TEHNICA

IMUNOENZIMATICA
 CE ESTE TEHNICA
IMUNOENZIMATICA?
 ELISA=Enzyme-linked Immunosorbent
Assay
 Metoda de detectare a unor molecule
(proteine, carbohidrati, etc.) cu ajutorul
complexelor antigen-anticorp conjugate cu o
enzima
 Foarte sensibila (pg/ml)
 Cantitativa sau calitativa
 Utilizeaza anticorpi monoclonali si enzime
PRODUCEREA ANTICORPILOR
MONOCLONALI
Antigen

Fuzionarea
celulelor 
HIBRIDOM Mielom

Plasmocite
producatoare de Ac Testarea clonelor

Cultivarea
hibridoamelor

Hibridoamele se separa Clonele

si se cultiva dorite se
cultiva sau
se
Mentinerea congeleaza
hibridoamelor in
soareci
Anticorpii monoclonali
sunt purificati
 ENZIMELE
 Enzime=catalizatori biochimici, compusi care
maresc viteza reactiilor chimice ce se
desfasoara in sistemele biologice, fara sa se
consume in cursul lor
 Intensitatea reactiei ~ cantitatea de enzima

Enzime utilizate:
 Peroxidaza
 Fosfataza alcalina
 Glucozoxidaza
 G6PH
 ENZIMELE
 Substraturi: substante cromogene, care
formeaza produsi de reactie colorati
(cromofore)
 Enzima + substrat  cromofor  citire la
spectrofotometru
 PROBE BIOLOGICE
 Ser
 Plasma
 Urina
 Scaun
 Lichid sinovial

LCR
 Lichid de lavaj bronsic
 PLACA PENTRU ELISA
 96 godeuri

Plastic pe care adera usor proteinele
 TIPURI DE ELISA
 ELISA necompetitiva “sandwich”

 ELISA competititiva

 ELISA indirecta (dozarea Ac)

 ELISA “SANDWICH”
 Ag trebuie sa prezinte ≥2 epitopi (identici sau
diferiti)

Ac primar (Ac1):
 Imobilizat in faza solida in godeurile placii
 Nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2):
 Marcat enzimatic
 ELISA “SANDWICH”
1. Se pipeteaza proba (cu Ag) in godeurile cu
Ac1 fixat
2. Se incubeaza  complexe Ag-Ac1
3. Se spala excesul de Ag (Ag liber)
4. Se pipeteaza Ac2 (marcat enzimatic)
5. Se incubeaza  complexe Ac1-Ag-Ac2
6. Se spala excesul de Ac2 (Ac2 liber)
7. Se adauga substratul  colorarea mediului
de reactie ~ cantitatea de Ag din proba
8. Se citeste la spectrofotometru
ELISA “SANDWICH”
 ELISA COMPETITIVA

Ac primar (Ac1):
 Specific pentru Ag de determinat
 Nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2):
 Specific pentru Fc al Ac1
 Marcat enzimatic
 ELISA COMPETITIVA
1. Se amesteca proba (cu Ag) cu o cantitate
cunoscuta de Ac1, in solutie
2. Se pipeteaza amestecul in godeurile cu Ag
fixat
3. 2 situatii:
 Exces de Ag
 Exces de Ac1
 ELISA COMPETITIVA
 Exces de Ag:
 Solutie (cu Ag) + Ac1  Ag-Ac1 + Ag libere
 Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)
 nu se formeaza complexe Ag-Ac1 fixe
 Se spala Ag-Ac1 libere si Ag libere
 Se pipeteaza Ac2 in godeuri  nu se formeaza
complexe Ag-Ac1 - Ac2 fixe
 Se spala Ac2 liber (tot Ac2, de fapt)
 Se adauga substratul  nu apare nicio reactie
 incolor
 ELISA COMPETITIVA

Exces de Ac1 :
 Solutie (cu Ag) + Ac1  Ag-Ac1 + Ac1 liberi
 Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)
 complexe Ag-Ac1 fixe
 Se spala Ag-Ac1 libere
 Se pipeteaza Ac2 in godeuri  complexe Ag-Ac1-
Ac2 fixe
 Se spala Ac2 liber
 Se adauga substratul  colorarea mediului de
reactie i.p. cantitatea de Ag din proba
 Se citeste la spectrofotometru
ELISA COMPETITIVA
 ELISA INDIRECTA
 Dozarea Ac
 Ag fixat in godeuri, specific Ac de determinat

Ac primar (Ac1):
 =Ac de determinat
 Nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2):
 Specific pentru Fc al Ac1
 Marcat enzimatic
 ELISA INDIRECTA

Se pipeteaza proba (cu Ac1) in godeurile cu
Ag fixat

Se incubeaza  complexe Ag-Ac1 fixe

Se spala Ac1 liber

Se pipeteaza Ac2

Se incubeaza  complexe Ag-Ac1-Ac2 fixe

Se spala Ac2 liber
 Se adauga substratul  colorarea mediului
de reactie ~ cantitatea de Ac1 din proba
 Se citeste la spectrofotometru
ELISA INDIRECTA
ELISA
 AVANTAJE
 Sensibila
 Reproductibila
 Cantitati mici de reactivi (ieftina)
 Determina si Ag, si Ac
 Automata (rapida)

Noniradianta
 APLICATII
 Hormoni
 Markeri tumorali
 Droguri, medicamente
 Citokine
 Ag virale (HIV!), bacteriene, parazitare

Ac (HIV!)
TEST HIV
TEST DE SARCINA