I, EYALUAREA IMUNOLOGICA $I ALERGOLOGICA 11.1, Reactii Ag-Ac 11.1.1.Precipitarea 11.1.2.Aghutinarea 11.1.3.Reactia de fixare a complementului (RFC) 11.1.4.BLISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 11.1,5.Radio-imunofixarea clasicd (RIA - radio-immunoassay) 11.1.6.Western-blot (imuno-blot) 11.1.7.Metode colorimettice / fluorometrice 11.2, Evaluarea imunitayii umorale 11.3, Evaluarea imunitafii celulare 11.4, Evaluarea imunitépii imascute 11.4.1 Evaluarea celulelor NK 11.4.2.Evaluarea PMN 11.4.3.Evaluarea complementului 11.5. Investigatii utilizate in diagnosticul bolilor alergice 11.5.1 Diagnosticul in vivo 11.5.2.Diagnosticul in vitro in ultimii ani s-au inregistrat progrese importante in infelegerea imunodeficientelor, iar modalitatile de evaluare a imunitatii au devenit tot mai complexe si mai sensibile. Multe dintre noile metode ramén inca utilizate doar in cercetare, necesitdnd reactivi si aparate sofisticate. Anamneza si examenul obiectiv vor orienta medicul clinician in alegerea investigatiilor de laborator necesare pentru stabilirea diagnosticului, incepand cu teste de laborator de screening, continuand apoi cu teste mai sofisticate. a de precipitare permit determinarea concentratici de Ag sau de Ac si pot fi efectuate in faz4 solida — imunodifuzie radialé, imunelectroforezi — sau in faza lichidia — turbidimetrie, nefelometrie. Curba lui Heidelberg descrie urmatorul fenomen: in caz de exces al Ac se formeazi CI solubile, a cAror cantitate este proporfionala cu concentratia Ag; prin cresterea concentratiei de Ag se atinge regiunea de echivalent4, cu formarea CI insolubile, care pot fi vizualizate. 1.1. “Precipitaren’ Precipitarea este formarea de CI cu Ag moleculare. Prin mentinerea constant’ a concentrajiei de Ac, Ag este diluat prin difuziune pana la formarea unui precipitat In momentul atingerii regiunii de echivalenya. Turbidimetria este o tehnicd de precipitare in faza lichid’, Esantionul ce contine Ag este pus in contact cu Ac specifici in exces, formandu-se astfel Cl solubile care vor modifica absorbanta solufiei, ce poate fi m4surat4 prin fotometrie, Nefelometria masoara 91 ea formarea CI prin interactiunea Ag din egantion cu Ac specifici. CI formate vor dispersa razele laser, iar un fotodetector va masura lumina dispersata, determinandu- se astfel concentrajia Ag in funcjie de o curba de calibrare,Cap. 11 Evaluare: unologica si alergologies 127 Imunodifuziunga radialé simplé este 0 metoda de precipitare in faza solida. Se acoperd placa cu un gel care contine Ac specific pentru Ag cautat, in distributic omogena. Esantionul de analizat se depune in orificii decupate pe placi; Ag va difuza radial in gel, fiind diluat continuu, pana in momentul atingerii zonci de echivalenta, cénd Cl formate vor precipita. Concentratia Ag va fi proportionala cu patratul diametrului inelului de precipitare si va fi determinata in functie de curba de etalonare, Difuziunea radiala dubla (Ouchterlony) este 0 metoda in care Ag si Ac difuzeaza intr-un gel de agaroza. La nivelul zonei de reactie intre Ag si Ac se formeaza arcuri de precipitare, care pot fi colorate. Aceastii metoda este utilizata pentru determinarea Ag necunoscute, bazindu-se pe simetria profilelor de precipitare, in caz de similaritate a dou Ag, arcurile de precipitare fuzioneaza, in caz de similaritate partiala se formeaz un pinten, iar pentru Ag diferite arcurile de precipitare se vor Intersecta, Migrarea electroforetica in sens opus. La un pH dat, Ac si Ag au incarcare electric diferit si migreaza fn sens opus intr-un camp electric. Daca serul pacientului confine Ac contra Ag studiat, se vor forma areuri de precipitare la punctul de intalnire, care vor putea fi evidentiate prin colorare. Imunelectroforeza este 0 combinafie intre electroforeza si imunoprecipitare. in prima fazé, atét esantionul de studiat cét si un standard de referinta sunt separate prin electroforeza. in faza urmatoare se va realiza difuzia unui antiser perpendicular pe separarea electroforetica. in zona de echivalenta se vor forma Cl, care duc la aparitia liniilor de precipitare precise. Intensitatea, forma si locul de formare a liniilor de precipitare vor servi la identificarea proteinelor. Imunelectroforeza proteinelor este efectuata in caz de suspiciune de gamapatie monoclonal, cand Ig vor forma un varf ascutit in fractiunea y-globulinelor, sau policlonala — Ig vor fi distribuite uniform in fractiunea y-globulinelor. Electroforeza in gel ce contine Ac este o metoda prin care Ag va migra intr-un gel ce contine Ac si vom observa formarea de precipitate alungite, incurbate, ,in rachet&”. in paralel se va realiza precipitarea unui Ag de referinf’, puténd astfel s& determinam concentratia Ag din esantionul de analizat. 11.1.2. Atanas Aglutinarea este formarea de CI cu Ag particulate. Putem distinge aglutinarea direct& (bemaglutinarea pentru determinarea grupului sanguin) si aglutinarea indirect (latex-aglutinare, hemaglutinarea pasiva Boyden). Hemaglutinarea este metoda de determinare a Ac aglutinanti din serul pacientilor. Ac completi (naturali) sunt de tip IgM, care se leaga de determinantii Ag ai eritrocitelor, sub form de pentameri, determinand aglutinarea acestora. Acesti Ac sunt completi deoarece nu necesita factori suplimentari pentru a determina aglutinarea. Ac anti-Ag de grup sangvin ABO sunt Ac completi, de tip IgM. in serul uman existd gi alte tipuri de Ac (IgG), care sunt incompleti. Acesti Ac se leg’ de Ag eritrocitare, dar nu pot forma o punte intre doud eritrocite pentru a le aglutina. Daca distanta intre dou eritrocite este diminuati prin adiugarea de albumina sau a unei solufii cu concentratie ionicé mic&, Ac incompleji vor putea forma puntea intre doua eritrocite, determinand astfel hemaglutinarea, Ac produgi de pacienfii cu Rh negativ contra Ag D sunt un exemplu de Ac incompleti. Latex-aglutinarea este o metodi de identificarea a Ac din serul pacientilor. Ag este legat de latex, iar daca serul de testat confine Ac ce recunose Ag, va avea loc aglutinarea particulelor de latex. Identificarea FR din serul pacientilor se poate realiza prin aceast& metoda: Ig G sunt fixate pe latex, iar daca serul pacientului confine FR (IgM anti-IgG), particulele de latex vor fi aglutinate, reacfia fiind pozitiva, Aglutinarea bacteriilor poate fi utilizata pentru detectarea Ac sau pentru detectarea Ag:Cap. U1 Evaluarea imunologica si alergologics 128 “= Detectarea Ac (reactia Widal) Se realizeaza prin incubarea unor suspensii de bacterii (Ag) cu dilugii seriate din serul pacientului. in cazul aparifiei unei reactii de aglutinare, reactia este Pozitiva, serul pacientului confindnd Ac specific pentru Ag, ~ Detectarea Ag (reactia Gruber) se realizeaza prin incubarea culturilor de bacterii cu Ac Specifici de clas& sau de tip bacterian, fiind utila pentru stabilirea tulpinii bacteriene, 11.1.3, Este 0 metod’ de detectare a Ac din serul pacientilor prin fixarea si activarea complementului de catre Cl. Dupa inactivarea complementului din serul pacientului se adauga complement si un Ag cunoscut, Daca serul pacientului confine Ac pentru Ag adaugat, se vor forma CI, care vor consuma complementul. Ulterior adaugim eritrocite care au fixati Ac pe suprafata, iar absenfa hemolizei va indica absenta complementului care a fost consumat anterior, testul fiind Pozitiv, Daca apare hemolizi, inseamn ci mu a fost consumat complementul, testul fiind negativ. Prin aceasta metoda se pot obfine rezultate fals pozitive din cauza unor factori inhibitori din ser (FR, CD, dar in aceste cazuri reactia martor (flrd adaugare de Ag) este pozitiva, In plus, alfi reactivi pot contamina Ag si si formeze CI cu Ac din ser, fixand apoi complementul, dar in aceste cazuri Teactia este pozitiva si cu un Ag martor, 11.1.4. ELISA este o metoda cantitativé imuno-enzimaticd in care unul dintre reactivi este marcat enzimatic. Poate fi marcat Ag sau Ac. Identificarea Ac prin ELISA clasicd se realizeaza prin fixarea Ag la nivelul unui suport solid (plac de microtitrare), apoi addugarea produsului biologic in care dorim s& identificdm Prezenta Ac. In etapa urmatoare se va adauga un Ac secundar marcat cu o enzima (ex: fragmente Fab de Ac de oaie anti-Ig G umane), care se va fixa pe Ac din produsul biologic. Ulterior se va adauga un substrat incolor care va fi transformat intr-o substanta colorata de catre enzima. Se va determina concentrafia de Ac in functie de concentratia substratului colorat, cu ajutorul unei curbe de etalonare. Curba va fi obfinuté folosind un reactiv standard. Identificarea Ag prin ELISA sandwich se realizeaza prin fixarea pe plac& a Ac specific pentru Ag cdutat, apoi se adaugé produsul biologic in care dorim identificarea Ag, ulterior al II-lea Ac mareat eu 0 enzima, formandu-se astfel un ,sandwich”. in continuare principiul este acelasi ca si pentru ELISA clasica. 11.15. Aceasti metoda se bazeazi pe legarea competitiva. Ag este fixat pe o suprafatd solid’, apoi se adauga produsul biologie in care dorim sf cuttin prezenja Ac specifici si Ac specifici pentru Ag radiomarcafi. Ac din produsul biologic si cei radiomarcafi intra in competitie pentru Ag disponibil, apoi Ac in exces sunt inléturafi prin spalare. Cu efit concentratia Ac in produsul biologic este mai mare, cu atét mai pufini Ac radiomarcafi se vor fixa pe Ag, astfel incat concentratia Ac tn produsul biologic este invers proporfionala cu intensitatea semnalului radioactiv, 11.1.6, Western-blot este o electroforez in gel de poliacrilamida, in prezenfa SDS (SDS-PAGE), care permite separarea proteinelor in funcfie de masa moleculara, In prezenfa SDS, toate proteinele au 0 incdrcare electrica negativa, iar adiugarea 2-mercaptoetanolului reduce punfile disulfurice din interiorul proteinelor sau dintre proteine. Astfel incirearea electric a proteinelor si structura acestora nu vor influenja migrarea electroforetica, iar separarea proteinelor are loc exclusiv pe baza masei moleculare a acestora. Ulterior proteinele sunt transferate (blotting) pe o membrana, in general de nitroceluloza. Proteinele astfel imobilizate pot reacfiona cu Ac specifici prezenti in materialul biologic de analizat. oetinea” 129 Aceasta tehnie: avantajul de a permite identificarea Ag recunoscute de Ac, ceea ce este posibil datorit& separdrii electroforetice a proteinelor, 11.1.7, (Metode colorimettice / fuorometrice” Fluorescenta int luminiscenja unui material excitat printr-o iradiere, Materialul fluorescent absoarbe doar o parte din cnergia radia(ici, astfel incét partea restanta poate fi emisa cu © energic mai mic, adic& eu o lungime de und mai mare, Fluoresceina izo-tioeianat (FITC) este reactivul cel m i FITC este excitatt de lumina cu lungime de unda intre 450 $i 500 nm (albastra) si emite lumin& fluorescenta de o energie mai slaba cu lungimea de unda intre 520 gi 550 nm (galben-verde). Microscoapele cu fluorescenfa utilizeazi filtre selective care las s& treacd spre esantionul fluorescent doar lumina de o lungime de unda aleasi (de exemplu 470 nm). Invers, un filtru dicromie si un filtra de banda dirijeaz’ spre observator doar lumina de lungime de unda intre 520 si 550 nm. Imunofluorescenta direct foloseste Ac marcafi printr-un reactiv fluorescent, in timp ce imunofluorescenta indirect utilizeazi un Ac secundar marcat cu un fluorocrom pentru a revela fixarea Ac primar specific Ag-ului, 2 Imunofluorescenta directi permite detectarea simultané a mai multor Ag. in schimb, imunofluorescenta indirecta posed o sensibilitate crescuti in detectarea Ag slabi exprimati, Geoarece mai mulfi Ac secundari se pot lega de un Ac primar. Membrana celulara poate fi Permeabilizati prin fixare pentru a permite detectarea Ag citosolice. Imunofluorescenta este utilizata si pentru analiza celulelor in suspensie, in secfiunile tisulare sau in preparatele obfinute prin citocentrifugare. Citometria in flux utilizeaz& celule care sunt initial puse in suspensie monocelulara intr-o camera cu flux in vibratie, apoi sunt trecute sub forma de picdturi printr-o raza laser, iar dispersia luminii laser este masurati de c&tre fotomultiplicatoare. Dispersia anterioara a luminii este corelati cu talia celulelor, in timp ce dispersia lateral (masurata la un unghi de 90°) corespunde granulatiei si raportului citosol / nucleu al celulelor. Se pot astfel distinge celulele mari, cu un raport crescut citosol / nucleu si o citoplasma cu granulafii (granulocite), respectiv celule mici cu un nucleu mare (limfocite). Monocitele au un fenotip intermediar. Histograma de citometrie in flux masoari fluorescenfa fractiunilor celulare izolate prin citometrie in flux. Intensitatea fluorescenfei este destul de bine corelatd cu densitatea Ag de la suprafaja celulara sie masurata cu fotomultiplicatoare, In acelasi esantion poate fi evaluaté imunofluorescenfa mai multor tipuri celulare (ex: limfocite si monocite). Metoda permite utilizarea simultani a mai multor Ac dirijati contra unor Ag diferite si cuplati cu fluorocromi diferiti cum ar fi FITC gi ficoeritrina - PE, Acesti doi fluorocromi sunt excitali de catre o lumina cu lungimea de unda de 488 nm, dar emit lumini fluorescente de lungimi de unda diferite: lumina verde pentru FITC, lumini rosie pentru PE. O astfel de analiza permite distingerea populatilor celulare ce exprima dowd Ag (emit atat lumina verde cat si lumind rosie), un Ag (doar un singur tip de lumind) sau niciunul (fra fluorescenfa). Coloratiile imunohistologice permit identificarea Ag prezente la nivel tisular. Eyantioanele de fesut destinate analizei histologice sunt in general fixate in formol, dar prin aceasta metoda se altereazA majoritatea Ag, astfel incdt pentru analiza imunohistochimica se prefera sectiunile preparate 1a criostat din eyantioane congelate rapid pentru imunohistologie, Se pot utiliza colorafii prin metoda biotind-avidind/peroxidaz sau prin metoda APAAP. 1. Metoda biotind-avidind/peroxidaza Initial sectiunile sunt incubate la 4° C timp de 20-30 de min cu Ac, in general monoclonali, murini, specifici pentru Ag ales. Dupi etapele de lava), are loc incubarea cu Ac secundar biotinilagi ~ cuplaji cu biotina. Biotina are o afinitate crescuta pentru streptavidina, care este adaugata sub forma de complex cu peroxidaza, 0 enzima care va actiona asupra substratului cromogen, care va fiCap,11 Evaluarea imunologied si alergologica 130 adauyat la final, declansand o reactie coloranta, c: Substratul eromow are reflect’ precis distributia Ag in fesut. en poate fi diaminobezidina (DAB) sau amino-etilcarbazolul (AEC). 2.Metoda APAAP Dupa fixarea Ac primar, se adauga Ac secundar, un Ac anti-Ig murine, numit si Ac punte, apo! un complex format din fosfataza alcalina (AP) si un Ac monoclonal murin anti-fosfatazi alcalina (AAP), realizindu-se astfel legarca complexului la Ag tisul i ica SOREL oe mr i 8 tisular. Reactia enzimatica cu Ting noken va produce colorarea fesutuui in funcjie de distributia Ag. eine ra idarea fluorescenta in situ (FISH) permite detectarea Specificd a moleculelor de ADN ___ Tratarea cu anumifi reactivi chimici, temperatura crescut sau un PH alcalin pot determina disocierea lanfurilor de ADN. Se pot sintetiza sonde de ADN specifice, adicd fragmente de ADN Complementare unei seevenfe alese, care sunt cuplate cu un fluorocrom, Sondele marcate vor fi hibridizate cu ADN-ul din esantionul de analizat, fluorocromul permitand vizualizarea hibridizarii. In anumite cazuri de leucemie acutii limfoblastica se poate identifica o translocatie 8:21 (un fragment de cromozom 8 pe cromozomul 21 si invers). Aceasta poate fi identficat’ prin hibridizarea cu sonde de ADN marcate cu fluorocromi diferiti (ex: FITC pt cromozomul 21, PE pehtru cromozomul 8), iar in celulele patologice, care contin translocafia, cei doi fluorocromi sunt vecini. Se pot sintetiza gi sonde de ARN, fiind astfel posibila identificarea localizarii intracelulare a ARN-ului corespunzator anumitor produse celulare, cum ar fi citokinele. 11. Dezvoltarea unor P le viatd si esecul vindecdrii unor infectii chiar si cu terapie corecti antimicrobian vor ridica suspiciunea unui deficit imun umoral sau deficit al LB. Acest deficit poate fi usor si s& creeze rareori probleme sau poate fi sever, pana la imposibilitatea onganismului de a sintetiza Ac. Evaluarea imunitatii umorale va incepe de obicei Prin» eioleusogranss(complei en’ {in caz de deficit al imunitatii umorale numaral de limfocite poate fi usor Urmatorul pas in evaluare va fi ste efectuata de rutina, valorile normale fiind dependente de mai multi factori: varsta, sexul, etnia, metoda utilizaté. Dozarea IgD si a IgE necesit’ metode mai specializate. In unele situafii poate fi necesara m&surarea subclaselor de IgG. Existé mai multe metode standardizate de determinare a concentragiei Ig serice. Metoda clasicé “gala sy a fost standardul utilizat timp ihdelungat, dar actual majoritatea laboratoarelor utilizeaz nefelometria,.. ja reprezint& o modificare a reactiei de precipitare. Rezultatul se va exprima in unitéi is spans optic’, ce vor fi transformate in mg/dl utilizénd o curba standard. Reactia de precipitare are loc in prezenja Ac in exces, de aceca cresterea cantitifi de Ag va determina accentuarea dispersiei Juminii. Metodele nefelometrice automate utilizate actual dau rezultate inalt reproductibile pentru cuantificarea Ig in ser, dar gi in alte fluide. : ol in ser (antivA, anti-B) este posibila la pacienfii cu grup sangvin O, A sau B. Izohemaglutininele sunt Ac predominant de tip IgM. Dacd izoaglutininele sunt detectate in ser, pacientul este capabil si sintetizeze Ac fajd de Ag de grup sangvin. Absenfa izoaglutininelor la un pacient care nu are grupul sangvin AB sau concentrajia redusi a izoaglutininelor vor indica sintezi redusi de IgM si vor sugera necesitatea continuatii investigafiilor. = in cazul in care concentrafia Ig serice este anormal de mare la un pacient cu i i ae ii al in special la adulfi, se va indica efectuarea unei jentru a evaluaPrezenfa unei paraproteine, sugestiva pentru o boala maligna limfocitara. in plus, nivelul seric crescut al Ig poate fi sugestiv pentru o infectie HI In anumite circumstante poate fi necesara evaluarea numarului de LB circulante. Izolareaycelulelor mononucleate’se poate realiza prin centrifugarea cu Ficoll-Hypaque @ singelui anticoagulat, metoda care se bazeaza pe diferenta de densitate intre diversele componente ale sangelui. Substanta Ficoll are o densitate de 1,077 g/l, iar dup& centrifugare, celulele cu densitate redus& (limfocite, monocite) vor pluti la suprafa{a, iar celelalte componente vor forma un cheag la fundul tubului. Celulele mononucleate vor fi recuperate cu o pipet, iar prin incubarea acestora intr-un flacon de cultura celulara, monocitele vor adera la peretele de plastic, in timp ce limfocitele vor rimane mobile, putand fi astfel izolate. ‘Separarea LT si LB - formarea de rozete LT exprimi la suprafata molecule de adeziune cum ar fi CD2, care interactioneazé cu CD58 (LFA-3) de la suprafafa eritrocitelor de oaie. Tratarea enzimaticd a eritrocitelor de oaie va expune moleculele de adeziune la suprafata acestora, ficdndu-le accesibile pentru a interactiona cu CD2 de la suprafata LT. Se vor forma astfel rozete, compuse dintr-un LT si mai multe eritrocite de oaie. Celulele ce formeaza rozetele pot fi separate prin centrifugare cu Ficoll, urmata de liza hipotona a eritrocitelor, obtinand astfel LT de o puritate de circa 95%. Celulele care nu formeaza rozete (in majoritate LB si monocite) vor pluti deasupra Ficoll- ului si vor putea fi recuperate si separate. ‘Separarea populatiilor celulare cu ajutorul/Ac Flacoanele de cultura celular& pot fi acoperite cu Ac in prezenta unui pH alcalin. Punerea in contact a acestor suprafete cu un amestec de celule va determina fixarea celulelor care exprima un anumit Ag la suprafata tubului, iar celulele care nu se fixeaz vor fi eliminate prin decantare si spilare, Celulele fixate vor fi recuperate prin manipuliri mecanice si digestie enzimatica. Cuplarea Ac cu bile feromagnetice permite, de asemenea, izolarea unor celule care exprima un Ag. Cu ajutorul unui magnet, celulele vor fi izolate din amestec. Aceasta este 0 metoda foarte utilé de izolare a unor celule aflate in concentratii foarte mici in amestec (ex: izolarea unei celule tumorale din mii de celule normale), fiind foarte potrivité pentru eliminarea celulelor nedorite — selectie negativa. LB exprimd la suprafata celulara Ag specifice. Ac monoclonali fafi de markeri de suprafata ai celulelor sangvine au fost objinufi, ceea ce permite identificarea tipurilor i subtipurilor celulare. Imunofenotiparea prin citometria in flux se bazeaza pe utilizarea Ac monoclonali care sunt marcati cu fluorocromi_diferiti. Aparatele noi pot misura fluorescenta de la patra sau mai multi fluorocromi simultan,[ceea ce va permite identificarea specific’ a unor seturi celulare din amestecuri complexe cum este sangele umani Ac monoclonali care se leaga specific de structuri de suprafaya sau de Ag intracelulari pot fi utilizafi pentru a defini stadiul de maturare, activare gi capacitatea functional a tipurilor celulare specifice. Pentru izolarea LB sunt utilizaji Ac anti-CD19, Spre deosebire de citometrul clasic, un citometru care permite separarea subpopulatiilor celulare confine un aparat de triaj celular activat de fluorescenti (FACS — fluorescence activated cell sorter), care poate incérca electric o picitura in functie de fluorescenta sa: picdtura cu o celuli fluorescent va fi incdrcaté pozitiy, iar cea firé fluorescenfa va fi incdrcata pozitiv, Fluxul celular trece apoi printre douA placi electrice de deviere, celulele pozitive si negative fiind deviate in sensuri opuse, putdnd astfel fi colectate separat, Aceasté metoda permite objinerea unor populatii celulare cu puritate de 99%, In functie de varsté gi istoricul de vaccinari al unui pacient suspicionat a avea un deficit al imunitafii umorale, se poate misura riispunsul umoral la vaccinuri, Majoritatea nou-nascutilor au fost deja vaccinafi cu un set de vaccinuri pana la varsta de un an, cele mai frecvente find toxoidele tetanos gi difteric, vaccinurile antivirale comune si vaccinul polizaharidic anti-Haemophillus influenzae tip b. Prezenja Ac determinafi de vaccinare este un indicator al unui rispuns umoral ee —————_——_Cap, 11 Evaluarea imunologica si alergologick 132_ intdtt, iar absenta sau nivelele reduse ale Ac ca ras indicatori ai unui deficit al LB. ___, Daca se documenteaza infectii recurente sau multiple cu acelasi microorganism, ar putea fi posibili izolarea microorganismului si determinarea unei eventuale lipse de raspuns a pacientului la un anumit microorganism. De exemplu, in deficite ale subclaselor de IgG, nivelul total al IgG poate fi normal, iar pacientii nu raspund la anumite microorganisme cu capsule polizaharidice. Dozarea subclaselor de IgG este recomandati gi va evidentia eventuale deficite. In anumite cazuri de suspiciune de deficit umoral este utili examinarea tesuturilor limfoide periferice, Examinarea histologic’ a ganglionului de drenaj post-vaccinare poate evidentia ipsa centrilor germinativi si a foliculilor secundari din centrii germinativi. in majoritatea cazurilor de deficit al LB toate fesuturile limfoide, exceptind timusul, sunt hipoplazice, nu au un centru germinativ bine definit si au un deficit de plasmocite. : Studiile functionale ale LB pot fi utile in definirea naturii deficitului umoral, in special in investigarea defectelor in sinteza si seorefia Ig si a defectelor specifice in subpopulatiile de LT reglatoare, dar nu sunt investigatii de rutina, ‘Activarea LB puns la unul sau mai multe vaceinuri pot fi __ Analiza cantitativa a Ig este un bun parametru de evaluare a functiei LB in vivo. in momentul depistarii unui deficit de Ac, alte teste functionale ar trebui efectuate. Ac dirijati contra Ig de suprafati pot stabili legaturi incrucisate intre aceste Ig (cross- linking), simuland stimularea fiziologica a LB de caitre Ag. Pentru acest test folosim fragmente Fab de Ac anti-IgM, pentru a evita efectul inhibitor al legarii Ac de Fe-R. Un cross-linking eficient este tealizat de catre bacteriile Staphylococcus aureus de grup Cowan C (SAC) liofilizate. Legarea Ag provoaca activarea LB - in cAteva secunde va creste concentratia citoplasmatica a Ca, dupa cateva ore se exprima CD69 si CD71, iar dupa 2-3 zile creste expresia CD25 si CD23. Cresterea concentratiei citosolice a Ca poate fi detectata cu ajutorul reactivilor colorati cum ar fi INDO-1 (legarea acestora de Ca determina modificarea fluorescentei emise, care poate fi cuantificata precis prin citometrie in flux). Citometria in flux va analiza si expresia moleculelor de activare la suprafata celulara. Analiza ciclului celular este o metoda costisitoare de evaluare a activititii celulare, permifand calcularea'm lui de celule in repaus, activate sau in diviziune. Dupa activare prin legarea incrucigat’ a Ig de suprafata, LB necesita un al doilea stimul pentru a prolifera, cum ar fi citokine: IL-2, IL-6, IL-14 sau receptori solubili: fragmente solubile de CD23 sau legarea CD40 de citre CD40L. Pentru a cuantifica proliferarea LB, se va misura incorporarea timidinei marcate cu tritiu (H-T) la 72 de ore, Cultura de LB va fi pistrat’ intr-un incubator timp de 72-96 de ore la 37°C int © atmosfera de 5% CO». Diviziunea celulari incepe la 48 de ore si se va asocia cu dublarea confinutului de ADN. Adaugarea *H-T in culturd va determina tncorporarea acesteia in ADN-ul now sintetizat, iar dup’ 24 de ore celulele vor fi recoltate cu un aparat automat, suspensia celular’ fiind transferat4 pe un filtru de fibra de sticla, Acest filtru refine celulele si astfel si ADN-ul marcat, iar radioactivitatea filtrului este cuantificaté, fiind proportional cu replicarea ADN-ului si cu proliferarea celulara. Dup’ o incubare in vitro de 5-1 zile, LB se pot diferentia in plasmocite si vor produce Ac care pot fi cuantificafi din supernatant prin ELISA sau RIA, Aceste tehnici nu vor putea cuantifica numérul de plasmocite producitoare de Ac, Numiarul acestora poate fi determinat prin teste de formare a plajelor de lizé celulard (PFC - plaque forming cell). PFC — testul_hemolizei inverse utilizeazi eritrocite de oaie care sunt incireate de Ig antiumane, de origine de la capri sau de la iepure. Aceste eritrocite sunt incubate cu LB pe un strat de agaroz4. Plasmocitele sintetizeaza Ig, care intra in agaroza prin difuziune i formeaza complexe imune cu Ig anti-umane de la suprafafa eritrocitelor de oaie. Dupa adiugare de complement, iatCap. 11 Evaluarea imunologici gi alergologica 133 critrocitele aflate in jurul unui LB produc&tor de Ac vor fi reprezinté numarul LB producatoare de Ac. Prin acest test se pot analiza Subpopulatii de LB: eritrocitele incarcate de Ig anti-IgM umane vor detecta doar LB producitoare de IgM, in timp ce LB producdtoare de Ac specifici pentru un anumit Ag vor fi identificate prin incarcarea eritrocitelor cu un A, g cunoscut. Testul ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot assay) utilizeaz4 LB etalate in placi de cultura celulari acoperite cu Ag. Dupa fixarea Ac produsi pe Ag din cultura, se elimina Supernatantul care confine Ac nefixati si celulele, apoi se adauga Ac anti-Ig cuplati cu o enzima, apoi un gel cu cromogenul corespunzitor. Reactia enzimaticd apare acolo unde Ac specifici produsi de LB au fost fixati, rezultand pete colorate, al ciror numar este egal cu cel al LB producatoare de Ac specific. lizate, iar numarul plajelor de liza 11.3. : celulare sunt asociate cu infectii grave sau frecvente la nivelul tractului respirator, al pielii, intestinului, multe dintre ele fiind dificil de tratat cu terapii standard. Infecfiile cele mai frecvente sunt produse de organisme intracelulare, in special virusuri, fungi, care la organismele imunocompetente nu sunt patogene, Deficitele imunitifii celulare devin manifeste inca din primele luni de viaté si pot asocia deficit de crestere[ Transferul transplacentar al Ac materi nu intarzie aparitia manifestirilor acestor defi © prima evaluare se realizeazi prin ama compl care poate evidentia o limfopenie in cazurile de deficit imun sever. Totusi, poate fi normal in anumite tipuri de deficite ale imunitatii celulare, astfel incat va fi necesara o analizi a subtipurilor celulare si a caracteristicilor fenotipice si functionale ale acestora. Separarea populatiilor celulare se realizeazi prin metodele deja descrise la evaluarea imunitatii umorale. In imunofenotiparea prin citometrie in flux, setul de baza utilizat pentru evaluarea raportului intre diverse subpopulatii celulare este format din Ac anti-CD3, Ac anti-CD4, Ac anti-CD8 pentru identificarea LT helper si citotoxice. Aceasti metoda poate fi utilizati si pentru identificarea prezenjei sau absenfei anumitor Ag de suprafata sau intracelulari importanti pentru functionarea sistemului imun celular, cum ar fi CD154 sau CD40L la suprafata LT, care este deficient in sindromul hiper-IgM. Citometria in flux va fi utilizati si pentru monitorizarea rispunsului la tratament la pacientii cu deficit imun. Numararea celulelor imune este foarte importanta in evaluarea integritatii sistemului imun, dar uneori nu este suficient4, fiind necesare studii functionale. Exista actual atat metode in vivo cat si metode in vitro de evaluare a functiei LT. - Weste de activarea LT! LT sunt activate gi stimulate sa prolifereze la contactul cu Ag specific, dar doar 0 foarte mica fractiune din LT circulante vor recunoaste un anumit Ag, motiv pentru care vom utiliza activatori policlonali ai LT pentru evaluarea in vitro a functiei LT. Acesti activatori policlonali pot fi concanavalina A sau lectine fitohemaglutinine, care stimuleaza toate LT, indiferent de TCR. Ac specifici pentru complexul CD3 asociat TCR pot induce formarea de complexe de molecule CD3 gi 84 simuleze astfel recunoasterea fiziologic’ a Ag, stimulind in acest fel majoritatea LT. Activarea LT este ulterior evaluata prin masurarea citokinelor, cum ar fi GM-CSF, TL-2, IL-4 sau JFN-y din supranatantul culturilor. Prin analogie cu LB se poate determina cresterea concentrafiei de Ca citosolic, precum gi cresterea exprimarii CD69, CD71, CD25 sau, specific pentru LT, cresterea exprimarii MHC (HLA- DR3) la 1-3 zile de |i ‘ivare. "Besta de proliferare aL Capacitatea de proliferare celulara este deseori utilizatd ca un parametru functional al LT — test de stimulare limfocitara, test de transformare.: 134 _Cap..11 Evaluarea imunologica si alergologiea Similar testului de proliferare a LB se evalueaza proliferarea LT prin masurarea incorporarii °H-T in ADN. Funetia LT in vivo _ Functia LT poate fi apreciata in vivo prin injectarca intradermica a unor Ag Ia care individul a fost anterior expus, misurandu-se reacfia cutanaté la 48 - 72 de ore. Cele mai frecvente antigene sunt bacilul Calmette-Guerin si Candida Multitest® Merieux este un test prefabricat, care are 8 capete ascutite care contin Ag de bacterii sau de ciuperci dizolvate in gelatind. Aplicarea acestor capete pe piele va determind introducerea intradermica a Ag la care marea majoritate a indivizilor au fost deja expusi. La 48 de ore se misoara reactia cutanat, care corespunde unei reacfii de hipersensibilitate tardiva. Un diametru al induratiei de 2 mm este considerat 0 reactie pozitiva. ELISPOT IFN-y este 0 metoda imunoenzimatica utilizaté pentru a determina numérul de LT specifice pentru un Ag. Ag este pus in contact cu APC si LT in adanciturile din placa de microtitrare, care sunt acoperite cu Ac anti-citokind (de exemplu anti-IFN-y), apoi sunt incubate timp de 24-48 de ore. LT stimulate de Ag vor produce IFN-y, care va fi fixat imediat de citre Ac de la suprafata placi sfarsitul incub&rii, celulele vor fi inliturare prin spalare, iar placa va fi incubaté cu un Ac anti-Ifn-y marcat cu biotin, iar in timpul al [ll-lea se va adauga streptavidina marcata cu o enzimé, care va transforma substratul intr-un compus colorat. Compusul colorat va fi prezent sub forma de puncte (spoturi) in locul unde a existat anterior un LT activat secretor de IFN-y. Numarul de puncte din 100000 de celule va reflecta frecventa LT specifice Ag. ina. Dupa stimulare cu Ag, celulele vor fi incubate cu brefeldina A, care impiedica exteriorizarea citokinelor secretate, astfel incat o cantitate importanta de citokina va fi depozitaté intracelular. Markerii de suprafata ai celulelor vor fi colorati cu fluorocromi care vor emite in spectrul rogu, dar cu lungimi de unda diferite (ex: proteina clorofiliana peridina pentru CD4 si aloficocianina pentru CD8), dupa care se vor permeabiliza celule cu saponind, ceea ce va permite Ac anti-citokina s4 pltrunda in celuld gi sé se fixeze pe aceasta, Utilizind 0 combinatie de Ac marcafi (ex: Ac anti-Ifn-y marcat cu FITC i Ac anti-IL-4 marcat cu PE) putem distinge celulele in funcfie de tipul de citokind sintetizaté. Aparatul va detecta simultan mai multe culori, permifand caracterizarea secretiei de citokine in funcfie de subtipul celular. JAc se fixeaz’ pe de o parte de CD45, un Ag de suprafafa omniprezent, iar pe de alta de citokina secretata care ne intereseaz, Un Ac secundar anti-citokina, marcat cu un fluorocrom, se va fixa pe aceasta, Celulele pot fi triate cu ajutorul unui citometru cu flux, sau cu ajutorul unui camp magnetic, dacé Ac sunt cuplati cu Fe, Colorarea cu ajutorul tetramerilor Tetramerii sunt utilizaji pentru a colora direct celulele specifice unui Ag, Initial se produc tetrameri de HLA clas I (ex: HLA-A2) care sunt asamblati in jurul unui fluorocrom. Locul de prezentare a Ag de la toate moleculele de HLA vor avea fixat acelasi peptid sintetic. Reactivii rezultafi vor colora doar LT-CD8+, care vor recunoaste doar Ag prezentat de HLA-A2. Celulele astfe] marcate pot fi separate cu un citometru de flux pentru a produce linii celulare specifice unui Ag.Cap. 11 Evaluarea imunologic’ si alergologica 11.4.1, Evaluarea celulelor NK ; Celulele NK sunt importante in sistem infectate sau celulele tumorale. Deficitel sunt entititi clinice rare. Evaluarea numirului de celulele NK se realizeazi prin citometrie in flux: in mod normal deviazi lumina anterior, ca si limfocitele, iar Ag de suprafata CDS6 si CD16 sunt caracteristice celulelor NK. Utilizarea mai multor parametri permite separarea celulelor NK si evaluarea numanului acestora, Evaluarea_functiei_celulelor NK se realizeazd prin abilitatea celulelor mononucleare Periferice de a induce liza celulelor tumorale sensibile la actiunea celulelor NK intr-un test cu eliberare de crom. _._ Linia celular’ KS62 este o linie eritroleucemica, sensibila la actiunea celulelor NK. Se vor utiliza celule K562 marcate cu *'Cr radioactiv, care vor fi incubate cu celule mononucleare periferice izolate din singele pacientului. Celulele NK functionale vor liza celulele marcate cu °'Cr, cliberarand *!Cr in supematant. Cantitatea de *'Cr eliberata este proportionala cu activitatea litica celulelor NK. Acest test nu este accesibil majoritafii laboratoarelor deoarece este necesari intretinerea culturilor celulare i pistrarea radioizotopilor. in plus, testele de citotoxicitate sunt dificil de standardizat. ul imun innascut, fiind capabile sa lizeze celulele le celulelor NK crese susceptibilitatea la infectiile virale, dar 11.4.2. Evaluarea PMN PMN sunt componente esentiale ale sangelui si au un rol central in inflamatia acuta. Capacitatea PMN de a raspunde la o infectie si de ao elimina este rezultatul mai multor fenomene: chimiotaxia la locul infectiei, aderenja la locul infectiei, recunoasterea si fagocitarea agentului infectios, cresterea metabolismului si omorarea agentului infectios fagocitat. Evaluarea numarului de PMN Numérul redus de PMN (neutropenie) sau deficitul functional al PMN duce la morbiditate si mortalitate crescute. Neutropenia este usor de depistat printr-o hemoleucogrami complet’ cu formuld leucocitara. Reducerea PMN sub 1500/1! determin’ o crestere a susceptibilitatii la infectie. Evaluarea functionalé a PMN in evaluarea functionala a PMN ar trebui studiate toate etapele rispunsului inflamator. Testele care se pot utiliza in acest scop sunt in majoritatea lor scumpe si complexe si nu sunt utilizate in mod curent. Testele pot identifica deficite ale moleculelor de adeziune celulara si defecte ale metabolismnului respirator celular, care apar mai frecvent decat defectele chimiotaxiei si ale fagocitozei. ee Dake: Ailend pdlecals gel aseeamende A suprafafa PMN, deficitul de B2-integrine (CD18/CD1 la-c) este cel mai important, determindnd deficite ale adeziunii leucocitare. Importanfa metabolismului respirator este evidenfiaté de morbiditatea si mortalitatea importante au fost identificate ca find responsabile de boala i olismului respirator al PMN, 135Cap. 1 ca imunologica si alergologies 136 2 a a NBT implica preluarea NBT de catre celule, furnizarea unui stimul de activare (articule de latex) si monitorizarea (fotometrict sau microscopic) in vederea obiestivarii reducerii colorantului, care devine astfel albastru Citometri azeazh ns ometria de flux se bazeazi pe reducerea unui alt colorant — dihidrorodamina — DHR. ‘st colorant este preluat de citre PMN $i este nefluorescent in celulele in repaus, iar cind este indus metabolismul respirator color and fi n is a rantul este redus si devine fluorescent, putind fi detectat de citometru, " a : Ambele metode pot detecta atit Pacien{ii simptomatici cu boat granulomatoas& cronica, cat si purtatorii asimptomatici, Chemiluminiscen{a este generarea de lumina prin interactiunea dintre speciile reactive ale oxigenului si organismal ingerat, Prin adiugarea de agenfi de intensificare, lumina generata poate fi detectat’ de un contor de scintilafie. Lumina eliberati este proportionala cu activitatea metabolismului respirator al PMN, fiind redusti la pacientii cu boat granulomatoas4 cronicé si la Purtitorii asimptomatici, Accasta metoda are 0 sensibilitate mai mare decat testul NBT. Majoritat componentelor sis ate de gene autozomale, astfel incat uw defect heterozigot nu are relevanta clinica. Indivizii homozigoti pentru un anumit defect au un rise mai crescut de infectii, deficitul putand fi depistat printr-o testare a funcfiei complementului Testele masoard activitatea comple in dilufii ale plasmei pacientului asupra eritrocitelor de oaie care au fost acoperite cu Ac anti-eritrocite de oaie; complexele imune vor activa sistemul complemerit. Dac& toate componentele complementului sunt prezente in plasma Pacientului si sunt funcfionale, eritrocitele vor fi lizate, iar hemoliza poate fi cuantificatd. La pacienfii cu un defect total al unui component hemoliza este absent, in timp ce la cei cu un defect parfial hemoliza este redusa. Pentru a confirma defectul unei componente a complementului trebuie utilizati o metoda imunochimica de dozare a componentelor individuale. in cazul suspicionarii unui deficit functional al componentelor complementului se pot doza componentele de clivare ale complementului, cum ar fi C4a, C4d, Bb. Prezenta componentelor de clivare sugereaz4 prezen{a complementului functional, Existé laboratoare de referin{é care oferd teste functionale pentru componente specifice ale complementului, : ; Deficitele componentelor complementului sunt rare, iar istoricul si tablou! clinic sunt foarte importante in stabilirea diagnosticului corect, 11.5. Investigafii utilizate in diagnosticul bolilor alergice 11.5.1, Diagnosticul in vivo fnainte de a efectua orice investigajie trebuie si avem, dupa o prealabili informare a acestuia, acordul pacientului si cooperarea acestuia.Cap. 11 Evaluarea imunologica si alergologica 137_ Testele cutanafe nu trebuie efectuate daca exist leziuni la nivelul piclii. Existé mai multe contraindicafii pentru efectuarea testelor cutanate, majoritatea find relative: ~ sarcina ~ nou-nascuti ~ boli sistemice severe concomitente - administrarea unui imunosupresor ~ administrarea unui medicament care poate modifica reactivitatea cutanata: antihistaminice sistemice, inhibitori ai enzimei de conversie, unele psihotrope - riscul de a dezvolta o reactie de hipersensibilitate sever’, potential dificil de tratat ~ boli alergice care pot falsifica rezultatele testelor ~ boli infectioase la nivelul pielii ~ pentru testele intradermice: administrarea de inhibitori ai reactiilor adrenergice. Substanfele utilizate pentru teste trebuie si contin o cantitate standardizata de alergen. Cantitatea de alergen din extractele utilizate se masoara prin ELISA, iar electroforeza proteinelor permite determinarea continutului de diverse proteine alergenice. Metodele de testare trebuie si fie standardizate. Pentru testele cutanate prick trebuie si efectuam testele preferabil pe fata interna a antebratului, distanta intre doud teste sa fie de minim 2 cm, citirea se va efectua la circa 20 de minute gi se va utiliza o schema de evaluare. Este necesara att evaluarea papulei, cat si a eritemului, Atat testele cutanate cat si testele de provocare vor fi efectuate doar de persoane cu experient, care si aibi la indeména trusa de urgent. Trusa de urgent trebuie s confina stetoscop, tensiometru, garou, seringi, materiale pentru perfuzie, adrenalin, antihistaminice, corticoizi, B- mimetice, teofilina. In cazul in care se efectueaza teste cu risc crescut de inducere a reactiilor anafilactice, vor fi necesare o cale de acces venos, supravegherea pacientului chiar si dupa terminarea testului si efectuarea testelor in spital. Trebuie evitata efectuarea testelor alergologice ca si screening. Ele vor fi efectuate doar ca o completare a evaluirii clinice, care va orienta alegerea tipului de test utilizat si alergenii alesi. in functie de tipul de hipersensibilitate suspicionat putem alege teste in vivo sau in vitro variate: hipersensibilitate de tip I — teste cutanate prick, dozaj IgE specifice, hipersensibilitate de tip II — test Coombs, agregare leucocitarai, hipersensibilitate de tip III - dozaj Ig, Cl, imunohistologie, * hipersensibilitate de tip IV — teste de transformare limfocitara, imunohistologie. Factorii care influenfeaz4 rezultatele testelor: - medicamente: antihistaminice, corticoizi, anumite psihotrope; intervalul fara tratament este variabil in funcfie de timpul de injumatafire al medicamentului, - modificari ale organului-tint4: rdspuns diminuat in caz de rinit& atroficd, papule exagerate in caz de dermografism - cofactori: stres, efort fizic, boli infectioase, radiatiile UV, variatiile hormonale, mastocitoza, intervalul de la ultima reactie alergicd, starea psihica, Testele cutanate prick sunt testele cele mai frecvent utilizate in explorarea reactiilor de tip imediat la pneumalergeni, trofalergeni i latex, Sunt utilizabile fntr-un prim pas in explorarea reactiilor de tip imediat la medicamente. inainte de efectuarea testelor, se vor cauta prin interogatoriu factori ce pot modifica reactivitatea cutanatd gi se va dezinfecta gi degresa pielea. Se aplicd picaturi de extract alergenic la suprafafa pielii, la distanji de minim 2 cm intre ele, iar apoi se infeapa pielea perpendicular prin aceste picéturi cu o lanfeti, addncimea infepaturii find de circa 1 mm. Trebuie si avem griji si nu inducem sAngerare la infeparea pielii gi se va utiliza céte o lanjet noua pentru fiecare picdtura de alergen. Se vor utiliza imtotdeauna solufii de control; NaCl 0,9% ca si control negativ si histamina ca gi control pozitiv. Reacfiile cutanate yor fi citite la circa 20 de minute gi se vor evalua atat papula ct si eritemul, fiind considerate pozitive testele ce determina aparifia unei papule cu cel putin 3 mm.Cap, 11 Evaluarea imunologicd si alergologica 7 138 mai“mari decat papula martorului negativ si cel putin jumatate din papula produs de martorul posit Pentru misurare se vor utiliza diametrul cel mai mare gi cel perpendicular pe acesta, aritmetici a acestora va fi considerati ca diametru al reactiei cutanate. Exista mai multe posibilitati de evaluare, dar ar trebui preferate metodele cantitative, obiective. Evaluare testelor cutanate prick: 0 (fara papula, eritem <3 mm) + (papuld 3 mm, eritem 3-5 mm) ++ (papula 4-5 mm, eritem 6-10 mm) ++ (papula 6-7 mm, eritem 11-20 mm) +++ (papula > 7 mm sau cu pseudopode, eritem >20 mm). Reactia imediat& este cunoscuti sub numele de friada Lewis si cuprinde: edemul sub forma de papul8, eritenmul care va depisi in diametru papula gi pruritul asociat celor doua. Reactiile fals negative pot apZrea in caz de anergie cutanata, tehnicd necorespunzatoare, extracte alergenice inadecvate sau perimate, iar reacfiile fals pozitive pot aparea in caz de dermografism sau de inducere a sfingeririi in timpul testarii cutanate. Actual exist extracte alergenice standardizate pentru foarte multi alergeni inhalatori implicati in rinite, conjunctivite sau astm. De obicei se utilizeazi o serie standard de pneumalergeni care confine acarieni, par de animale (caine, pisicd), mucegaiuri si polenuri de arbori, graminee, ierburi, Exista si extracte alergenice standardizate pentru alergeni alimentari, dar calitatea acestora este mai putin buna. Daca nu se pot efectua testele la nivelul antebratului, o alta varianta este efectuarea lor pe partea superioara a spatelui, zona care va putea fi utilizata si pentru a testa substante native — alimente. Testele cutanate intradermice pot fi utilizate in reactiile de tip imediat, pentru a creste sensibilitatea testelor sau pentru a determina pragul de reactivitate cum este cazul alergiilor la veninul de himenoptere. Aceste teste vor fi utilizate si pentru evaluarea reactiilor tardive cu mediere celulara. Se vor injecta intradermic 0,02-0,05 ml de solutie care, dacd injectarea este corect’, vor produce o papuld de,2-3 mm, Vor fi utilizate solutii de control negativ si pozitiv, iar testul va fi considerat pozitiv dacd se inregistreazi o dublare a diametrului papulei initiale, cu un halow eritematos. Reactiile vor fi citite la 15-20 de minute pentru reactiile imediate, la 6 ore si la 24 de ore, uneori si la 72 si 96 de ore pentru reactiile tardive. in interpretarea IDR trebuie s tinem cont de factorii care influenteaz reactivitatea cutanati precum si de reactiile fals pozitive (injectarea unei cantitéji prea mari de lichid, injectarea intravasculara, utilizarea unor concentrafii prea mari, dermografism) sau fals negative (anergie cutanata, injectare subcutanata, extracte inadecvate). Evaluarea testelor intradermice 0 (cresterea papulei cu <3 mm, a eritemului cu <5 mm) + (cresterea papulei cu 3-5 mm, a eritemului cu 5-10 mm) ++ (cresterea papulei cu 6-10 mm, a eritemului cu 11-20 mm) +++ (cresterea papulei cu 11-15 mm, a eritemului cu 21-40 mm) ++++ (cresterea papulei cu >15 mm, a eritemului cu >40 mm). Testele cutanate intradermice vor putea fi efectuate doar cu substange sterile, disponibile pentru administrarea parenteralé, Riscul de aparitie a reacfiilor anafilactice este mai important in cazul efectuairii testelor intradermice decét in cazul testelor prick, motiv pentru care se preferd intreruperea tratamentului B-blocant anterior testdrii (dacd este posibil) gi va fi obligatorie prezenfa unui medic capabil si trateze o reacfie anafilactica. Se va incepe cu concentrafii ale alergenilor cu att mai reduse, cu cat reactia pacientului a fost mai severa. . Testele scratch pot fi utilizate in evaluarea reactiilor de tip imediat sau tardiv. Se va practica © incizie superficial cu lungimea de 1 om, fird a produce sfngerare, la nivelul fefei interioare a antebrafului, dupa care se va aplica substanja de testat. Reacfia va fi cititd la 20 de minute pentru oCap. 11 Evaluarea imunologii i alergologica 139 Teactie imediata si apoj la 6 ore si 24 de ore pentru reacfiile tardive. Se vor utiliza martorii negativ gi Pozitiv, iar testul va fi considerat pozitiv daca apar papule cu halow eritematos sau pseudopode . Datorité unei Teproductibilitati limitate, utilizarea testelor cutanate scratch ar trebui restransa, chiar eliminata. Testele cutanate patch (epicutanate) sunt teste standardizate, indicate in evaluarea reactiilor tardive de tip dermatitic, eczematiform. Se aplica initial substana de testat in camere previzute cu un pansament special (camere Finn), care vor fi apoi aplicate pe spatele pacientului si menfinute timp de 48 de ore. Lectura se va efectua imediat dupa inlaturarea testelor gi uncori in ziua 3, ziua 4 gi ziua 7 de la aplicarea testelor Eyaluarea testelor epicutanate: negativ (4) : doar eritem +: eritem si infiltrat ++: eritem si papule +++ : eritem, papule, vezicule 444+ : eritem, vezicule, eroziuni iritatie : eritem bine delimitat, descrescator. Substantele utilizate pentru testarea epicutanati pot fi gisite in comert sub forma de seri standard, fie in vaselina, fie in solufii apoase. Seria standard europeand contine metale (nichel, cobalt, crom), aditivi de fabricatie (tiuram, compusi de mercaptona), colorantul parafenilendiamind, parfumuri si arome, excipienti pentru creme, vopsele (Ianolina, parabeni, neomicina, benzocaina). Alegerea substantelor care vor fi testate depinde de prezentarea clinicé a dermatitei: afectare periorbital — compusi ai cosmeticelor, tratamente oculare, lac de unghii; dermatita mainilor — substante de ingrijire a pielii, substanfe continute in minusi, substante profesionale, bijuterii. Pot apirea reactii fals negative in cazul utilizdrii unor concentrafii prea reduse, alegerea gresitf a substantelor de testat, lectura prea precoce sau neinterpretarea testelor la 72 si/sau 96 de ore, erori de tehnica, fotosensibilizare. Dermografismul si testul la presiune Dermografismul poate fi declansat pe partea superioara a spatelui prin frecare sau scriere cu un obiect bont. Reactia normala consta in aparitia unui eritem in cteva minute — dermografism rosu. Dermografismul urticarian const in aparitia unui eritem infiltrat care poate fi sau nu pruriginos. Acesta este constitutional sau poate fi asociat stresului sau secundar unor boli, in special infectioase. Dermografismul alb pare a fi legat de 0 vasoconstrictie local exagerats, fiind 0 reactie relatiy specifica pentru pacienfii atopici, in special pentru cei cu dermatit atopica. Testul la presiune este utilizat pentru a stabili diagnosticul de urticarie la presiune. Se suspend’ o centura de 10 em lafime, cu doua greutafi care insumeazi 10 kg la nivelul umarului timp de 10-20 de minute, O alti metoda consté in aplicarea unui cilindru metalic de circa 5 cm diametru pe fata anterioara a coapsei timp de 10-20 de minute, Se va urmari aparitia urticariei la 20 de minute, dar gi la 2-4 ore de la debutul testului, Testul la cald si la rece Testul la cald se realizeaz’ prin imersia antebrajului in ap’ cald’ de 38-42°C timp de 3-5 minute, maxim 10 minute sau prin aplicarea unui cilindru metalic incalzit cu ajutorul apei la 38- 42°C. Testul va fi considerat pozitiv dac& apar papule urticariene local; se va interpreta testul si la 2 ore in cazul unui istoric de reacjii tardive, Testul la rece se realizeaz’ prin introducerea antebrajului in apa rece de 15°C timp de 10 minute sau prin aplicarea unui cub de gheajé sau a unui cilindru metalic pe pielea antebratului. Testul este considerat pozitiv in caz de aparifie a unei papule sau a unui angioedem in momentul reincalzirii extremitazii. ee Testul la transpirafie este indicat in cazul unei suspiciuni de urticarie colinergica, ce se manifest’ prin papule mici pruriginoase apirute in caz de transpiratie la efort, la temperaturi inalte_Cap,, 11 Evaluare: unologic’ si alergologica 140 saua stres. Testul poate fi efectuat printr-o baie in a a Pe a 7 i calda (40-41°C timp di area searilor sau munca in haine calde ° ‘ nia Teste de provocare Testele de provocare sunt utilizate pentru explorarea bolilor alergice produse de pneumalergeni, alimente, medicamente in tentativa de a reproduce manifestirile clinice, atunci cand explorarea alergologica a stabili semnificatia clinic’ a rezultatelor patologice ale div - explorarea unei patologii profesionale; ~ cercetarea clinica. inifiald este negativa sau pentru selor teste; Pentru a efectua teste de provocare este necesar’ indeplinirea mai multor conditii. in primul rand, sunt hecesare consimfaméantul informat al pacientului si colaborarea acestuia; este necesara prezenfa unui medic ce poate trata un soc anafilactic in orice moment. O alti conditie este intreruperea tratamentului ce poate interfera cu rezultatele testelor: antihistaminice, corticoizi local sau sistemic, bronhodilatatoare, medicamente antileucotriene, anumite medicamente psihotrope, inhibitor ai enzimei de conversie a angiotensinei; trebuie evitate medicamentele care ar putea impiedica tratamentul reactiilor severe care pot apirea (ex: B-blocante). Intervalul de intrerupere a ‘ratamentului inainte de efectuarea testului, variaz4, in functie de medicamentul utilizat. ~ Obiectivele testelor de provocare pot fi diagnostice, de confirmare a toleranfei la un medicament de inlocuire in cazul alergiilor medicamentoase sau de a determina exact doza ce Geclanseaz% simptomele, puténd astfe! adapta mai usor regimul de restricie in cazul alergiilor alimentare. Contraindicatiile testelor de provocare sunt: - antecedente de reactii anafilactice severe — cu manifestari respiratorii si/sau cardio-vasculare - manifestari non-IgE mediate severe pentru medicamente — boli buloase, manifestari sistemice ~ tratament cu B-blocant ~ astm instabil sau VEMS<70% din valoarea prezisi - cardiopatie si/sau HTA severe sau necontrolate. Exist mai multe tipuri de teste de provocare care pot fi utilizate: test de provocare subcutanat, prin intep&turd, test de provocare conjunctival’, nazalé, teste de provocare bronsic4 non- specifice $i specifice, test de provocare labiald si teste de provocare orala, test de provocare intestinalA. in practicd sunt utilizate cel mai frecvent testele de provocare oral. Testele de provocare orald pot fi efectuate in explorarea alergiilor alimentare sau a reactiilor Ja medicamente. Indicatiile unui test de provocare oral la medicamente sunt incadrate in patra grupuri 1, excluderea hipersensibilitafii in cazul unei anamneze non-sugestive si la paci simptome nespecifice; 2, propunerea unei alternative terapeutice sigure in cazul unei hipersensiblititi dovedite la un medicament, 3, excluderea reacfiilor incrucigate la medicamente inrudite, in cazul unei hipersensibilitati dovedite; 4, stabilirea unui diagnostic ferm in cazul unui istoric sugestiv pentru o hipersensibilitate la medicamente, dar cu teste alergologice negative, neconcludente sau nedisponibile. Testele de provocare orali la medicamente se vor utiliza doar dacd medicamentul este indispensabil si/sau frecvent prescrs sau dac alternativele terapeutice sunt putin numeroase, Testul de provocare oralé la alimente are mai multe indicatii: - 1a pacienfii cu istoric de reactii la alimente - stabilirea sau excluderea diagnosticului de alergie sau intoleranga la alimente - determinarea pragului de sensibilizare : i a - estimarea toleranfei, in cazul in care se suspecteazii cf alergia a devenit asimptomatica, in special la copii ~ la pacientii fara un istoric specific de reactii la alimente i - daci un simptom cronic este suspectat de pacient sau de medic ci ar fi datorat unui alimentCap. 11 Evaluarea imunologici si alergolog 141 - daca pacientul urmeaza un re iar alimentul trebuie reintrodus, ~ dacii este diagnosticata o sc aliment. gim de eliminare necorespunzittor, fird istoric de reactii la alimente, » dar sunt motive de a suspecta o posibild reactie adversi nsibilizare 1a un aliment, dar nu se cunoaste tolerana clinic& la acel Testele vor fi placebo-controlate gi preferabil dublu orb, sau cel putin simplu orb. 15. 1 Diagnosticul in vitro In cazul utilizarii metodelor in vitro in diagnosticul alergiilor, vor fi examinate diverse lichide din corpul uman, cum ar fi sfingele sau sectefiile nazale, Aceste investigatii vor fi utilizate ca metode de depistare a unui teren atopic sau ca gi metode complementare in diagnosticul bolilor alergice. Metodele in vitro vor putea fi utilizate in locul testelor cutanate in cazul contraindicatiilor pentru efectuarea testelor cutanate: © pacienti cu boli ale pielii la locul testarii * pacienti cu rise crescut de reactii anafilactice la testele cutanate © alergeni exotici pentru care nu sunt disponibile extracte alergenice standardizate sau cand nu este cunoscut’ puterea alergenului * pacienfi care nu pot sau nu vor sa intrerupd tratamentul antihistaminic * studi epidemiologice. Toate metodele in vitro au un mare dezavantaj: nu se coreleazi cu severitatea manifestarilor clinice, chiar dac& vom realiza dozaje precise. JgE sunt imunoglobulinele implicate in reacfiile de hipersensibilitate de tip I si pot fi dozate prin mai multe metode: - _ semicantitative: bandeleta sau imunoDOT - _ cantitative: RAST, ELISA. Principiul tuturor acestor metode este in general acelasi: Ac specific dirijat contra unui alergen este legat pe bandeleta de celulozi sau pe placa de catre alergenul aflat la suprafata acestora, forménd astfel complexe Ag-Ac. Dupa spalare, aceste complexe vor fi facute vizibile de catre un cromogen sau vor fi misurate prin intermediul unui cromogen sau al unei substanfe radioactive. IgE totale cuantificate in ser vor fi exprimate in KUI/I (kilo-unit&ti internationale/litru), unde 1U1 = 2,4 ng proteina. in general dozajul IgE totale este realizat prin ELISA. Concentratia serica a IgE totale este dependenta de varsta, crescdnd progresiv pana la varsta de 10-15 ani, iar din decada a Il-a pana in decada a VIII-a de viafa se inregistreaza o diminuare progresiva a concentratiei de IgE totale. Concentratia crescuta a IgE totale are doar o valoare orientativa. O valoare mai mare de 70 KUIA sustine un diagnostic de alergie. Valori de 10000 KUM pot fi atinse Ia unii pacienti alergici. Exist si boli non-alergice care pot duce la valori crescute ale IgE totale: parazitoze, deficite imune congenitale, imunosupresia (boala gref’i contra gazda), SIDA sau arsuri grave, Muttitestele sunt utilizate in general in screening si sunt sisteme care contin mai multi alergeni frecvent implicati in patologia alergica, fixafi pe bandeleta sau pe placi (sistem CAP sau amestecuri lichide de alergeni). Sunt in general teste ieftine, iar un test negativ va exclude in general necesitatea unor investiga|ii suplimentare (teste cutanate, dozaj IgE specifice), dar un test pozitiv nu va confirma o alergie, Sistemele tip bandeletd sunt mai putin precise. IgE specifice se vor doza prin RAST sau un sistem imuno-enzimatic, Metodele permit dozarea IgE specifice pentru mai mult de $00 de alergeni, iar pentru fiecare dozaj sunt necesare doar 50 I de ser sau de alte secrefii. Ca valori de referinjé exist seruri standardizate atat pentru a stabili valoarea IgE cét gi pentru controlul de calitate a metodelor, Valoarea IgE specifice nu se coreleazA in general cu severitatea simptomelor. Triptaza este eliberati in momentul degranulérii mastocitelor, cum ar fi in reacfiile de hipersensibilitate de tip 1. Funcfia triptazei este neclara, fiind probabil implicati in punerea laCap, 11 Evaluarea imunologici si alergologicit 142, dispozitie a bradikininei, dar este mai usor de dozat decat histamina, care este foarte instabila. Triptaza poate fi dozata in diverse fluide, permifdnd evaluarea activitatii mastocitelor. Valoarea normalé a triptazei serice la indivizi sindtogi variaza intre 1-10 ng/ml, Valoarea crescuti a triptazei in conditii bazale (>20 ng/ml) este utilé in diagnosticul mastocitozei, iar valoarea crescuti in cazul unei reacfii sistemice va confirma caracterul anafilactic al acesteia. Pentru dozarea triptazei in cazul unei reacfii sistemice se vor recolta 10 ml de sange in tub sec sau EDTA, in primele 2 ore de la debutul acestei reactii, preferabil intra-vitam sau inaintea intreruperii procedeelor de resuscitare la pacienfii la care survine decesul in urma reactiei. Proba recoltat va putea fi pastrata la 4 °C maxim 12h inainte de prelucrare in laborator. Interesul dozarii triptazei in special in reactiile perianestezice este in primul rand medico-legal, triptaza fiind un marker specific al degranularii mastocitare, ECP este eliberata de eozinofile prin degranulare, avand un efect citotoxic si neurotoxic si nu se giseste in singe sub forma liberi, ECP este dozati in singe dupa coagularea in vitro a acestuia si corespunde cantititii de substantai care a fost eliberata de eozinofile. Valoarea medie prag este de 105 ng/ml, dar valorile pot fi foarte variabile si nu sunt crescute in general in caz de riniti alergic’. Aceasti substanti poate fi crescuta in reactiile de hipersensil litate de tip I dar si in bolile parazitare, rinita nonalergic cu eozinofile (NARES) si polipoza nazali. Dozarea ECP este utila in monitorizarea raspunsului la tratament: tratamentul eficient va determina sciderea valorii ECP.