UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE CRAIOVA

FACULTATEA DE MEDICINA

DISCIPLINA IMUNOLOGIE
Lucrari practice

SCHEMA DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR AL INFECTIILOR

BACTERIENE

RECOLTAREA SI PRELUCRAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

DlAGNOSTIC MICROBIOLOGIC
Examen direct preparat proaspat
frotiu fixat si colorat
Izolare
in vitro (medii de cultura) sau in vivo (animal de laborator)
Identificare caractere de cultura (pe mediul lichid si pe mediul solid)
caractere morfologice (dimensiuni, forma, gruparea, prezenta sporilor, a capsulei)
caractere metabolice/biochimice (transformarile suferite de glucide, proteine;
Caractere ANTIGENICE

actiunea reductoare a bacteriilor-pe mediile politrope MIU, TSI)

( reactii Atg-Atc)

caractere de patogenitate (testul coagulazei, fibrinolizinei, fermentarii manitei,

pigmentogenezei, etc)

sensibilitate la bacteriofagi/lizotipia (virusuri bacteriene ce produc liza bacteriilor)

alte caractere
Antibiograma
DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC :
Teste de imunitate umorala in vitro sau in vivo
Teste de imunitate celulara in vivo sau in vitro

METODOLOGIA DE INVESTIGARE A STATUSULUI

IMUN
Reactivitatea imun a gazdei poate fi mediat de anticorpi sau de celule :
Raspuns imun umoral
Raspuns imun mediat celular
Mecanismele apararii imune, mediate prin Atc sau celule, se intrica in
organism in lupta cu agentul ofensiv, prezentarea lor separata se face doar in
scop didactic.
I. EXPLORAREA IMUNITATII UMORALE
(RASPUNSUL IMUN UMORAL- RIU)

- Raspunsul imun umoral are loc fie la nivel sistemic/circulator RIU sistemic
fie la nivel cutanat/mucoase RIU local
- Pentru fiecare raspuns imun umoral exista modalitati de investigare specifice
- RIU este realizat cu participarea Ly B (Ly B sunt activate de Atg prin
intermediul R membranari specifici de pe suprafata lor diferentiate
in celule secretorii de Atc = Plasmocite Atc specifici pentru Atg
stimulant ce vor reactiona in vivo complexele Atg-Atc)

RIU Sistemic

Investigarea reactivitatii imune umorale sistemice se realizeaza prin:

Teste ce apreciaza numarul de Ly B circulante
Teste ce investigheaza functionalitatea Ly B
Teste ce apreciaza numarul de Ly B circulante
testul de transformare blastic limfocitar (poate fi folosit si pentru
aprecierea numerica a Ly T si poate fi interpretat si ca un test functional)
investigheaza capacitatea Ly B de a secreta factorul mitogen activeaza
alte Ly cu declansarea proliferarii lor celulare limfoblasti
teste de rozetare fenomen de imunocitoaderenta ce consta in legarea
unui Atg la R membranari ai Ly
reacii de imunofluorescen
citometrie n flux (flow-citometria) tehnica noua
RIU Local prin evaluarea concentratiei imunoglobulinelor IgA
secretorii

 Teste ce investigheaza functionalitatea Ly B

circulante
- Dozarea principalelor clase de Ig serice(Atc) : Ig G, Ig M,
Ig A, Ig D, Ig E prin :
o Tehnica de imunodifuzie radiala simpla (IDRS), metoda
MANCINI-CARBONARA
o Tenhica radiometrica RIST (Radio-Immune Sorbent Test)
ce dozeaza Ig din clasa Ig E ce sunt implicate in starile de
hipersensibilitate imediate de tip I (reactiile anafilactice)
Electroforeza proteinelor serice
Investigarea calitativ a imunoglobulinelor n ser, urin, fluidul
cerebrospinal (imunoelectroforeza)
Tehnicile cel mai des utilizate sunt reactiile ce au la
baza reactia Atg-Atc, ce ne ajuta sa evaluam/titram
diferitele categorii de Atc din umori (sange) sau urina
LCR

REACTIILE ANTIGEN-ANTICORP
Pentru identificarea unui Atg ca si pentru stabilirea prezentei si titrului
Atc-ilor sintetizati in organism se utilizeaza reactiile Atg-Atc.
Din considerente didactice aceste reactii au fost impartite in :
- Reactii clasice reactii folosite la inceputul investigatiilor imunologice
- Reactii moderne reactii mai fiabile si care ne ofera mai multe
satisfactii cand lucram.

REACTIILE CLASICE
Reactia de aglutinare Atg face parte in mod natural din suprafata unor
structuri particulate care apartin unor agenti infectiosi, eritrocitelor sau
este fixat artificial pe hematiisau particule anorganice (polistiren latex);
Reactia de precipitare Atg este reprezentat de o molecula solubila si
induce sinteza de Atc specifici precipitanti;

 Reactia de seroneutralizare Atg care prezinta anumite proprietati/

activitate biologica (toxine, enzime, hormoni) induc formarea de Atc seroneutralizanti care au capacitatea de a le bloca activitatea;
Reactiile cu hematii se folosesc de mult timp; se numesc asa pentru ca
in cazul reactiilor + prezenta hematiilor cu rol indicator ne ajuta sa stabilim
chiar titrul Atc din produsul prelevat de la bolnav.
Reactii care utilizeaza hematiile ca indicatori :
- HAP, HAI, RFC, ASLO, Testul Coombs
REACTIILE MODERNE
- Reactiile de imunofluorescenta (IF)
- Reactiile RIA ( radioimmunoassay-radio imunotestarea)
- Reactia ELISA (Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay)

Identificarea serologica ( de ex.

Identificarea unei specii sau serotip
bacterian) :
CULTURA Germen
Atg ???

Ser standard
(Atc)
(cu specificitate
cunoscuta de gen,
grup, tip, subtip)

Diagnosticul serologic (metoda indirecta)

investigam reactivitatea organismului infectat.
SER bolnav
Atc ???

Atg standard
cunoscut

 Exemplu de identificare serologica (antigenica):

- Incadrarea serologica a enterobacteriilor (Escherichia
coli, Salmonella, Shigella), a brucelelor, vibrionilor
holerici, gonococilor, etc.
Exemple de diagnostic serologic :
- Dg serologic al febrei tifoide si paratifoide A, B
reactia WIDAL
- Serodiagnosticul brucelozei reactia WRIGHT
- Dg serologic al tifosului exantematic reactia
WEIL-FELIX.

 Diagnosticul serologic are sens numai in infectiile cu

evolutie prelungita sau cronica Atc depistati in serul
bolnavului au semnificatie clinica daca traduc experienta
imuna dintr-o infectie actuala; ei sunt fara importanta pentru
diagnostic sau prognostic daca au aparut dupa vaccinare.
In diagnosticul serologic se vor preleva doua seruri :
- Serul I de debut
- Serul II de convalescenta (recoltat dupa 10-14 zile de la
prima recoltare). Ambele prelevate se vor testa concomitent.
- ???
- Trebuie sa observam/urmarim dinamica Atc in timp sa
vedem daca avem diferente intre titrul serului I si cel al serului
II titrul serului II sa creasca cu cel putin 4 dilutii/trepte
binare putem afirma ca avem un raspuns imun

CATEGORII DE DILUTII UTILIZATE IN REACTIILE SEROLOGICE

Dilutii logaritmice (dilutii cu rata 10) - exemplu
Nr.

1.8

1.8

1.8

1.8

1.8

tub/gode
u
Diluent
(ex.ml)

0.2 ml

0.2

0.2

0.2
se elimina
0.2 ml

Produs
patol.
(ml)

0.2

Dilutia
obtinuta

1/10

1/100

1/1 000

1/10 000

1/100000

10

10

10

104

105

Diluii binare (cu rata 2) - exemplu

Nr.

tub/godeu
Diluent
(ex.ml)

1 ml

1
se elimina
1ml

Produs
1
patol. (ml)
Dilutia
obtinuta

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

RECOLTAREA SI PREPARAREA SUSPENSIEI DE HEMATII

se recolteaz snge cu o seringa ce conine o mic cantitate de soluie
Alsever.
se scoate acul de seringa si sngele va fi trecut imediat intr-un tub cu soluie
Alsever astfel inct sa se realizeze dilutia 1/4.
se amesteca cu grij i se pastreaz la 4C (14-20 zile)
in ziua folosirii se va proceda la o centrifugare de 5 minute la 1000 t/min., iar
supernatantul va fi ndeprtat prin absorbie.
- Hematiile vor fi spalate de 3 ori cu TFS (tampon fosfat salin), pH 7,2, prin
centrifugare la 1000 t/min.
- Urmeaz o alt splare la 1000 t/min. timp de 10 minute, dupa care
supernatantul va fi ndeprtat
se prepar apoi suspensia de hematii dorit in TFS. (0,5%, 1%, 1,5%)

Reacii serologice care utilizeaz suspensii de hematii de diferite

specii, ca indicatori ai reaciei antige anticorp :
HAI

HAP

RFC

ASLO

Testul Coombs

//. EXPLORAREA IMUNITATII CU MEDIERE CELULARA

(Raspunsul imun intermediat de celule - RIC)

Raspunsul imun mediat celular este directionat in special impotriva unor

celule care exprima Atg ( celule straine, tumorale, infectate cu agenti
patogeni).
Raspunsul imun celular este mediat de Ly T - specifice, sensibilizate, care
actioneaza asupra celulelor tinta direct sau prin intermediul unor mediatori
solubili; si de macrofage.

Investigarea imunitatii celulare poate fi realizata in vivo si in vitro.

Teste ce evalueaza numeric populatiile si subpopulatiile de Ly T

Teste ce evalueaza functionalitatea Ly T

Teste ce evalueaza numeric populatiile si subpopulatiile de Ly T

teste asemanatoare celor de evaluare numerica a Ly B :
- Teste de rozetare
- Tehnici de imunofluorescen
- Citometria n flux

 Teste ce evalueaza functionalitatea Ly T

Teste in vitro :
-

Testul de transformare blastic Ly T investigheaza capacitatea Ly T de

a elibera factori mitogeni activeaza alte Ly cu declansarea proliferarii lor
celulare limfoblasti.

Testul de inhibiie a migrrii macrofagelor urmareste daca Ly T ale

pacientului elaboreaza factorul solubil de inhibitie al migrarii macrofagelor; in
vivo determina blocarea macrofagelor in procesul inflamator = rol important.

Testul de citotoxicitate imun verifica daca Ly T prelevate de la bolnav

sunt capabile sa elaboreze factorul solubil numit limfotoxina (TNF ), care
determina pe culturi celulare efecte de citotoxicitate.
Studiul citokinelor dozarea citokinelor (interleukinelor) elaborate de Ly T
sau macrofage.

TESTE DE IMUNITATE CELULAR IN VIVO

-

- Intradermoreaciile de tip tuberculinic

III. INVESTIGAREA UNOR EFECTORI COMUNI APARARII

NNASCUTE SI APARARII DOBNDITE

Investigarea complementului
- Investigaii cantitative pentru componente individuale (C3, C4,C1q)
-

Teste funcionale

Studiul polimorfonuclearele neutrofile i monocitelor

- Cuantificare
- Teste funcionale in vitro
- Investigarea celulelor NK

SITUATII N CARE SE IMPUNE INVESTIGAREA

RASPUNSULUI IMUN

Situaiile n care se impune investigarea rspunsului imun n

scopul stabilirii agentului cauzal al unei boli infecioase i urmririi
reactivitii imune a gazdei:

agentul etiologic este cantonat n zone inabordabile prelevrii

produselor patologice (bruceloz, leptospiroz, sifilis latent etc) ;
cultivarea agentului infectios pe medii de cultur este dificil sau
chiar imposibil (rickettsii, Treponema pallidum, virusuri etc);
izolarea agentului nfecios din prelevatul patologic a fost ratat din
cauze diferite: investigaii tardive, utilizarea unor tehnici cu
sensibilitate i specificitate reduse;
semnificaia clinic a unor prelevate este discutabil (recoltarea
unor probe nerelevante pentru perioada n care se afl bolnavul);
pentru diagnosticul diferential in cazul unor afectiuni care prezinta
variante cu manifestari clinice asemanatoare (Lupusul eritematos
sistemic cu formele subacut, cronic sau medicamentos; hepatite cr
virale de hepatitele autoimune).

RECOLTAREA SI PREGATIREA PRODUSELOR PATOLOGICE

IN VEDEREA EFECTUARII REACTIILOR IMUNOLOGICE

Colectarea, prepararea i conservarea probelor

- cel mai frecvent se lucreaz pe probe de snge recoltate la
debutul afeciunii i n perioada de convalescen (pentru
testrile serologice) dup care urmeaz separarea cheagului
prin centrifugare in cel mult 4 ore de la recoltare, dup
procedura standard ;
- nu se impun condiii speciale de pregtire a pacientului pentru
prelevarea probelor ;
- tuburile vor fi inchise etan, pentru evitarea contaminrii i
depozitate la temperaturi intre +2 i +8 C - timp de 3 zile
sau prin congelare - timp de 6 sptmni.
- Se elimin serurile lipemice, hemolizate i icterice.

dezinfecie

puncionarea venei

colectare n vas steril inchis

Etapelor de recoltare corect a probelor de snge

(dezinfecie, puncionarea venei, colectare n vas steril inchis)