06-Nov-23

Diagnosticul de laborator al
infecției cu HIV/SIDA

Obiective
• Cunoașterea indicațiilor de diagnostic al infecției HIV
• Cunoașterea metodelor de diagnostic şi criteriilor de
diferențiere HIV-infecție versus SIDA
• Cunoașterea etapelor în diagnosticul de laborator al
infecției cu HIV
• Cunoașterea metodelor de diagnostic de laborator în
infecțiile cu herpesvirusuri

1
 06-Nov-23

Scurtă recapitulare – hepatitele virale

• Într-o comunitate rurală apar mai multe cazuri de pacienți
cu icter. Care ar putea fi cea mai probabilă cauză?
• Care sunt metodele de rutină utilizate în diagnostic?
• Există metode de profilaxie specifică?

• Un utilizator de droguri intravenoase, cunoscut cu infecție

VHB de 5 ani, prezintă o acutizare a infecției cu disfuncție
hepatică severă. Care ar putea fi cauza și cum punem
diagnosticul virusologic?

Virusul imunodeficienței umane (HIV)

• HIV este un membru al

familiei lentivirusurilor, un
subgrup al retrovirusurilor.
• Este un virus ARN care se
replică prin intermediul un
intermediar ADN.
• HIV-1 prevalent la nivel global
• HIV-2 endemic în Africa de
Vest și Asia de Sud
• progresie mai lentă a infecției

2
 06-Nov-23

• HIV este alcătuit din:

Structura HIV 1. Miez: conține materialul
genetic [ARN] și revers-
transcriptaza.
2. Capsida: învelișul proteic
exterior (p24).
3. Anvelopa (env): Derivată din
membrana celulei infectate,
conținând numeroase proteine
spike formate din:
A. gp120 care se atașează la
celula T CD4+ a gazdei.
B. gp41 transmembranară
4. Polimeraza (pol)

Căile de transmitere ale HIV

Sânge și produse
Sexuală Mamă - făt Ace contaminate
de sânge
• Calea • Poate avea loc • În prezent, • Risc crescut la
dominantă de in-utero (30%) riscul este consumatorii de
transmitere la • Majoritatea redus în droguri
nivel mondial perinatal (60%) majoritatea intravenoase
• Riscul creștere • Prin lapte (10%) țărilor prin • Personalul
prin expuneri impunerea unor medical poate fi
• Profilaxia cu
repetate măsuri de expus la
antiretrovirale
• ITS care produc reduce
screening al înțepături cu
ulcerații la nivel sângelui ace
transmiterea
genital cresc contaminate
riscul de
transmitere

3
 06-Nov-23

Indicații de diagnostic
• Depistarea infecției la adulți ar trebui realizată pentru:
• Toţi pacienţii diagnosticaţi cu o infecţie cu transmitere
sexuală
• Partenerii sexuali ai persoanelor cunoscute cu infecţie HIV
• Persoanele cu multipli parteneri sexuali
• Persoane cu istoric de consum de droguri injectabile
• Persoanele care vin din ţări cu prevalenţă HIV crescută
• Pacienţii care se prezintă la spital şi infecţia HIV intră în
diagnosticul diferenţial
• În cadrul testelor de screening prenatal

Indicații de diagnostic
• Eliminarea suspiciunii unei primo-infecţii după expunere recentă
• test de screening (care trebuie repetat, dacă este necesar, la 6
săptămâni după expunere)
• testarea sursei de infecție
• Screeningul donatorilor de sânge
• depistează infecții transmise parenteral (HIV, VHB, VHC, HTLV, sifilis)
• Depistarea infecțiilor la nou-născuți:
• anticorpii anti-HIV materni sunt transmiși transplacentar
• testarea prin RT-PCR este necesară
• Monitorizarea tratamentului antiretroviral (indicație și control):
• Încărcătura virală – detectare cantitativă ARN /HIV în plasmă prin RT-
PCR
• Număr de limfocite T CD4 (test nespecific, util monitorizării)

4
 06-Nov-23

Metode de diagnostic
Diagnostic indirect
• detecția anticorpilor anti-
HIV
• prin teste de diagnostic
rapid (imunocromatografie)
• prin ELISA
• Western Blot (pentru
confirmarea rezultatelor)
Diagnostic direct
• detecție de antigene HIV
• Ag p24 – proteina capsidei
• detecția genomului HIV
• ARN viral prin RT-PCR în
plasmă
• genotipare
• ADN proviral prin PCR în
celulele mononucleare din
sânge (alternativă)
• izolarea HIV în culturi de
celule
• nu se efectuează ca
procedură de diagnostic de
rutină

Etapele diagnosticului de laborator

1. Teste de screening
2. Confirmarea infecției cu HIV
3. Stadializarea infecției la pacienții HIV-pozitivi
4. Monitorizarea eficacității tratamentului antiretroviral

5
 06-Nov-23

1. Teste de screening
• detectarea combinată a prezenței anticorpilor și antigenului
p24 anti-HIV prin ELISA = test de referință pentru screening
• negativ = fără infecție HIV (cu excepția cazului în care
expunerea a avut loc cu mai puțin de 6 săptămâni în urmă)
• pozitiv = ser reactiv

• detectarea anticorpilor anti-HIV prin teste de diagnostic rapid

• Sânge capilar
• Rezultate în doar câteva minute
• Mai puțin sensibil decât ELISA

2. Teste de confirmare
• pentru toate serurile reactive

• confirmarea prezenței anticorpilor anti-HIV prin Western blot

• Pe aceeași probă de sânge
• Pozitiv → un nou test de screening (ELISA) pe o a doua probă de
ser
• Negativ/nedeterminat → detectarea ARN-ului viral în plasmă
(viremia)

6
 06-Nov-23

Test Western blot pentru confirmarea diagnosticului de infecție cu HIV

Testele imunoenzimatice evidențiază prezența anticorpilor țintiți împotriva a diferite proteine
HIV: anticorpi împotriva glicoproteinelor de înveliș (env), a proteinelor structurale (gag), a
enzimelor virale (pol).
Test pozitiv = Anticorpii anti-ENV (gp 160/120, gp41) +/- Anticorpii Anti-GAG (p24) +/-
Anticorpii Anti-POL (p52)

Viremia – încărcătura virală plasmatică

• Cuantificarea viremiei plasmatice HIV prin măsurarea ARN-
ului viral
• Prin qRT-PCR
• Prag de detecție de 20 până la 50 de copii/ml
• Încărcare virală sub acest prag = nedetectabilă
• Avantaj - pozitivitate mai devreme
• Limita - fereastra virusologică (8-10 zile de la infecție)
• Utilizată pentru confirmarea diagnosticului, cât și pentru
urmărirea eficienței tratamentului ARV

7
 06-Nov-23

3. Stadializarea infecției la pacienții HIV-pozitivi

• Markerii HIV (prezența Ac, Ag p24 și viremia) sunt utilizați
pentru a determina stadiul de infecție, împreună cu:

• Numărul de limfocite T CD4 / mmc

• Stadializare
• Prognostic
• Monitorizarea tratamentului antiretroviral

Evoluția naturală a infecției HIV

1.Primo-infecția
2.Seroconversia
3.Perioada
asimptomatică
4.SIDA

8
 06-Nov-23

Primo-infecția

• Viremie HIV (ARN

pozitiv)
• după ziua 10
• antigen p24 pozitiv
• după ziua 15
• anticorpi anti-HIV
• după ziua 20
• scădere importantă a
numărului de limfocite
T CD4

Seroconversia

• Apariția anticorpilor
neutralizanți
• Revenirea numărului
de limfocite T CD4
• 40%-90% din pacienți
pot prezenta sindrom
retroviral acut (sim-
ptome de mononucle-
oză, limfadenopatie,
febră)

9
 06-Nov-23

Perioada asimptomatică

• Ag p24 devine
nedetectabil
• Anticorpii anti-HIV sunt
prezenți
• Viremia este scăzută
• Declin gradual al
numărului de limfocite
T CD4

SIDA (sindrom de imunodeficiență dobândită)

• Nr. limfocite T CD
< 200 /mm3
• Reapare Ag p24
• Creșterea încărcăturii
virale
• Scădere a anticorpilor
anti-HIV
• Dispariția anticorpilor
anti-p24

10
 06-Nov-23

4. Monitorizarea eficacității tratamentului antiretroviral

• Viremia
• cuantificarea ARN HIV, în plasmă, prin RT-PCR este cel
mai fidel marker al replicării virale
• sub tratament, în 3-6 luni, trebuie să devină
nedetectabilă
• reevaluare la 1, 3, 6 luni de la inițierea terapiei
• Numărul de limfocite CDT4
• determinat prin citometrie de flux
• revine la normal sub terapie
• reevaluare la 6 luni

Diagnosticul la copii cu vârsta sub 2 ani

• Testele serologice nu pot fi utilizate până la vârsta de 18-24 de

luni (trecerea transplacentară a Ac anti-HIV materni).
• Detecție de ARN-HIV în plasmă
• Nou-născut din mamă HIV-pozitivă - test ARN-HIV în plasmă la
naștere, la 1, 3, 6 luni
• 2 teste pozitive succesive = transmitere de la mamă la copil

• Administrarea ARV în sarcină / profilaxia la nou născut cu ARV

reduce riscul de transmitere a HIV

11
 06-Nov-23

Diagnosticul de laborator al infecțiilor

cu virusuri herpetice

12
 06-Nov-23

Virusurile herpetice

• Virusuri ADN care produc

infecții persistente, cu
perioadă de latență și
reactivări
• Larg răspândite la nivel
global
• Pot produce infecții
severe la persoanele cu
deficiențe imune

Virusurile herpetice
Virus Primo-infecție Reactivare La imunodeprimați

Virus Herpes simplex 1 Frecvent Herpes labial Encefalită

(HHV-1) asimptomatică
Virus Herpes simplex 2 Frecvent Herpes genital Leziuni ulceroase
(HHV-2) asimptomatică importante
Virus Varicella-Zoster Varicela Herpes zoster Herpes zoster sever,
(HHV-3) diseminat
Virus Epstein-Barr Mononucleoza - Limfoame
(HHV-4) infecțioasă
Cytomegalovirus (HHV-5) Boală asemănătoare - Retinită, colită,
cu mononucleoza pneumonie, encefalită
HHV6, HHV 7 Boli eruptive - Encefalită
(exantem)
Herpesvirusul asociat - - Sarcom Kaposi
sarcomului Kaposi (HHV8)

13
 06-Nov-23

Diagnosticul infecțiilor cu herpesvirusuri

• Virusurile Herpes simplex 1 și Herpes simplex 2 produc
leziuni ulcerative specifice (vezicule cu lichid) la nivelul
mucoaselor (orală, genitală).
• Virusul Varicella-Zoster produce leziuni similare, dar la
nivel cutanat:
• erupție generalizată, pruriginoasă, în varicelă;
• leziuni dureroase, la nivelul unui dermatom, în herpes zoster.
• Diagnosticul de rutină este clinic (leziuni specifice).
• În cazul mengitelor și encefalitelor, putem testa prezența
ADN-ului acestor virusuri, în LCR, prin PCR.

Infecția cu virusul Epstein-Barr

• Mononucleoza infecțioasă (MI) =
infecție primară, simptomatică,
cu virus Epstein-Barr

14
 06-Nov-23

Sindromul mononucleozei
• Diagnostic nespecific: prin hemogramă și numărul de
globule albe din sânge
• >50% celule mononucleare
• >30% limfocite activate (atipice)
• dimensiune crescută

• colorație bazofilică

• Cauze comune - infecții primare:

• VEB (majoritar), CMV, HIV, Toxoplasma gondii

• Frotiu de sânge - limfocitoza, limfocite atipice

15
 06-Nov-23

Diagnostic direct
Produse patologice
• salivă, lavaj faringian, sânge, țesut limfoid

Metoda
• detectarea ADN-ului virusului Epstein-Barr prin PCR
(teste calitate) și cantitative (qPCR).

Diagnostic indirect al primo-infecției cu VEB

• detectarea anticorpilor heterofili (aglutinanți ai globulelor
roșii de origine animală) (test util pentru adulți, nu și pentru
copii)
• Apar precoce (la finele primei săptămâni, și persistă
câteva luni)
• Sensibilitate 85-90% (mai mică la copii- % mare de reacții fals
negative, dar și pozitive)
• Specificitate >90

16
 06-Nov-23

Diagnostic indirect al primo-infecției cu VEB

• detectarea anticorpilor specifici anti-VEB - IFI, ELISA
• IgM anti-VCA
• apar primii și apoi dispar după 4 până la 6 săptămâni
• pot persista timp de 6 luni
• IgG anti-VCA
• apar în decurs de o săptămână de la infecție și rămân
prezenți toată viața
• IgG anti-EBNA
• apar după faza acută, la 2 până la 4 luni de la prima
infecție și rămân prezenți toată viața (demonstrează
rezoluția infecției)

Profil serologic

Ac anti-VCA Ac anti-VCA Ac anti-

INFECȚIE
IgM IgG EBNA

Acută (primo-
+ - -
infecție)

Anterioară - + +

Absența infecției - - -

17
 06-Nov-23

Diagnosticul infecției cu VCM

• Scopul diagnosticului:
• identificarea infecției primare
• identificarea infecțiilor persistente la donatorii de
organe/sânge
• determinarea titrului antigenelor pentru monitorizarea
chimioterapiei

Diagnostic direct

• Produse patologice
• urină
• sânge
• lichid de lavaj bronhoalveolar

18
 06-Nov-23

Metode de diagnostic direct

• Izolarea virusului pe culturi de celule fibroblastice
(câteva zile sau săptămâni)
• microscopie (incluziuni „în ochi de bufniță”)
• antigene virale evidențiate prin colorație specifică cu
imunoperoxidază (câteva ore)
• nu se realizează de rutină
• Detectarea ADN-ului V prin PCR
• probe de sânge fetal intrauterin
• lichid amniotic
• Teste antigenice - prin IF
• pentru diagnostic precoce și pentru verificarea efica-
cității terapeutice
• proteina virală pp65, în nucleul celulelor polinucleare

Incluziunile “în ochi de bufniţă” apar după 10-21 de zile

(ceea ce limitează utilizarea metodei).

19
 06-Nov-23

Diagnostic indirect – detectare de anticorpilor

specifici
• Detecția anti-VCM IgG
• să clasifice donatorii și primitorii de organe ca fiind
seropozitivi sau seronegativi
• să depisteze femeile seronegative înainte de sarcină
• Aviditatea IgG (testul de aviditate IgG): o aviditate
ridicată elimină posibilitatea unei infecție recentă
• IgM anti-VCM
• Pot persista pentru o perioadă lungă de timp
• Infecție primară sau reactivată

• Seroconversie = infecție primară (spre deosebire de

reactivare)

20