Cromatografia de lichide de înaltă

performanță (HPLC)
Analiza cromatografică - introducere

Analiza cromatografică presupune separarea și analiza componentelor unei probe.

Separarea se realizează prin atingerea repetată a echilibrului de distribuție între două faze: faza
staționară și faza mobilă – o soluție a amestecului din probă. Faza staționară se găsește de
regulă într-un tub denumit coloană cromatografică.
Amestecul supus separării se introduce într-o zonă îngustă de la începutul coloanei. Faza
mobilă (eluentul) este lăsată să se scurgă cu o viteză constantă prin golurile fazei staționare,
provocând migrarea, cu viteze diferite, a componentelor amestecului de-a lungul coloanei.
Astfel, moleculele migrează în grupuri ce conțin același tip de molecule. Aceste grupuri părăsesc
pe rând coloana, făcându-se posibilă determinarea componentelor cu ajutorul unui analizor
fizico-chimic. Acest instrument (detector) are rolul de a transmite un semnal proporțional cu
masa sau cu concentrația componentelor. Pe baza semnalului se întocmește o cromatogramă,
pe care se disting o serie de maxime, numite peak-uri, care se produc deasupra liniei de bază ce
este paralelă cu axa timpului și apare de fiecare dată când nu este detectat niciun component în
afara eluentului

Tipuri de tehnici cromatografice

Există numeroase variante ale metodei cromatografice, clasificate în funcție de natura

fazei mobile astfel:
a) Cromatografie de lichide (LC) – pe coloană deschisa sau închisă;
b) Cromatografia de gaze (GC)
c) Cromatografia de fluide supercritice
Cromatografia de lichide se împarte în cinci categorii în funcție de mecanismele de
separare:

 Cromatografia de adsorbție: se utilizează adsorbanți cum ar fi silicagelul sau alumina

pentru separarea substanțelor organice de dimensiuni mici;
 Cromatografia ionică: se folosesc coloane umplute cu schimbători de ioni cum ar fi
rășinile schimbătoare de ioni;
  Cromatografia de excluziune sterică: denumită și filtrare prin geluri sau permeație
prin geluri, presupune utilizarea de faze staționare poroase ce rețin moleculele care
depășesc o anumită dimensiune;
 Cromatografia lichid-lichid (LLC): cele două faze lichide sunt nemiscibile, cea
staționară este imobilizată pe un suport solid;
 Cromatografia pe coloană deschisă: este denumită și cromatografie pe strat subțire.
Faza mobilă circulă pe un material poros dispus într-un plan.

Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC)

Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC - High Performance Liquid

Chromatography) este cea mai performantă metoda cromatografică la ora actuală și este
folosită în separarea și identificarea calitativă și cantitativă a substanțelor din amestecuri
lichide. Folosind HPLC se pot realiza cu ușurință separări și analize imposibil de realizat prin alte
metode. Pe de altă parte la această tehnică pot interveni și multe erori umane costisitoare. Din
acest motiv este nevoie de o experiență practică bogată dar și de cunoștințe științifice
fundamentale.
Aparatura folosită în HPLC permite folosirea mai multe tipuri de coloane închise și de
detectori, favorizând aplicarea mai multor variante de cromatografie de lichide pentru o gamă
largă de amestecuri. Detectorii folosiți în HPLC sunt detectori selectivi, ceea ce înseamnă că ei
nu răspund la toate moleculele existente într-un amestec ci numai la anumite molecule sau
clase de compuși.
Dacă în timpul separării cromatografice compoziția substanței de analizat rămâne
constantă tehnica de cromatografică este denumită eluție izocratică. Dacă compoziția fazei
analizate este schimbată în timpul procesului de separare după o modalitate prestabilită,
tehnica poartă denumirea de eluție de gradient. Cea din urmă tehnică este folosită atunci când
domeniul timpilor de retenție a moleculelor din probă este atât de mare încât acestea nu pot fi
eluate într-un timp rezonabil cu un solvent pur sau cu un amestec de solvenți.
Unele molecule de probe sunt greu de detectat în HPLC și trebuie aduse după părăsirea
coloanei cromatografice într-o formă detectabilă, tehnică denumită derivatizare după coloană.
Ca și la alte cromatografii în condiții tehnice date pentru analiza calitativă este deosebit de
important timpul necesar unei molecule din probă pentru a traversa sistemul cromatografic și a
ajunge la detector, timp denumit timp de retenție. Unele substanțe au timpi de retenție identici
situație în care peak-urile se suprapun putând da naștere la erori importante de interpretare.
Pentru înlăturarea acestui neajuns cele mai importante detectoare pentru HPLC sunt
spectrometrele. Tot mai des ieșirile din coloanele cromatografice se cuplează la spectrometre
clasice cel mai des folosit fiind spectrometrul de masă (MS). Aceste combinații de aparate au
sisteme de performante de prelucrarea datelor ce permit identificarea automată prin
compararea electronică a spectrului oricărei specii moleculare, în momentul sosirii ei din
coloana cromatografică la spectrometru, cu spectrele etalon din bibliotecă electronică de
spectre. Se evită astfel necesitatea întocmirii de noi curbe de etalonare pentru fiecare tip de
amestec în parte.
În cadrul ICPL, dat fiind faptul că s-a renunțat la acreditarea pentru analize folosind HPLC
din motive de cerere extrem de reduse,

Aplicație HPLC – determinarea cantității de formaldehidă dintr-o probă

de piele

Formaldehida este una dintre cele mai folosite substanțe la sintetizarea agenților de
tăbăcire a pielii fără crom hexavalent. Principalele avantaje ale folosirii formaldehidei sunt
costul redus și reactivitatea mărita a acesteia. Este însă foarte dificil ca întreaga cantitate de
formaldehidă să fie consumată în procesul de sinteză, astfel rămân cantități importante de
formaldehidă liberă/reversibilă în substanțele rezultate. În consecință, formaldehida ajunge în
pielea procesată folosind acești compuși.

Formaldehida este clasificată ca substanță cancerigenă și teratogenă, iar în Uniunea Europeană

cantitatea de formaldehidă reziduală permisă pentru produsele din piele este strict
restricționată și nu trebuie să depășească 75 mg/kg, conform standardelor stabilite de ECHA
(European Chemicals Agency).
Metoda standard pentru determinarea formaldehidei din piele este ISO 17226-1.
Aceasta presupune: extracția substanței din piele folosind o soluție de detergent, reacția cu 2,4-
dinitrofenilhidrazină (DNPH) și determinarea concentrației de formaldehidă prin HPLC. Dar,
folosind această metodă, rezultatele pot fi inexacte atunci când în probă se găsesc anumite
rășini ce pot influența rezultatul datorită procesului de hidroliză.
În astfel de cazuri o metodă de difuzie dinamică a fost stabilită de TEGEWA-group, pe
baza căreia a fost publicat o nouă metodă standard: ISO 27587-2009. Această metodă
presupune extracția de tip gaz-lichid formaldehidei folosind un jet de azot molecular pentru a
antrena moleculele de formaldehidă și apoi a le capta într-un cartuș special ce conține DNPH,
dar cartușul s-a dovedit a fi prea costisitor pentru analize de rutină.
Un studiu publicat în 2019 propune o metodă alternativă, în care proba este incubată
într-un tub în forma de U, prin care este lăsat să treacă azotul pentru a antrena formaldehida,
apoi aceasta este extrasă într-un tub de absorbție folosind o soluție DNPH. Soluția de absorbție
poate fi obținută folosind o soluție de concentrație 0.3% de DNPH în acid fosforic, acetonitril și
apă distilată cu raportul 1:8:11 (v/v/v).
 După extracție soluția este diluată și lăsata la întuneric 30 – 150 de minute, apoi filtrată
și analizată folosind HPLC. Volumul injectat este de 20 de μL, eluentul folosit este o soluție de
acetonitril în apă distilată (6:4, v/v) cu o viteză de curgere de 1 mL/min la temperatura de 30°C.
Dispozitivul de detecție folosit este un fotodetector UV-VIS cu diode (DAD – diode array
detector).