierea unui anticorp cu antigenul său specific depinde de interacţiunea necovalentă

dintre epitop şi paratop; definirea reacţiilor AG - AC se bazează pe consecinţele formării
complexului imun elementar.

Bazele moleculare ale interacţiunii AG - AC:

Reacţiile AG - AC se bazează pe complementaritatea structurală dintre epitop (aparţinând AG) şi

paratop (aparţinând AC). Complexul imun elementar este complexul AG - AC la nivel molecular,
descris precum modelul ,,cheie - broască” sau modelul ,,mâinilor care se strâng”.
Complementaritatea stereospaţială epitop - paratop generează noi forţe fizice de atracţie, precum
forţele electrostatice, legături de hidrogen, forţe van der Waals.
Din cauza legăturilor fizice dintre reactanţi, reacţiile AG - AC sunt întotdeauna reversibile; AC nu
alterează AG. Reversibilitatea (disocierea complexelor AG - AC) poate fi considerată o reacţie
unimoleculară în care viteza de reacţie este dependentă de concentraţia complexului imun. După
studii în care reactanţii au fost marcaţi radioactiv, timpul de înjumătăţire al reacţiilor antigen -
anticorp a fost estimat ca durată minimă de trei ore, până la T1/2 maxim de 8 zile.
Interacţiunile AG - AC depind de concentraţiile reactanţilor, complexele imune formându-se cu
probabilitate maximă la concentraţii echimoleculare ale AG şi AC.
În reacţiile imunologice, specificitatea, afinitatea şi aviditatea anticorpilor au un rol extrem de
important.
Specificitatea - reprezintă capacitatea unui anticorp de a deosebi antigenul faţă de care a fost
produs, faţă de alte antigene cu structură asemănătoare. Serurile imune incomplet purificate pot
determina reacţii imunologice încrucişate.
Afinitatea măsoară forţa de legare dintre un epitop şi un paratop, respectiv suma forţelor de atracţie
şi de repulsie dintre cele două componente ale sistemului imun elementar.
 Constanta de afinitate (Ka) sau de ,,echilibru” se poate calcula după formula:

Ka = Kas / Kdis = [AG - AC] / [AG] x [AC] , unde:

Ka = constanta ratei de asociere
Kdis = constanta ratei de disociere
[AG] = concentraţia epitopilor
[AG - AC] = concentraţia complexului imun
[AC] = concentraţia situsurilor de legare liberă a AC
[,,X”] = concentraţia molară
Constanta K va fi mare pentru complexele imune cu afinitate crescută.

Aviditatea caracterizează energia medie a interacţiunii de legare a unui antigen cu epitopi multipli şi
diferiţi, cu anticorpii specifici induşi de către aceştia. Spre deosebire de afinitate, care furnizează
date despre natura fizico-chimică a interacţiunilor AG-AC, aviditatea este semnificativă pentru
antigenele naturale, care sunt multivalente în realitate. Avantajul multivalenţei este faptul că
aceasta creşte energia de legare de 103 ori în cazul IgG (bivalente) şi de 107 ori în cazul IgM
(multivalente).
Afinitatea şi aviditatea crescută a anticorpilor specifici determină reacţii imunologice
favorabile organismului: protecţie antibacteriană, antivirală, antimicotică, antiparazitară,
antitumorală, neutralizarea efectului citopat viral etc. Complexele imune cu afinitate scăzută persistă
în circulaţie sau se depun în unele ţesuturi (spre exemplu, glomerulul renal) şi determină variate
consecinţe imunopatologice.
La temperatura corpului, creşte viteza de asociere a AG cu AC specifici, de aceea
majoritatea reacţiilor imunologice cu scop diagnostic (aglutinare, precipitare, etc.) se incubează la
37oC. Pentru evidenţierea crioaglutininelor, incubarea reacţiei se face la temperaturi scăzute
(4oC).
Tipul de reacţie imunologică observat depinde de starea fizică a antigenelor, precum şi de
condiţiile experimentale (ex.: temperatura optimă sau pH-ul optim al reacţiei, cuprins între 6,5 şi
8,5). Spre exemplu, antigenele particulate generează reacţii de aglutinare, antigenele solubile
produc reacţii de precipitare.
Sensibilitatea reacţiilor AG - AC cu rol diagnostic poate fi cuantificată prin numărul efectiv de
particule necesare pentru a produce o reacţie vizibilă; spre exemplu, 107 celule bacteriene produc
o reacţie de aglutinare evidentă, spre deosebire de 6 x 1012 molecule de antigen solubil care
produc o reacţie de precipitare detectabilă.
Teoria ipotezei unitare a anticorpilor postulează faptul că fiecare moleculă de anticorp poate
desfăşura mai multe tipuri de reacţii imunologice, corespunzător specificităţii respective (,,anticorpi
multipotenţi”).
Reacţiile AG - AC cu scop diagnostic sunt foarte variate; toate reacţiile serologice îşi propun
evidenţierea anticorpilor specifici şi titrarea lor. Creşterea progresivă a titrului anticorpilor semnifică
infecţii în evoluţie.

Principalele reacţii imunologice cu rol diagnostic pot fi clasificate:

Reacţii de agregare
Reacţii de aglutinare - pe lamă
- în tuburi
- pe suport (ex.: latex aglutinare,
hemaglutinare pasivă)
Reacţii de precipitare - precipitarea inelară
- reacţia de floculare
- precipitare în gel
- difuzie simplă - Metoda Oudin
- Imunodifuzia radială Mancini
- difuzie dublă - Metoda Outcherlony
- Imunelectroforeza
- Contraimunelectroforeza
Reacţii AG - AC cu participarea complementului
Bacterioliza, Virionoliza virusurilor învelite (Imunocitoliza)
Imunhemoliza
Imunocitoaderenţa (ex: rozete EAC) şi opsonizarea
Imunoaderenţa, imunocitotoxicitatea
Reacţia cu fixarea sistemului complement (RFC, cu variantele tehnice: Ida Bengston, Kolmer,
Bradstrecet Taylor etc.)
Reacţii cu anticorpi monoclonali (AMC) specifici
Reacţii AG - AC cu complexe imune vizualizate prin artificii tehnice
Imunofluorescenţa (IF) - metoda directă şi indirectă
Radioimunotestarea (RIA) - metoda directă şi indirectă
Teste imunoenzimatice (ELISA) - metoda directă şi indirectă
Reacţii de seroneutralizare (RSN) - pentru diagnosticul infecţiilor virale
Principiul reacţiilor, tehnica de lucru şi interpretarea acestora sunt descrise la lucrările
practice. Alegerea uneia sau alteia dintre reacţii, pentru diagnosticul unei boli infecţioase - se
bazează pe mai multe criterii: natura agentului etiologic, sensibilitatea reacţiei, clasa
imunoglobulinelor de identificat (ex.: titruri înalte de IgM semnifică infecţie acută) şi nu în ultimul
rând, la noi în ţară, în funcţie de posibilităţile materiale ale laboratorului respectiv.

TESTE CARE EVIDENŢIAZĂ IMUNITATEA MEDIATĂ CELULAR

Imunitatea mediată celular are ca efector specific limfocitul T, iar ca celulă asociată,
macrofagul.
Prin testele de imunitate celulară se poate aprecia funcţionarea normală a IMC; diminuarea
răspunsului imun celular se poate observa în afecţiuni congenitale, infecţii virale, bacteriene,
fungice, parazitare, cancere, hepatite cronice, etc.
Testele IMC pun în evidenţă şi existenţa unui răspuns imun celular specific faţă de un
anumit antigen (ex.: i.d.r. la tuberculină, brucelină etc.)
Testele IMC pot fi efectuate in vivo şi in vitro. Clasificarea reacţiilor este următoarea:
Teste in vivo
Intradermoreacţia, care evidenţiază starea de hipersensibilitate de tip tardiv (prototip - i.d.r. la
tuberculină). Reacţia investighează IMC globală şi prezenţa macrofagului activat prin limfokinele
limfocitului TH.
Teste in vitro
Testele sunt foarte complexe, nefiind introduse în activitatea de rutină. Mai frecvent utilizate
sunt:
Numărarea limfocitelor T
Evaluarea raportului dintre limfocitele TCD4 şi TCD8.
(Raportul lfTCD4 / lfTCD8 >1 semnifică valori normale, valoarea subunitară fiind expresia
imunosupresiei).
Capacitatea de proliferare (ca răspuns imun) la un stimul mitogen. Se evidenţiază prin:
Transformarea blastică a limfocitelor
Cultura limfocitară mixtă (MLC).
Capacitatea productivă de citokine se investighează prin:
Evidenţierea MIF şi LIF (factori de inhibare ai migrării macrofagelor şi respectiv ai leucocitelor
polimorfonucleare)
Evidenţierea factorilor mitogeni limfocitari (FML) şi ai limfotoxinelor
Evidenţierea interferonului sau a factorilor chemiotactici.
Manifestarea citotoxicităţii (lfTCD8) faţă de celula ţintă:
Teste de limfocitotoxicitate - evidenţiază mecanismele distrugerii celulei ţintă, care are izotopi
radioactivi încorporaţi. Eliberarea în supernatant a izotopului se detectează cu ajutorul unor
contoare speciale. Testele au aplicabilitate în determinarea şi tipizarea antigenelor HLA, în
imunitatea antitumorală şi antivirală.
Flow-citometria
Reprezintă o metodă modernă de diagnostic, care realizează identificarea şi sortarea
celulelor aflate într-un flux lichid, pe baza unui parametru fizic sau chimic care le caracterizează.
Flow-citometrele utilizează diverse tipuri de lasere, numărătoare electronice de celule şi programe
computerizate de sortare celulară (500 - 7000 celule/secundă, cu puritatea sortării de 97%). Pentru
detectarea antigenelor de suprafaţă celulară se utilizează anticorpi monoclonali specifici,
fluorocromi (IF), fluorocitokine. Fluorokinele sunt interleukine cuplate cu o substanţă fluorescentă,
pentru detectarea unor subpopulaţii celulare cu răspuns imun diferit la variaţi mesageri chimici
imunologici (IL1, IL2, IL6, LiF etc). Se deschid noi perspective de cercetare şi diagnostic în
imunologie, prin avantajele oferite de flow-citometrie, metodă care poate preciza:
Conţinutul celular în acizi nucleici
Numărul reticulocitelor
Proporţia: limfocite, monocite, granulocite în sângele periferic (inclusiv transpunere grafică)
Raportul dintre limfocitele TCD4 şi TCD8
Histocompatibilitatea, în vederea realizării unui transplant (prin determinarea unor antigene HLA)
Rezistenţa celulelor tumorale la terapia citostatică
Nivelul proliferărilor celulare (prin detectarea markerului CD69 prin testul Fastimmune)
Nivelul citotoxicităţii anumitor celule
Eficienţa fagocitozei (Phago-test)
Producţia radicalilor liberi în fagocitoză
Starea metabolismului oricărei celule (influx de Ca2+, K+, pH intern)
Noţiuni de citogenetică
Prezenţa unor autoanticorpi fixaţi pe suprafaţa sau în interiorul unor celule (anticorpi antimuşchi
neted, AC antinucleari)
Existenţa unor molecule de suprafaţă celulară pentru care încă nu există anticorpi monoclonali
specifici, prin utilizarea fluorokinelor
Diverse antigene de suprafaţă celulară (CD4, CD8, CD19, CD20, CD69 etc., antigene HLA,
receptori diverşi), realizându-se ,,imunofenotipizarea celulară”, cu ajutorul anticorpilor monoclonali
specifici marcaţi fluorescent. Imunofenotipizarea celulară este cea mai utilizată metodă flow-
citometrică. Firma Becton - Dickinson a lansat o gamă largă de
kit-uri de diagnostic:

Kitul Simul Set IMK Plus, Kitul LeuKaemia Immunophenotyping - depistează hemopatii
maligne ,,border-line”. Kitul Tri-Test permite determinarea numărului absolut de celule CD4, CD8,
CD19; kitul Fastimmune evidenţiază proliferarea celulară (CD69). Aparatele cele mai moderne
produse de către firma respectivă sunt: FACS Vantage şi FACS Calibur care pot realiza o gamă
largă de operaţiuni. Cele mai recente flow-citometre sunt uşor manevrabile (,,user friendly”),
precum FACScan sau EPICS, dar în aceste situaţii aplicaţiile diagnostice sunt foarte specifice.

Fig. nr. 42 - Imagini flow-citometrice ale unor subpopulaţii celulare din sângele periferic, cu
AC monoclonali ai trusei Simul Set (Virgil Păunescu şi colab)