Curs 11

Acizi nucleici
Tipuri de acizi nucleici
Componeni structurali ai acizilor nucleici
Structra primar covalent a acizilor nucleici
Conformaia moleculei de ADN
Denaturarea i renaturarea ADN
Hidroliza ADN
Organizarea superioar a ADN
Structura teriar ADN
Cromozomii eucariotelor
Distribuie ADN
 Ce sunt acizii nucleici ?
Sunt produi de policondensare a nucleotidelor;

Pstreaz i mijlocesc transferul de informaie

genetic n lumea vie.

 Dogma central a biologiei
moleculare
ADN conine informaia genetic sub forma unor
secvene de nucleotide

Transcriere Traducere
ADN ARNm Proteine

Revers transcriere

Toat informaia din celula parental este

transferat celulelor fiice.
 Tipuri de acizi nucleici
ADN

ARN

ARNm, ARNt, ARNr, ARN de mici dimensiuni,

miARN, siARN
 ADN

stocheaz o cantitate mare de informaie cu privire

la biosinteza proteinelor

informaia poate fi accesat imediat

 ARN :
mesager: transfer informaia din nucleu n citosol n
form de secven de nucleotide

de transport: face legtura ntre ARNm i aminoacizi;

Ribozomal: intr n structura ribozomilor (complexe

ribonucleoproteice, sediul biosintezei proteice);

de mici dimensiuni: rol n excizia intronilor

 Componenii structurali ai acizilor
nucleici

Pentoza sub forma ciclic -furanozic

Acidul fosforic (H3PO4)

Bazele azotate: purine i pirimidine

 Riboza i dezoxiriboza
sub forma ciclic -furanozic

HC O HC O H C OH

H C OH H C OH H C OH O HOH2 C
O
H C OH H C OH H C OH
OH
H C OH HO CH2 C H HO CH2 C H
OH OH
H2C OH OH

D-Riboza -D ribofuranoz
 Baze azotate

6 7 4
5 N
1N 3N 5
8
2 2 6
N 4 NH N
3 9 1
Purin Pirimidin
 Tautomeria lactam lactim a
bazelor azotate
Formele lactam sunt mai stabile
O OH
C NH C N
forma lactam forma lactim

Tautomerie imino-amino
NH2 NH

N C NH C
forma amino forma imino
 Purine

Adenina

Guanina
 Pirimidine
OH O OH O
N HN CH3 CH3
N HN
HO N O NH HO N O NH
Lactim Lactam Lactim Lactam
Uracil (2,4-dihidroxi-pirimidina) Timina (5-metil-uracil)
NH2 NH2

N N

HO N O NH
Lactim Lactam
Citozina (2-hidroxi-4-amino-pirimidina)
Legtura N-glicozidic
numerotare atomi ????
 Nucleozide
(ribo- i dezoxiribonucleozide)
Ribonucleozidele
NH2 O
N N
N NH
9 9
5` N
HO H2 C N N N NH2
O HO H2 C
4` 1` O
3` 2`
OH OH Adenozin (A) Guanozin (G)
OH OH
NH2 O
N NH
1 1
5` N O O
HO H2 C N
O HO H2 C
4` 1` O
3` 2` Citidin (C)
OH OH Uridin (U)
OH OH
 Dezoxiribonucleozidele
NH 2 O
N N
N NH
9 9
5` N N NH2
HO H2 C N HO H2 C N
O O
4` 1`
3` 2`
OH H HO H Dezoxiguanozin (dG)
Dezoxiadenozin (dA)
NH2 O
H3 C
N NH
1 1
5` N O N O
HO H2 C HO H2 C
O O
4` 1`
3` 2`
OH H OH H
Dezoxicitidin (dC) Dezoxitimidin (dT)
 Nucleotidele
Sunt esteri fosforici ai nucleozidelor
NH2
N
N Adenin
O O O Adenozin
5` sau
O- P O P O P O N N
O Dezoxiadenozin
O- O- O- 4` 1` (nucleozide)
X=H Dezoxiriboz
3` 2` X=OH Riboz
OH X
AMP (adenozinmonofosfat)

ADP (adenozindifosfat)

ATP (adenozintrifosfat)
 Proprietile nucleotidelor i
nucleozidelor
sunt stabile n mediu bazic

Solubilitatea nucleotidelor n ap este mai

mare dect a nucleozidelor

Nucleotidele prezint absorban maxim

la 260 nm, la pH = 7
 Conformaia nucleotidelor i
nucleozidelor

Determinat de:- flexibilitatea ribozei

3`
PO 5` PO 5`
2`
4` O O Baz
Baz 4`

1` 1`
3` .
5,9 A PO 2`
. PO
7,0 A C-2` endo C-3` endo
"South" "North"
-n funcie de orientarea bazelor azotate

fa de legtura N-glicozidic

conformerii anti i syn

 Nucleotide naturale libere
Rolurile lor n esuturi:

-compui macroergici (ATP, GTP);

-acceptori de fosfat n fosforilarea oxidativ

(ADP);

-efectori alosterici ai activitii enzimelor;

-componeni structurali ai coenzimei FAD
NH2
N
N
O O
N N
CH2 CH CH CH CH2 O P O P O H2 C
O
OH OH OH O- O-
H3C N N O
OH OH
NH
H3C N adenozin

O
(H)
lumicrom
lumiflavin (H)
(OH)
riboflavin (H) adenozin 5`-monofosfat
(H) (AMP)
flavin adenin mononucleotid (FMN)

flavin adenin dinucleotid (FAD)

 componeni structurali ai coenzimelor
NAD+, NADP+
CONH2

+
CONH2 N
COOH O H2 C
O
O P O-
NH2
N N
O OH OH
Acidul nicotinic Amida acidului nicotinic N
- N
(niacina) (niacinamida) O P O

O H2 C N N
O

OH OR
Nicotinamid-adenin dinucleotid (NAD+)

(R = H formeaz NAD+ ; R = -PO3H2 formeaz NADP+)

mesageri secunzi (AMPc i GMPc);
 donori ai gruprilor metil
 Metilxantinele
(compui naturali cu proprieti farmacologice)
O 7 O CH3
N H3 C N
HN 1 N
3
O NH NH N
O N
Xantina Cofeina
(2,6-dioxipurina) CH3
(1,3,7-trimetilxantina)

O
O CH3
H3 C N
N N
HN
O N NH
O N N
CH3 Teofilina Teobromina
(1,3-dimetilxantina) CH3 (3,7-dimetilxantina)
 Analogi structurali sintetici ai
bazelor azotate, nucleozidelor i nucleotidelor

Inhib sinteza ADN

Sunt folosii n chimioterapie
O O SH
F I N
N HN N 6
5 5
9
N NH
O NH O N
5-Fluorouracil 6-Mercaptopurina
HO H2 C
O
Timin SH
HO H2 C
O 2` N
N 6
OH
5-Iodo-2`-deoxiuridin H2 N N NH
N3 OH
6-Tioguanina
Azidotimidina
 O NH2 O
CH3
N
HN 6
HN N 8N N
NH N
6N H2 N N
O N O N
8-Azaguanina S NO2
HO H2 C HO H2 C
O O
HO HO N 6 N
8
N 6 NH
OH N
OH OH
Arabinozil citozin 9 N
NH Azatioprin
6-Azauridin N
Alopurinol
Structura primar covalent a acizilor nucleici

Nucleozidele legate fosfat diesteric

formeaz:
-oligonucleotide
-polinucleotide

Polinucleotidul ARN conine:

-Riboz i A, G, C, U
Polinucleotidul ADN conine:
-Dezoxiriboz i A, G, C, T
 O

N
NH
O
5` N
G 5` GCA 3`
O
-
P O N NH2
O
-
O
3`
NH2
X
N
O C
N O
O P O CH2
O
-
O
3`
NH2
X
N
NH
O A

O P O CH2 N N
O
-
O
3`

3` OH X
 Cine determin diversitatea polinucleotidelor ???
 Polaritatea catenei
5` O 3`

CH2 O

5` B1 B1 5`
3` 3`

P P

5` B2 B2 5`
3` 3`

P P

5` B3 B3 5`
3` 3` 3` 5`
O CH2

O
 Conformaia moleculei de ADN;
tipuri de conformaii

Structura secundar de dublu-helix a ADN

a fost propus de

Watson i Crick
-analiza cromatografic
n toate tipurile de ADN

numrul de baze purinice este egal cu

cel de baze pirimidinice

A+G=T+C
-difracia razelor X, efectuat pe cristale de ADN

existena a dou perioade de identitate de-a

lungul axei lungi a moleculei:

una mare de 34 i

una mic de 3,4 .

 Dou catene antiparalele (una cu polaritate 5-3 i cealalt
antiparalel cu polaritatea 3-5) complementare nu identice
formeaz o dubl helice cu orientare dreapt

O H
N O H N
H2 C
O
N G N H N C H
O N
H N O
N
H O
Dezoxiguanozin H O

Dezoxicitidin CH2
O
H
O
N N H
H2 C O
O
N A N H N
T
H
O N
H N O
O
O
Dezoxiadenozin
H2 C
Dezoxitimidin
O
 Dublul helix cu conformaiile
A
B
Z
 Caracteristici structurale ADN
forma B
2 catene complementare NU identice,
formeaz o scar n spiral cu 10 trepte;

Scheletul extern al dublului helix:

cicluri de riboz legate fosfat diesteric,
ionizat i ncrcat negativ la pH fiziologic;

Bazele azotate, sunt orientate spre interior i

perpendicular pe axul helixului.
 ADN forma B
3,4 ;
34 ;
20
 Polaritatea catenei
5` O 3`

CH2 O

5` B1 B1 5`
3` 3`

P P

5` B2 B2 5`
3` 3`

P P

5` B3 B3 5`
3` 3` 3` 5`
O CH2

O
 O H
N O H N
H2 C
O
N G N H N C H
O N
H N O
N
H O
Dezoxiguanozin H O

Dezoxicitidin CH2
O
 H
O
N N H
H2 C O
O
N A N H N
T
H
HO N
H N
O
O
H2 C
Dezoxitimidin
 Formele structurale A i Z ale
ADN
Conformaia de tip A, mai compact :
- dubl helice dreapt;
-pasul helicei este de 28 ;
- numrul de baze per tur 11;
-predomin conformerii anty.
 Conformaia de tip Z:
-corespunde la o helice stng;
-12 perechi de baze per tur;
-pasul helicei aproximativ 57 ;
-ntr-o succesiune GC dezoxinucleotidul guaninei
adopt conformaia syn iar cel al citozinei pe cea
anti, ceea ce face ca lanul s evolueze n zig-zag
ntre cele dou conformaii.
In vitro, structura Z modific interaciunile ADN-
proteine, importante n replicare, transcriere,
repararea leziunilor ADN.
Denaturarea ADN
 Ruperea legturilor de hidrogen i a interaciunilor van
der Waals dintre catenele moleculei ADN aflate n soluie.

Renaturare ADN Denaturare ADN

 Ce factori influeneaz denaturarea ?

creterea temperaturii (topire);

la valori extreme de pH
(molecula de ADN este stabil la pH-uri cuprinse ntre 4 i 10);

modificarea triei ionice;

prezena formaldehidei ;
 Proprieti fizice ale ADN care se
modific prin denaturare

scade vscozitatea;

crete absorbana la 260 nm.

 Efectul hipercrom
Prin denaturarea ADN-ului, creste capacitatea

de absorbtie a acestuia la =260 nm.

 Compoziia ADN n baze azotate
influeneaz temperatura de topire

1.5
Hipercromicitate (=260)

1.4 100

Denaturare (%)
G:C A:T 75
1.3
A:T G:C
1.2 50

1.1 25

1.0 0
Tm
0 70 80 90 100
 Renaturare
Refacerea duplexului ADN prin legarea
catenelor complementare
Renaturarea depinde de:
-temperatur;
-concentraia catenelor complementare.

Renaturarea este proces folosit n tehnica hibridrii

-determinarea poziiei intronilor n molecula ADN
-evidenierea deleiilor cromozomiale.
 Curs 5

Hidroliza acizilor nucleici

Distribuie ADN
Structura teriar ADN
Cromozomii eucariotelor
Tipuri ARN, roluri
 Hidroliza acizilor nucleici
Chimic sau Enzimatic
ADN este rezistent la hidroliza bazic
ARN este hidrolizat n mediu bazic
O O O
H2C H2C
H2C
3` 2` 3` 2` 3` 2`
5` B1 5` B1 5` B1
O - O
O 2-
O P O PO3 OH
O P O
- O + H2O
O
- +
O
OH
OH 2`
B2 3`
5` 5` 5` B2
B2
OH OH OH
 Hidroliza enzimatic
Nucleaze:
-exonucleaze (ADN polimerazele I i III)
-endonucleaze
endonucleaze de restricie (restrictaze)
evideniate la bacterii
recunosc secvene nucleotidice numite
palindroame
taie ADN dublu catenar nemetilat la resturile
de A sau C
Enzima Secvena recunoscut Sursa
BamH I 5`-G GATCC-3` Bacillus
amyloliquefaciens H
BglII 5`-A GATCT-3` Bacillus globigii
5`-CAG
5`-GTT
5`-GAT
5`-G
5`-A
5`-T

EcoR I 5`-G AATTC-3` Escherichia coli RY13

EcoRV 5`-GAT ATC-3` Escherichia coli B946

Hind III 5`-A AGCTT-3` Haemophilus influenzae

Rd
Taq I 5`-T CGA-3` Thermus aquaticus
 5`---AAGCTT---3` 5`---TGGCCA---3` 5`---GAGCTC---3`
3`---TTCGAA---5` 3`---ACCGGT---5` 3`---CTCGAG---5`

Hind III Bal I Sst I

5`---A 5`
AGCTT---3` 5`---TGG CCA---3` 5`---GAGCT3` C---3`
3`---TTCGA 5` A ---5` 3`---ACC GGT---5` 3`---C 3`TCGAG ---5`
 Formare ADN recombinant
ADN1 ADN2

5`---GAATTC---3` 5` GAATTC 3`
3`---CTTAAG---5`
3` CTTAAG 5`

EcoRI EcoRI

5`---G AATTC---3` 5` G AATTC 3`

3`---CTTAA G---5` 3` CTTAA G 5`

Renaturarea fragmentelor ADN si

sudarea lor de ctre ADN-ligaz

5`---GAATTC 3` 5` GAATTC---3`
3`---CTTAAG 5` 3` CTTAAG---5`

Molecule de ADN recombinant

Separarea fragmentelor ADN rezultate
din aciunea enzimelor de restricie
Electroforaza pe gel de poliacrilamid
pentru fragmente <500 perechi de baze

Electroforaza pe gel de agaroz pentru

fragmentele cu dimensiuni mai mari

Hri de restricie
 Cursul 12

Distribuia i dimensiunile ADN

Structura superhelicoidal a ADN
Replicare
Mutaii
Repararea mutaiilor
 Distribuia i dimensiunile ADN

ADN are form liniar sau circular

Moleculele ADN dintr-o celul alctuiesc

cromozomii acelei celule.

 Ce sunt genele ?

secvene nucleotidice care conin informaia cu

privire la sinteza unui singur lan polipeptidic
sau a unei singure molecule de ARNr sau ARNt

Genom = totalitatea genelor din cromozomii

unei celule.
 Dimensiunile ADN
La procariote,
ADN circular = un cromozom cu 4 x 106 p.b.

E. coli
ADN ~ 1,6 mm
diametrul celulei ~ 2 m
La om: cel mai scurt cromozom 34 x 106 p.b.

cel mai lung 263 x 106

Lungimea moleculelor ADN dintr-o singur celul uman

este de ~ 2 m
 Distribuie ADN
La procariote:
-ADN cromozomial

Plasmide (ADN extracromozomial, circular)

-molecule mici care trec uor prin membrana celulei gazd
-conin o cantitate redus de informaie genetic
-conin gene care specific proteine, ce confer bacteriei
rezistent la antibiotice
-se autoreplic extrem de rapid i autonom fa de ADN
cromozomial.
 La eucariote
ADN se afl n nucleu.

1% din ADN celular total se afl n mitocondrii i este

circular

5-10% din ADN este codificator pentru proteine i ARN

Genele sunt formate din exoni i introni (discontinuitatea

genelor); excepie histone i interferon
 Dup gradul de repetare al secvenelor nucleotidice:

60% din ADN celular sunt secvene ADN nerepetitive, unice;

codific proteine

20% din ADN sunt secvene cu grad mediu de repetare

(zecisute copii/celul); codific ARNr, ARNt, histone

10% din ADN cu grad foarte mare de repetare (mii de

copii/celul); se afl n centromere i telomere;
au rol structural n cromozomi
 Structura superhelicoidal a ADN
Suprarsucirea moleculei ADN n jurul
axei proprii

Suprarsuciri Suprarsuciri
spre stnga spre dreapta
(superhelix (superhelix
negativ) pozitiv)

Helix circular normal

 Desrsucirea Legare
unei spire capete

ADN circular cu
suprarsucire pozitiv
spre dreapta

ADN normal ADN partial desrsucit

 Axa de suprarsucire

Axa de suprarsucire
 Topoizomerazele
Topoizomeraza I, nu necesit ATP

Topoizomeraza I Topoizomeraza I Topoizomeraza I

Tyr
Tyr Tyr
5` O
5` O
OH P Enzima P
P P OH
OH 3`
Incizie si legare 3` Rotirea Disocierea
la enzim captului 3` enzimei
 Giraza (Topoizomeraza II)
Necesit ATP i face incizii n ambele
catene; introduce suprarsuciri negative

Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3

ADN suprarsucit
 Topoizomerazele I i II menin n celulele vii un
grad potrivit de superhelicitate negativ.

antibiotice care inhib ADN-giraza suprim

creterea i dezvoltarea bacterian:
acid nalidixic (negram)

derivaii si fluorurai (norfloxacin, ciprofloxacin),

 Cromozomii eucariotelor
Cromatina (cromozomii interfazici)=material amorf prezent n nucleu n
interfaz; conine ADN, proteine, ARN

Cromozomii sunt complexe ADN-proteine rezultate prin condensarea

cromatinei n timpul mitozei
Fiecare cromozom conine o molecul ADN liniar

Nr. Cromozomilor variaz de la o specie la alta (celulele somatice umane conin

46 cromozomi; 23 perechi)
 Histonele = proteine bazice
interacioneaz ionic cu anionii fosfat din
ADN
 Sunt 5 tipuri de histone
Histone bogate n lizin: H 2 A i H 2B
Histone bogate n arginin: H 3 i H 4
care intr n structura nucleozomului

Histone de legtur H1 care leag

nucleozomii ntre ei.
 Nucleozomii = unitatea de baz a
cromatinei
grad de compactare pentru ADN egal cu 7
Cilindru: 11x11x5,5 nm
140 pb se rsucesc de 2 ori n jurul octamerului histonic

Miezul nucleozomului
ADN de (H2A, H2B, H3, H4)2
legtur

ADN
Histona H1
Solenoizii asigur o scurtare de 40
de ori a formei B a ADN
 Protein nuclear Cromozom

Fibra de 30 nm

ADN Octamerul histonic

Histone + ADN

Histona H1 ADN
 Caracteristicile structurale ale ARN

Structura primar: H3PO4 -riboz, A,G,U,C

se leag covalent ribonucleozidtrisfosfai
Structura secundar
ARN este monocatenar cu poriuni bicatenare

Bucl cu baze
nemperechiate

Segment cu baze
complementare

Coninutul n A al ARN este diferit de cel n U i cel de G diferit de

cel n C
 Rolurile diferitelor tipuri de ARN
 ARNr -caracteristici structurale

conine zone dublu catenare i monocatenare

-este heterogen ca form i mrime.

-la procariote, ARNr : 23S, 16S i 5S
la eucariote, ARNr : 28S, 18S, 5,8S i 5S
ARNr

-este tipul de ARN cel mai stabil metabolic

-reprezint ~80% din ARN celular total.

 Ribozomii
ARNr = componenta catalitic a ribozomilor

Ribozomii = complexe ribonucleoproteice

ARNr + proteine

-proteinele:

au roluri catalitice sau

sunt implicate n recunoaterea i legarea ARNm i

aminoacil~ARNt la ribozomi
 Rolul ribozomilor
Ribozomii constituie sediul biosintezei proteinelor

Ribozomii permit conlucrarea ARNm, ARNt i ARNr, n vederea sintezei proteinelor.

 Conin trei situsuri:
-situsul aminoacid, care leag ARNt purttor al unui
aminoacid;
-situsul peptid, care leag ARNt purttor al unui lan
polipeptidic;
-situsul de eliminare de pe care este eliberat ARNt
liber.

Ribozom 70 S
 ARNt
E. Coli conine ~75 tipuri de ARNt
Reprezint ~ 15% din masa ARN celular total

Structura ARNt (solubil sau adaptor)

conine ntre 75 i 90 ribonucleotide;
raportul A+G/U+C este apropiat de 1;
prezint o conformaie n foaie de trifoi
are cel mai mare coninut de baze minore
(baze azotate modificate structural prin: metilri,
tiolri, hidrogenri, dup sinteza ARNt)
a) 3` b) 5`
Situs de CCA Brat T C 3`
legare aminoacid

5`

Perechi de baze
complementare Brat T C
Bratul DHU
Bratul
DHU

Bratul variabil
Bucla Bratul anticodon
anticodon

Anticodon
 O O O
H3C
NH NH HN NH

N O N O O
HO H2 C HO H2 C HO H2 C
O O O

OH OH OH OH OH OH
Dihidrouridin Ribotimidin Pseudouridin
(DHU) (T)
S O
NH N
NH

N O N N
HO H2 C HO H2 C
O O

HO OH OH OH
4-Tiouridin Inozin
 Funciile ARNt
Leag aminoacizii specifici, activai, prezeni

n citosol, la restul adenilic din secvena CCA i

i transport, la ribozomi, sub forma

complexelor aminoacil~ARNt
 Adaptarea aa transportat n dreptul codonului de

pe ARNm prin

recunoaterea codon-anticodon,

pe baza complementaritii bazelor

 3` A ~ aa1 3` A ~ aa2
C C
C C
5` 5`

Anticodon 3` C C G 5` Anticodon 3` A G U 5`
GGC UCA
ARNm
5` Codon 1 Codon 2 3`
 ARNm
Structur
-este monocatenar, liniar, de lungime variabil;
-este sintetizat prin transcrierea catenei matri sau template
(necodificatoare).

-ARNm conine informaia n limbaj nucleotidic.

ADN 5` - G C A T T A T G C - 3`
3` - C G T A A T A C G - 5`

ARN 5` G C A U U A U G C 3`

-informaia depozitat n ARNm sub forma tripletelor de nucleotide numite

codoni este decodificat la nivelul ribozomilor.
 ARNm procariot
este poligenic sau policistronic;

ntre gena transcris, ARNm i protein exist o

relaie de colinearitate
 ARNm eucariot
este monogenic;
nu este relaie de colinearitate: gen-ARNm-polipeptid

gena pentru sinteza ARNm cuprinde exoni (expressed regions) i

introni (intervening sequences);

ARNm matur care trec n citoplasm este prelucrat prin excizia

intronilor;

ARNm eucariot are o via de ordinul orelor, n timp ce ARNm

bacterian are o via foarte scurt (2-3 minute)
 ARN nuclear de mici dimensiuni
(small nuclear RNA)
Este bogat n uridin (U1, U2, U4, U5, U6).

se afl n nucleu, citosol i mitocondrie

prin asociere cu proteine, genereaz ribonucleoproteine

(small nuclear ribonucleoproteins) sau snRNP
( denumite snurps), cu rol n:
-excizia intronilor din ARNm transcript primar;
-controlul traducerii.