CERCETĂRI EPIDEMIOLOGICE ŞI

IMUNOLOGICE
ÎN LEUCOZA ENZOOTICĂ BOVINĂ

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: DOCTORAND:

Prof. Dr. EMIL TÎRZIU CĂTĂLINA CENUŞE
 SCOPUL ŞI MOTIVAŢIA CERCETĂRILOR

• Leucoza enzootică bovină - se manifestă prin proliferarea

neoplazică a celulelor sistemului limfatic şi mai rar a celui
reticulohistiocitar şi medular

• Bovinele se pot infecta la orice vârstă

• Majoritatea infecţiilor sunt subclinice

• Deşi programul de eradicare a leucozei enzootice bovine prin

sacrificarea bovinelor infectate este în plină desfăşurare, numărul
cazurilor pozitive este în continuă creştere

• Lucrarea de cercetare propusă răspunde atât unor cerinţe

teoretice, cu aplicaţii directe în domeniul imunologiei
fundamentale cât şi unor cerinţe practice, precum şi corelaţiile
existente între acestea.
 Obiectivele cercetării

• 1. Efectuarea unor studii epidemiologice în judeţul Timiş pentru a

stabili incidenţa LEB în efectivele de bovine existente, consecutiv
aplicării metodelor de combatere a bolii.

• 2. Cercetări privind restructurările imunologice (umorale şi

celulare, specifice şi nespecifice) şi biochimice induse de virusul
leucozei bovine.

• 3. Investigaţii privind valoarea comparativă a tehnicilor utilizate în

diagnosticul leucozei bovine.

• 4. Compararea valorilor obţinute la examenele serologice cu cele

constatate la examenele hematologice şi histopatologice efectuate
în diagnosticul leucozei enzootice bovine.
 PLAN DE ACTIVITATE
Anul Obiective Activitati

2008/2009 Investigaţii -culegerea de date date privind efectivul de

epidemiologice privind bovine existent la începutul cercetării;
leucoza enzotică bovina - recoltarea de probe şi examinarea acestora în
în judeţul Timiş cadrul LSVJ;
- incidenţa, prevalenţa şi prevalenţa instantanee
a cazurilor pozitive.

2009/2010 Restructurari - recoltarea de probe în vederea efectuării

imunologice şi examenelor hematologice şi histopatologice;
biochimice induse de - evidenţierea morfogenezei virale şi dinamicii
virusul leucozei enzotice de producţie a virusului în celulele infectate cu
bovine virusul leucozei enzotice bovine;
- urmărirea dinamicii unor parametrii biochimici
şi imunologici în infecţia experimentală cu
virusul leucozei enzotice bovine.
2010/2011 Evaluarea metodelor de - recoltarea de probe în vederea efectuării
diagnostic imunologic în examenelor hematologice şi serologice;
leucoza enzotică bovină - stabilirea corelaţiei înte metodele de
diagnostic folosite.
 RAPOARTE DE CERCETARE

Nr. Denumirea raportului de Data

crt cercetare susţinerii
1 Etiopatogeneza şi caracterele Decembrie 2009
epizootologice în leucoza
enzootică bovină

2 Restucturări imunologice induse Martie 2010

de virusul leucozei enzotice bovine

3 Imunodiagnosticul în leucoza Iulie 2010

enzotică bovină.
 Metode de investigaţie:

• 1. Materiale:
– Probe de sânge respectiv ser recoltate de la bovine din judeţul Timiş,
prelevate conform „Programului de supraveghere, profilaxie şi combatere
a bolilor la animale, de prevenirea transmiterii de la animale la om şi de
protecţie a mediului”
– Probe de sânge, recoltat pe anticuagulant, în vederea efectuarii testelor
hematologice.
– Probe de organe şi ţesuturi prelevate de la animale în vederea
examenelor histopatologice.

• 2. Metode de investigaţie
– Examene hematologice pe frotiuri de sânge integral după coloraţia
panoptică.
– Teste de dublă imunodifuzie în gel de agar.
– Electroforeza proteinelor serice în gel de agaroză.
– Determinarea proteinei totale serice prin metoda Biuret.
– Determinarea concentraţiei imunoglobulinelor G serice prin imunodifuzie
radiala simpla.
– Monitorizarea efectorilor imuni nespecifici la animalele cu leucoză.
– Tehnica imunoenzimatica pentru cuantificarea sintezei de anticorpi.
 STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII

• Leucoza enzootică bovină (LEB) - boală infectocontagioasă produsă de

virusul leucozei enzootice bovine (VBL)
– afectează în mod natural bovinele şi bubalinele
– evoluţie predominant cronică - caracterizează prin proliferarea malignă a
limfocitelor în organele limfohematopoetice
• LEB este una din cele mai importante forme de manifestare a ”leucozelor”
fiind caracterizată drept o viroză oncogenă manifestată prin „hiperplazia
mezenchimului activ”
• Primul caz - descris în anul 1871
– vacă cu splenomegalie şi hipertrofia limfonodurilor
– descrierile au fost facute iniţial pe cazuri apărute în Germania
– în România boala a fost adusă cu primele animale importate din
Danemarca, fosta Uniune Sovietică, Germania şi Israel
• Incidenţa maximă - înregistrată în 1985 fiind declarate 795 de focare
în sectoarele IAS, CAP, în timp ce sectorul gospodăria populaţiei era
idemn
• Răspândire şi importanţă economică

– cele mai multe cazuri de îmbolnăviri s-au înregistrat în ţările riverane cu

Marea Baltică: Danemarca, Suedia, Germania, Polonia, Lituania, Letonia,
Estonia şi Finlanda
– boala a mai fost descrisă şi într-o serie de alte ţări de pe alte continente
cum sunt: America de Nord, America de Sud, Australia, Asia, Africa
– pagube importante datorate:
• scăderii procentului de fecunditate;
• avorturilor şi instalării infecundităţii la animalele bolnave;
• diminuării producţiei de lapte cu 3-10%;
• reformarii timpurii
• vacile cu limfocitoză persistentă sunt mai puţin capabile să se apere
de unele infecţii secundare
• pierderile prin mortalitate sau ca urmare a deprecierii carcaselor
• susţinerea programelor de asanare şi combatere
• Agentul etiologic

• Virus ce face parte din: Familia Retroviridae, subfamilia Orthoretrovirinae,

genul Deltaretrovirus.
• Particula virală este alcătuită din ARN monocatenar, nucleoproteina p12,
proteina capsidală p24, glicoproteina transmembranară gp30, glicoproteina
de anvelopă (pericapsidă) gp51 şi câteva enzime, inclusiv revers-
transcriptaza
• Maturarea virionilor se produce la nivelul membranei celulare prin
înmugurire
• Are capacitatea de a se transmite pe cale verticală sub forma de ARN
integrat în genomul diferitelor tipuri de celule
• VLB nu este citopatogen, dar induce transformarea celulelor şi este pus în
libertate în spaţiul extracelular în permanenţa fără a distruge celula gazdă

• Nu prezintă activitate hemaglutinantă şi nu posedă neuraminidază

• Patogeneza

• În leucoza enzootică bovină (LEB) mecanismul patogenetic nu este pe deplin

lămurit.
• Virusul pătruns în organism determină o infecţie persistentă a unor
subpopulaţii de limfocite B
• Starea de latenţă poate persista o perioadă foarte lungă de timp.
• Declanşarea procesului malign determină alterarea structurii citomorfologice
a celulelor
– La suprafaţa acestora,
– La nivelul citoplasmei
– Nucleului
• modificări ale structurii citogenetice prin apariţia la nivelul
cromozomilor a unor mutaţii ireversibile precum
• modificări citochimice,
• bioenergetice
• citoenzimatice
• 10% din metastaze se localizează la nivelul limfonodurilor regionale

• Rareori metastazele se localizează în musculatură scheletică sau cardiacă

• Proteina de la nivelul anvelopei virale are capacitatea de a determina
transformarea celulei infectate
• Virusul este prezent în limfocitele din sângele periferic şi în celulele tumorale
sub formă de provirus integrat în ADN-ul celulelor infectate şi în fracţiunile
celulare a diverselor fluide corporale
• Transmiterea naturală depinde de transferul celulelor infectate
• Transmiterea artificială survine în special prin intermediul acelor contaminate
cu sânge, a echipamentului chirurgical
• Transmiterea laterală este de obicei lentă în absenţa acestor factori
contributivi

• Tablou clinic
• Infecţiile sunt de obicei subclinice
• Tumorile (limfosarcoamele) sunt observate cel mai frecvent după vârsta de
trei ani, la 0,1-10% din cazuri
• limfocitoza permanentă apare la doar 30-70% din vacile infectate
• Semnele clinice depind de sediul proceselor tumorale
– includ probleme digestive,
– inapetanţă,
– pierderea în greutate,
– înrăutăţirea stării generale,
– uneori chiar tulburări neurologice
– limfonodulii superficiali pot prezenta o mărire în volum evidentă şi pot fi
percepuţi cu uşurinţă prin travesul pielii sau la examenul transrectal.
– scade producţia de lapte şi scade şi conţinutul de grasime al acestuia
– persistentă non-neoplazică (PL) la aproximativ 30% dintre animalele
infectate şi o proliferare a limfocitelor B
• Diagnosticul

• Stabilirea diagnosticului în LEB se bazează pe coroborarea datelor obţinute

prin:
– Ancheta epidemiologică
– Examenul clinic
– Examenul morfopatologic
– Examenul de laborator
• examenul hematologic;
• examene serologice (testul de imunodifuzie în gel de agar, ELISA,
imunofluorescenţa, reacţia de fixare a complementului, testul de
radioimunodozare, testul de neutralizare virală);
• examene imunocitologice (testul de inhibare a policariocitozei, testul
de rozetare);
• examene de identificare a virusului (microscopia electronică,
imunoelectromicroscopia, reacţia în lanţ a polimerazei);
• examene citogenetice - bioproba pe miel.
• Examenul hematologic - permite punerea în evidenţă a modificărilor
cantitative şi calitative a elementelor figurate, îndeosebi a celor albe din
sânge .
• Această metodă impune efectuarea de operaţiuni ordonate astfel:
– determinarea numărului de leucocite;
– stabilirea formulei leucocitare ;
– urmărirea aspectelor citomorfologice pe frotiu;
– determinarea numărului absolut de limfocite;
– efectuarea examenului citomorfologic pe amprente din limfoganglioni,
splină şi frotiuri din măduva osoasă hematogenă;
– efectuarea testelor citochimice şi citoenzimatice pentru caracterizarea
celulelor proliferate malign.
• Bazaţi pe modificarea constantă a indicatorilor hematologici, Götze şi col., a
propus prima „cheie" de diagnostic, clasificând animalele în trei categorii în
funcţie de numărul de leucocite/mm3 şi de procentul de limfocite în frotiu.
– folosită şi la ora actuală este cea a C.E.E., care permite o mai mare largheţe în
stabilirea numărului de limfocite absolute în raport cu vârsta.
• Examenul hematologic nu depistează toate animalele infectate cu VLB sau
bolnave
• Examenul serologic - diagnosticul de rutină al infecţiei cu VLB se bazează pe
reacţia antigen-anticorp, respectiv pe depistarea anticorpilor specifici
– Virusul leucozei enzootice bovine exercită acţiune antigenică asupra
organismului declanşând formarea de anticorpi specificifici
• Testele serologice au avantajul precocităţii şi specificităţii în depistarea
animalelor, atât a celor bolnave de LEB cât şi a celor care au venit în contact
cu virusul.
• Testele serologice, curent utilizate în diagnosticul LEB sunt ID şi ELISA
– Testul de imunodifuzie în gel de agar
• foarte sensibil şi recomandat ca metodologie de diagnostic în eradicarea LEB
• este eficient în stabilirea diagnosticului de efectiv contaminat şi mai puţin în
cazul diagnosticului de individ infectat
• ID se pot folosi probe duble de colostru şi ser sanguin recoltate de la
vaci la fătare, folosirea colostrului permite depistarea în plus cu 30%
animale pozitive faţă de folosirea serului
• ID nu detectează animalele infectate cu un titru scăzut de anticorpi
• Testul imunoenzimatic (ELISA) - tehnicile imunoenzimatice au început să se
dezvolte începând cu anul 1966, odată cu experienţele lui Avrameas şi Uriel, care au
avut ideea marcării antigenelor şi anticorpilor cu enzime pentru a le utiliza în tehnici
serologice convenţionale
– poate fi utilizat pe probe de sânge, ser sanguin şi lapte integral
– este foarte economic, util şi practic
– se evită manopera laborioasă de prelevare a probelor de sânge, prin recoltarea
unei singure picături din produs pe substrat solid, ca hârtie absorbantă

• Imunofluorescenţa (IF) - utilizarea acestei tehnici în diagnosticul de laborator

a devenit posibilă după ce biochimiştii au explicat mecanismul fluorescenţei, au fost
enunţate principiile fluorocromării şi a fost construit microscopul cu fluorescenţă
După modalităţile de colorare se deosebesc tehnicile directă şi indirectă
– constituie deci un procedeu complementar în diagnosticul de laborator al
leucozei enzootice bovine, cu scopul precizării unui diagnostic individual la
animale cu reacţii slab pozitive şi cu valoare economică ridicată

• Reacţia de fixare a complementului (RFC) şi Testul de

radioimunodozare sunt folosite pentru identificarea prezenţei VLB
 Profilaxia

Trebuie să cuprindă măsuri vizând protejarea efectivelor indemne prin

asigurarea măsurilor generale profilactice acestea constau :
-evidenţa strictă a animalelor
- asigurarea împrejmuirii fermelor
-controlul accesului tuturor persoanelor şi mijloacelor de transport, avizarea
mişcărilor de animale
- evitarea interferenţelor pe păşune, la sursele de adăpare cu apă etc., cu
bovine a căror situaţie epizootologică nu este cunoscută
-efectuarea reproducţiei numai prin însămânţări artificiale sau folosirea taurilor
cu certificat care să ateste starea de sănătate
-executarea depistărilor obligatorii şi a dezinfecţiilor profilactice

Un alt obiectiv în profilaxia LEB este obţinerea de animale transgenice

rezistente, prin vizarea expresiei moleculare pentru conferirea rezistenţei la
VLB
 • Combaterea
• Este diferită de la o ţară la alta, experimentându-se metode care s-au dovedit
eficace, cum ar fi: eliminarea în totalitate a efectivelor infectate; eliminarea rapidă
numai a animalelor infectate; eliminarea treptată a animalelor infectate în funcţie de
exigenţele economice.
• În România, în funcţie de procentul animalelor bolnave sau suspecte, de intensitatea
evoluţiei bolii în efectiv şi de valoarea genetică a acestora, combaterea se realizează
prin asanare parţială sau totală
– Asanarea parţială, constă în eliminarea periodică numai prin tăiere în abator a cazurilor
depistate ca pozitive după ce au fost controlate la interval de trei luni prin ID sau şase luni
prin ELISA. După eliminarea animalelor reacţionate pozitiv, grajdurile se curăţă şi
dezinfectează riguros, impunându-se efectuarea de dezinfecţii locale iarna şi generale pe
perioada de vară
– Asanarea prin depopulare totală se face, ca ultimă măsură, atunci când gradul de infecţie
ajunge la proporţii mari de exprimare pentru formele leucemice şi tumorale, aspecte care
depreciază din punct de vedere calitativ efectivul contaminat. După depopulare se prevăd
de asemenea acţiuni de curăţenie mecanică şi dezinfecţii riguroase, în condiţiile prevăzute
de lege
• S-au experimentat şi alte variante de combatere cum ar fi transformarea
unor centre de izolare în ferme de asanare prin extracţie, prin formarea unui
nucleu de bovine potenţial sănătos consecutiv controlului sistemic prin ID,
completat în paralel cu ELISA