Efectul modificării oxidative asupra

proprietăților structurale și de spum

are ale proteinei de albuș

Coordonator: Luisa Pilan

Neagu Ionut-Marius
Master: CCSPA
Abstract

Oxidarea proteinei rezultă în modificarea structurală care îi afectează funcționalitățile. În acest

studiu, a fost selectat 2,2'- azobis (2-amidino-propan) dihidroclorid (AAPH) ca reprezentant al peroxidarii
lipidelor pentru a investiga efectul modificării oxidative asupra proprietăților structurale și de spumare a
proteinei de albuș. Incubarea proteinei de albuș cu AAPH a rezultat în modificări structurale, privind schimbul
de reacție între sulfidril-disulfid și o creștere în formarea di-tirozinei. Oxigenarea moderată a dus la expunerea
grupurilor hidrofobice de proteină de albuș, în vreme ce, oxigenarea excesiva a indus o scădere în
hidrofobicitatea de suprafață.
Distribuția moleculară a greutății și scanarea microscopiei electronilor a arătat că proteină de albuș
a suferit o agregare după oxidarea excesivă. De asemenea, după tratarea cu AAPH la 0.2 mm, abilitatea de
spumare a proteinei de albuș a crescut de la 80.6% la 85.3%. Tratamentul de oxidare excesivă (5 și 25 mmol/L
AAPH) a rezultat în abilitate de spumare intensificată, în vreme ce și-a redus stabilitatea de spumare. Acest
studio a sugerat că tratamentul cu oxidare are potențialul de a fi implementat pentru a modifica proprietățile de
spumare ale proteinei de albu
Introducere

Datorită proprietăților sale puternice de spumare, proteina de albuș este

folosită pe scară largă ca și agent porofor în industria alimentară pentru a îmbunătăți și
menține calitatea (textură și volumul) alimentelor aerate, cum ar fi torturile, prăjiturile,
cojile de deșert sau spumele de ciocolată.
Spumele și bulele joacă un rol foarte important în aceste produse alimentare
în termeni de structură și textură. În timpul procesării acestor produse, proteină de albuș
poate încapsula și reține aer, astfel creând volumul spumei. Prin urmare, îmbunătățirea
abilității de spumare a proteinei de albuș este semnificativă pentru ameliorarea calității
produselor alimentare ce au la bază proteină de albuș.
Introducere

Adsorbția proteinei la interfață aer-apa este cunoscută pentru rolul esențial

pe care îl joacă în formarea și stabilizarea alimentelor sisteme disperse ca spumă. Când
aerul vine în contact cu soluția din ou, proteină de ou poate adsorbi la interfață aer-apă și
suferi modificări conformaționale rapide pentru a forma pelicule coezive vascoelastice.
Starea conformațională a proteinei a afectat puternic adsorbția și reorganizarea stratului
de proteină de la interfața aer-apă.
Pentru unele proteine, moleculele dezvelite pot adsorbi cu mai multă ușurință
la suprafață de bule de aer, și astfel au prezentat funcționalitate de spumare sporită.
Cercetări anterioare au demonstrate că ovalbumină denaturată a posedat o putere de
spumare mai puternică decât ovalbumină native datorită flexibilității crescute și
hidrofobicitatii de suprafață. Astfel, o oarecare măsură de schimbare structurală ar putea
avea un impact benefic asupra formării și stabilizării de spumă în proteină de albuș.
Materiale și metode

Materiale
Au fost achiziționate ouă de găina de la piața locală. AAPH, 1-anilino-8-naft
alen-sulfonat(ANS), 5,5’ ditiobis (2-nitrobenzoat) (DTNB), standardele de proteine pentru
studierea distribuției masei moleculare (MW), incluzând ser bovin albumin (66,000 Da), a
nhidraza carbonica (29,000 Da) și aprotinina (6500 Da) au fost achiziționate de la Sigma-
Aldrich Co. LLC. (Shanghai, China).
Toate celelalte chimicale au fost de grad de agent reactiv
Oxidarea proteinei de albuș

Albușul a fost separate de gălbenuș și amestecat ușor folosind un amestecăto

r magnetic, pentru a nu produce spumă pentru o oră la 4 grade Celsius, producând albuș o
mogen. După această, albușul a fost liofilizat și menținut la -20 grade Celsius până la folo
sire (Kakalis & Regenstein, 1986).
Modificarea oxidative a proteinei de albuș a fost procesată în conformitate cu
metodă descrisă de Wu et al. (2009). Pentru o scurtă durată, dispersarea albușului (10 mg/
ml, suspendată în 0.01 mol/l, tampon de fosfat de sodium, ph 7.4) a fost amestecată cu o s
erie de concentrații de AAPH, iar apoi incubate prin agitarea continuă în aer la 37 grade C
elsius în întuneric pentru 24 de ore.
Concentrația finală a AAPH a fost zero (control), 0.04, 0.2, 1, 5, și 25 mm. R
eacția a fost oprită prin răcirea imediată a dispersiilor la 0-4 grade Celsius prin băi cu ghe
ață. După centrifugarea la 5000 g pentru o oră la 4 grade Celsius pentru a îndepărta mici c
antități de substanțe insolubile care au fost formate în timpul răcirii substanței, dispersiile
de proteine au fost dializate în apă deionizată la 4 grade Celsius pentru 72 de ore, pentru
a îndepărta AAPH residual iar apoi au fost uscate prin congelare și au fost stocate la -20 g
rade Celsius.
Determinarea formării di-tirozinei

Formarea ditirozinei a fost estimată prin metoda Morzel, Gatellier, Sayd, Re

nerre și Laville (2006). Cantități cântărite de probe uscare prin congelare (10 mg) au fost
dizolvate în 5 ml de soluție-tampon ionica puternică ) (20 mm de soluție-tampon de fosfat
la pH6 conținând 0.6 M KCI). Concentrația proteinei a fost estimată prin metodă Biuret (
Kakalis & Regenstein, 1986).
Conținutul ditirozinei a fost estimat prin măsurarea fluorescență la 420 nm d
upă excitarea la 325 nm, folosind un spectrometru de fluorescență Hitachi F4500. Fluores
cență corectată a fost obținută prin divizarea fluorescenței măsurate prin concentrarea prot
einelor. Rezultatele au fost exprimate în unități arbitrare.
Hidrofobicitatea de suprafață

Hidrofobicitatea proteinelor a fost determinată prin urmărea metodei Wang,

Chen, et. al, (2014), Wang, Tao, et al. (2014), cu mici modificări. Fiecare mostră a fost dil
uată în cinci concentrații între proteină de 0.0% și 0.1% (wt/wt) în 10 mm de soluție tamp
on de fosfat (ph 7.0). Apoi, au fost adăugate alicote (20 ul) ale ANS (8.0 mm în aceeași so
luție tampon) în 4 ml de soluții proteice.
Soluțiile au fost lăsate în întuneric pentru 3 minute și plasate în celulă unui s
pectrometru de fluorescență Hitachi F4500 (Tokyo, Japonia), iar intensitatea fluorescenței
a fost măsurată la 470 nm, folosind excitație la 390 nm, lățimea fantei 5nm. Soluții de cal
ibrare corespunzătoare soluției tampon au fost substrase pentru a corectă fluorescență de
fundal. Hidrofobicitatea a fost determinate conform metodei de pantă a lui Alizadeh-Pasd
ar și Li-Chan (2000).
Structurile secundare

Schimbările în structurile secundare ale proteinei de albuș au fost determinat

e folosind spectrofotometrul cu transformare în infraroșu Fourier (FTIR, Bruker, Germani
a). Mostrele de proteină au fost amestecate manual cu KBr în raport de 1:200 și măcinate
într-un mojar cu pistil.
Pudrele au fost presate în straturi subțiri sub o presiune de 4 tone. Scanările c
u infraroșu ale capacității de absorbție a radiațiilor au fost analizate într-o gamă de 4000-4
00 cm pentru schimbări în intensitate în eșantioanele representative, cu aerul că și mediu.
Spectrele au fost analizate cu pachetul software Omnic (versiunea 6.1a, Thermo Nicolet C
orp) și Peakfit v4.12 (SYSTAT Software inc.)
Distribuția moleculară

Distribuția moleculară a profilelor de proteină de albuș a fost estimate confor

m metodei descries de Liu et al. (2012). Pentru acest experiment s-a folosit un sistem de c
romatografie lichidă Waters 600 (Waters Co., Milford, MĂ, UȘĂ), echipat cu un detector
de raze UV 2487. Detectorul de UV a fost setat la 215 nm.
Coloană folosită a fost un ape bază de silice (TSK G3000SWXL, 300 x 6.5
mm, Tosoh Co., Tokyo, Japonia), în vreme ce fază mobile consistând în soluție tamponată
cu fosfat a fost distribuită la o viteză de curgere de 0.5 ml/min și 20 ul de mostre au fost i
njectate în sistemul de cromatografie de performanță ridicată.
A fost obținută o curbă de calibrare a masei moleculare urmând standardele: ser bovin de
albumină (66.000 Da), anhidraza carbonica (29.000 Da) și aprotinina (6500 Da).
Concluzie

În această lucrare au fost investigate proprietățile structurale și de spumare al

e proteinei de albuș supuse tratamentului de oxidare. Rezultatele au indicat că tratamentul
de oxidare ar putea modifică aranjamentul molecular și interacțiunea proteinei de albuș pr
in schimbarea formatului de ditorizina, schimbului sulfhidril-disulfit, hidrofobicitatii de s
uprafața și structurilor secundare. În paralel, tratamentul de oxidare moderată (tratat cu 0.
2 mmol/L AAPH) ar putea spori proprietățile de spumare ale proteinei de albuș. Între timp
, tratamentul de oxidare excesiva (25 mmol/L AAPH) a rezultat într-o agregare mai mare,
oxidarea proteica în acest stadiu ar crește abilitatea de spumare a proteinei de albuș, în vre
me ce i-ar scădea stabilitatea spumării. Aceste rezultate au sugerat că tratamentul de oxida
re ar putea fi o abordare utilă pentru a modifică abilitățile de spumare ale proteinei de alb
uș.