MVP

PREPARATE MICROSCOPICE SI COLORATII

1. Preparatul nativ : - proaspăt, umed ,necolorat / preparat intre lamă si lamelă
- Se foloseste pentru detectarea unor protozoare (chisturi /trofozoiti) , a helmintilor (oua sau
larve) ,a fungilor.
- mai putin pt studiul bacteriilor.
- Bacteriile mobile dintr-un produs patologic (lichid sau solid ) sau dintr-o cultura bacteriana
dezvoltata pe un mediu de cultura solid sau in interiorul unuia lichid
Metoda :
- Pe o lama curata si degresata se aplica cu o pipeta o picatura din produsul de examinat – direct
din acesta ,daca produsul patologic este unul lichid sau dintr-o suspensie a lui in ser fiziologic
steril (daca pp este solid).
- Se ia o lamela care se aseaza cu o latura pe lama
- Se inclina la 45 grade si se lasa sa cada peste picatura de lichid => preparat intre lama si lamela
Examinarea:
- La microscop folosind obiectivele uscate ( mici : 10,20,40 x)

2. Preparatul fixat=frotiu
- Se pot face dintr-un produs patologic recoltat de la un bolnav sau de la animalul de laborator
sau dintr-o cultura bacteriana dezvoltata pe un mediu solid sau intr-unul lichid

Etapele: 1.Etalarea 2.Uscarea 3.Fixarea 4.Colorarea

1.Etalarea – in functie de starea de agregare a produsului
Din cel lichid: (sau dintr-o cultura in mediul lichid)
- Pe o lama se pune cu pipeta (sau ansa bucla) o picatura de produs care se intinde cu ansa bucla
intr-un strat cat mai subtire prin miscari circulare
Dintr-un prod patologic solid sau cultura de pe un mediu solid:
- Se aplica o picatura ser fiziologic in apropierea careia se va descarca cu ansa bucla o cant mica
de produs
 - Se amesteca circular omogenizand produsul care se intinde intr-un strat cat mai subtire cu ansa
bucla.
Din sange:frotiu sanguin
- Pe lama curata + degresata se aplica o picatura de sange
- Se intinde rapid intr-un strat uniform si cat mai subtire cu ajutorul unei lame slefuite ,ceva mai
ingusta ,care este tinuta la 45 grade si careia i se imprima o usoara miscare de translatie in
lungul lamei
Frotiul corect: transparent si omogen ( sa nu atinga mariginile lamei)
2.Uscarea
-in aer, acoperite cu capacul unei cuti Petri (ferite de praf)
-prin agitare in aer ( frotiul sanguin)
3.Fixarea
-determina aderarea prod pataologic la lama si pregateste etapa urmatoare ,de colorare a frotiului;
Moduri :
A. Prin caldura :
- Se trece frotiul cu fata in sus de 3-4 ori prin partea superioara a flacarii becului Bunsen
- Se aplica lama pe tegumentul fetei dorsale a mainii, considerand fixarea suficienta daca se
percepe o senzatie de arsura suportabila.
- Daca fixarea este insuficienta => spalarea frotiului de pe lama in etapa urmatoare
- O fixare prea indelungata => poate distruge elementele bacteriene
B. Cu substante chimice
- Consta in introducerea lamei intr-un recipient cu solventi (alcool etilic) un interval de timp
- Se aplica bacterilor mai sensibile care se distrug daca sunt fixate prin caldura.
4.Colorarea
- Bacterile vii, necolorate ,sunt greu vizibile la mircoscop de aceea frotiurile sunt intotdeauna colorate
inainte de a fi examinate
Colorarea bacteriilor :
- Este rezultatul unor interactiuni fizico- chimice intre subst colorata si constituenti ai celulei
bacteriene
Colorantii sunt compusi colorati capabili sa-si transfere culoarea unui substrat, care datorita structurii
chimice ,are afinitate pentru acestia. Colorantii au 2 tipuri de grupari chimic active:
- CROMOFORA ( det. culoarea proprie a colorantului)
-AUXOCROMA ( det culoarea substratului si imprima colorantului caracterul acid sau bazic)-
OH,COOH,SH,NH2,NO2
Majoritatea bacteriilor se coloreaza cu coloranti bazici:
- Albastru de Metilen
- Fuxina bazica
- Violet de gentiana
Clasificarea coloratiilor :
a) Dupa nr. colorantilor folositi
b) Dificultatea de realizare

COLORATII UZUALE : Simple si compuse (diferentiale)

-evidentiaza caract morfologice ale bacteriilor : forma , marime , gruparea bact , raporturile lor cu cel
organismului (elem morfo care pot orienta diagnosticul)
Coloratiile :
Simple :folosesc un singur colorant
Compuse :utilizeaza doi sau mai multi coloranti

COLORATII SPECIALE:
-evidentiaza componente bacteriene care se coloreaza dificil sau deloc in coloratii uzuale

COLORATII SIMPLE :
a) Coloratia cu ALBASTRU DE METILEN- in care frotiul fixat este acoperit cu o solutie
fenicata(fenolata) de albastru de Metilen 1% care se lasa sa actioneze timp de 1-2 min
- Se spala colorantul de pe lama
- Se usuca frotiul
- Se examineaza la microscop cu obiectivul de imersie(90x) folosindu-se 1 pic de ulei de cedru
Mecanismul coloratiei:
- Albastru de Metilen = colorant bazic => realizeaza schimburi ionice cu gruparile acide
(carboxilice din struct cel bacteriene)
- INTERPRETARE-Bacteriille si alte celule din organismul uman => colorate in albastru
b) Coloratia cu Fuxina bazica- 1% timp de 1-2 min
- Bact si alte celule => colorate in rosu
COLORATIILE DIFERENTIALE (COMPUSE):
-evid pe langa caract morfoloice si tinctorialitatea (=afinitatea bact pt anumiti coloranti) bacteriana

COLORATIA GRAM :
Etape : 1.Colorarea 2.Mordansarea 3.Decolorarea 4.Recoltarea
1. Colorarea :- prin acoperirea frotiului fixat cu violet de gentiana 1% timp de 1-2 minute
- se varsa colorantul de pe lama
2.Mordansarea => acoperirea lamei cu o subst numita mordant(sol Lugol)I2+KI- timp de 1-2 min
- se varsa mordantul de pe lama
3. Decolorarea - pe lama tinuta inclinat se toarna un amestec decolorant format din alcool -acetona in
raport de 5 la 1 cateva secunde pana cand lichidul scurs de pe lama devine incolor
- se spala frotiul cu apa de robinet
4. Recolorarea - se acopera frotiul cu sol fenicata de fuxina bazica 1% timp de 1-2 minute
- se spala cu apa de robinet
- se usuca
- examinare la microscop cu imersie

Mecanismul:
In prima etapa : - Colorantul, violet de Gentiana coloreaza toate elem de pe lama prin schimburi ionice
intre gruparile lui bazice si cele acide ale peretelui bacterian.
In a 2a etapa : - mordantul are rolul de fixator de culoare
-iodul care are afinitate si pt colorant si pt constituentii peretelui bacterian va patrunde in celula
bacteriana ,formand complexe insolubile cu colorantul, care este legat la randul lui de structurile
peretelui bacterian;(culoarea ramane in continuare violeta).
In a 3a etapa: - amestecul alcool- acetona(decolorantul) ,va dizolva lipidele din struct peretelui
bacterian;
-in cazul bact Gram-negative, care au un continut ridicat de lipide in peretele bacterian ,se produce
decolorarea pentru ca violetul de gentiana este eliminat din celula odata cu lipidele
-in cazul bact Gram- pozitive, care sunt mai sarace in lipide, colorantul se mentine in celula, ele
ramanand colorate in continuare in violet
In ultima etapa ( cu fuxina bazica) : - se vor recolora bact decolorate anterior ( gram-negative) care vor
deveni rosii
Aceasta col permite o clasificare a bact in 2 mari grupe :
 Bact Gram pozitive -> col in VIOLET
 Bact Gram negative -> col in ROSU
Ex gram pozitiv : SSPDATL ( S= stafilococi , S= streptococi , P = pneumococul ,D= bacilul difteric, A=
bacilul antraxului, T= bacilul tetanic, L = levuri (ciuperci parazite)
Ex gram negativ : „ ella” ( tot ce se termina cu sufixul „ella) : ex : Salmonella , Klebsiella , Shigella ,
Neisseria, E.Coli, Vibrio .
 Examen microscopic

Coloraţia Gram
Se urmăreşte afinitatea tinctorială a bacteriilor
Interpretare bacteriile Gram-pozitive: violet
bacteriile Gram-negative: roşu
 

Frotiu efectuat din produs patologic sau din

cultura bacteriană
    
  Colorant Timp Bacter Bacter  
colorar ii ii
e Gram Gram-
+

1 colorare cu violet 2
de genţiană minute
 Bacteriile
si alte
elemente(
cellule
umane)ap
ar colorate
VIOLET.

2 mordansare cu 2
sol lugol minute
 lugolul
fixează
colorantul
(violet de
genţiană)
în peretele
bacteriilor
Gram+

spălare cu apă de        
robinet
3. decolorare cu 2
alcool -acetona minute
 alcoolul
este
capabil să
extragă
colorantul
din toate
structurile
de pe
frotiu, cu
excepţia
bacteriilor
Gram+

 dizolva
lipidele
din
peretele
bacteriilor
Gram-(se
decolorea
za)

spălare cu apă de        
robinet

4. recolorare cu 2
fuxină bazica minute
 fuxina
recoloreaz
ă
structurile
decolorate
anterior(G
ram--
ROSII

spălare cu apă de        
robinet
 Uscare-        
EXAMINARE
CU IMERSIE

Coloratia ZIEHL – NIELSEN

Etape : 1.Colorarea 2. Decolorarea 3. Recolorare
1. Colorarea : - frotiul fixat se acopera cu fuxina bazica 1% si apoi este incalzit pe dedesubt cu flacara
becului Bunsen pana la emisie de vapori(fara ca lichidul sa fiarba).
- se raceste si se repeta incalzirile de 2-3 ori in 10 minute
- se scurge colorantul de pe lama.
2. Decolorarea:-cu un amestec decolorant (alcool- acid) pana cand lichidul scurs de pe lama devine
incolor
- se spala cu apa de la robinet
3.Recolorarea -cu albastru de Metilen 1% timp de 1-2 minute
-spalare cu apa de la robinet
-uscare si examinare cu imersie
Se foloseste pentru bact cu un continut ridicat de lipide in peretele celular
-bact care se coloreaza dificil- numai la temp ridicate si doar cu coloranti puternici
[AAR = acido- alcoolo – rezistenta]
-aceste bact au proprietatea de AAR ( este data de un hidroxi- acid din struct peretelui bacterian -> acid
micolic)
- genul Mycobacterium (Cel mai important M.Tubercuolosis – bacilul Koch )
Interpretarea :
Bact. AAR=> colorate in rosu pe fondul albastru al preparatului.
Coloratiile SPECIALE:
- Componente bacteriene- greu vizibile in col uzuale.
 1 COLORATIA CAPSULEI BACTERIENE:
- Capsula bact din cauza struct chimice nu se col prin col uzuale si apare microscopic ca o zona
luminoasa (refringenta) in jurul corpului bacterian.
- Se foloseste o picatura de tus de China si fuxina bazica
- Capsula va apare colorata in negru pe fond rosu
 2 COLORATIA SPORILOR BACTERIENI
- Sporii, in col uzuale, apar necolorati (stralucitori) atasati corpului bacterian
- Sporii au o densitate mare a continutului si o afinitate scazuta pt coloranti (se pot colora doar cu
coloranti puternici si la temp ridicate)
- Se fol verde malahit si fuxina bazica
Tehnica : asemanatoare cu col Ziehl- Nielsen
Interpretare :
- Sporii apar colorati in verde
- Corpul bacterian -in rosu
-