CURS 4 PROCESE BIOTEHNOLOGICE Elaborarea i industrializarea unei tehnologii de biosintez presupune parcurgerea mai multor faze: laborator, pilot,

industrial. Faza de laborator 1. Izolarea i selecia Izolarea din medii diferite (ap, sol, alte substrate) sau cumprarea tulpinii productoare Cultivarea pe medii adecvate Obinerea culturilor pure Omologarea culturilor Teste de identificare a compusului de interes (calitative i cantitative) 2. ntreinerea tulpinilor productoare Caracterizarea tulpinilor: criterii morfologice, biochimice, fiziologice, imunologice toxicologice. Tulpina caracterizat se nregistreaz ntr-o colecie de microorganisme sub un numr de identificare. Uneori se aplic procedee de selecie natural sau artificial (mutagenez) n scopul oinerii de tulpini nalt productoare. Pstrarea culturilor stoc la frigider. 3. Cultura de inocul Inocul este o cultur microbian n curs de multiplicare pe un substrat nutritiv corespunztor i n anumite condiii specifice de dezvoltare (pH, temperatur, agitare, aerare). Transvazarea culturii inocul n mediul de biosintez, n condiii aseptice, dup o perioad de dezvoltare bine stabilit pentru fiecare tip de microorganism. Faza de staie pilot Faza de biosintez propriu-zis se realizeaz n bioreactoare. n prealabil se realizeaz o sterilizare a instalaiei, a mediului de cultur, stabilite n laborator ca fiind optime. n faza de staie pilot, tehnologia elaborat n laborator este verificat i optimizat pe instalaii cu capacitate medie (pilot). Pe baza datelor obinute la nivel pilot se elaboreaz procesul tehnologic pilot, care va fi experimentat industrial i apoi se realizaez producia propriu-zis. Faza industrial Procesul tehnologic are loc n bioreactorul ales conform scopului urmrit. Toi prametri optimizai n fazele de laborator i pilot sunt urmrii n faza induistrial, ns la alt scar. Etapele procesului biotehnologic 1. Treapta de prelucrare fizic

 Operaiile de pregtire i sterilizare a mediului de cultur Sterilizarea utilajelor Sterilizarea aerului tehnologic 2. Treapta de prelucrare biochimic Biosinteza propriu-zis Obinerea produsului final 3. Treapta de prelucrare fizico-chimic Separarea produsului finit Condiionarea produsului n biopreparate BIOREACTOARE Se realizeaz procesul de biosintez. Sunt controlate n permanen condiiile. de cultur: nutrieni, pH, temperatur, aerare etc. Se determin consumul materiilor prime i biosinteza produsului finit. Considerente importante n alegerea bioreactoarelor: Care este cel mai bun reactor pentru scopul propus Cum se calculeaz mrimea i volumul interior util Care sunt condiiile optime de operare, astfel nct bioreactorul s realizeze performanele dorite.

Concepte de baz n operarea bioreactoarelor clasificarea bioreactoarelor Exist 2 sisteme majore de cultivare a microorganismelor: n sistem submers n culturi de suprafa

Sistemul submers Mediul de cultur este lichid, agitat i aerat. Procesul poate fi: discontinuu, semicontinuu, continuu Culturile de suprafa Cultivarea microorganismelor se realizez la suprafaa unui mediu solid sau semisolid. Dac se ine seama de complexitatea fazelor, bioreactoarele se clasific n: 1. Omogene (L-L) 2. Heterogene (L-S), (G-L-S) Unde: L-L: monofazice L-S: bifazice G-L-S: multifazice

n sistem omogen Compoziia mediului de biosintez este uniform pe tot parcursul procesului. n orice moment microorganismele din diferite zone ale sistemului au aceeai stare fiziologic (acelai stadiu de dezvoltare). n sistem heterogen n mediul de cultur exist gradiente de celule sau de substrat. Microorganismele din diferite zone sunt expuse la diferite condiii de mediu i, n consecin, vor avea diferite stri fiziologice (stadii diferite de dezvoltare). Operarea n sistem discontinuu, n arje (sistem batch) La nceput, proliferarea microorganismelor are loc n condiii nelimitative Dup atingerea densitii maxime n celule are loc proliferarea n condiii limitative de substrat: unul din dintre nutrieni (sursa de carbon, azot) sau oxigen. Pentru oxigen exist posibilitatea aprovizionrii continue, astfel nct concentraia s nu scad sub valoarea critic specific microorganismului. Operarea n sistem semicontinuu (extended culture operation) Reactorul este astfel operat nct concentraia substratului limitativ este pstrat constant prin aprovizionarea continu (fed batch). Operarea n sistem continuu (continuous operation) Presupune alimentarea continu cu nutrieni i n acelai timp evacuarea din reactor a unei cantiti echivalente de mediu de cultur. Se poate realiza n 2 tipuri de reactoare: - Reactorul cu recirculaie (grad mare de omogenitate, amestecare perfect) - Rectorul cu deplasare (o curgere tip piston). n afara criteriilor deja enumerate exist i alte crieterii de clasificare a bioreactoarelor: Dup regimul termic: Izoterm: au loc schimburi de cldur cu exteriorul, temperatura rmnnd constant. Adiabat: nu au loc schimburi de cldur cu exteriorul. Neizoterm-neadiabat: au loc schimburi de cldur cu exteriorul, temperatura n reactor nu este constant. Programat: se modific regimul termic, astfel nct s se ating un optim dorit. Autoterm: reactorul se susine singur din punct de vedere termic. Reaciile chimice Exoterme (cu degajare de cldur): reaciile biologice Endoterme (cu absorbie de cldur din mediul nconjurtor). R. exoterme pot fi conduse n oricare din regimurile termice specificate R. endoterme nu pot fi operate autonom.

Caracterizarea bioreactoarelor 1. Bioreactorul discontinuu Se caracterizeaz prin amestecarea ideal a mediului de cultur i prin operarea n arje. Se ncarc componentele mediului, iar dup un anumit timp determinat, se descarc mediul ce conine produii de biosintez.

2. Bioreactorul continuu Se adaug continuu n reactor un volum determinat de mediu proaspt Se elimin continuu un volum egal de biomas, astfel nct volumul biomasei din bioreactor s rmn constant. Se prelungete indefinit faza de cretere exponenial. Trebuie avut n vedere meninerea cantitii de biomas la valorile optime.

Modificarea concentraiei celulelor n reactor poate fi fcut n 2 moduri: Modificarea vitezei specifice de cretere a celulelor este caracteristic pentru un chemostat. Modificarea vitezei de diluie a mediului este caracteristic pentru un turbidistat. Chemostatul Tehnica cultivrii const n reglarea concentraiei biomasei, prin intermediul concentraiei substratului (care este limitativ) Substrat alimentat + Substrat existent = Substrat consumat + Substrat ieit + Substrat rmas La diluii mici (timpi de staionare mari) concentraia de biomas de la ieire este practic insensibil la variaia diluiei (critic). La diluii mari, concentraia de biomas scade accentuat cu creterea diluiei, datorit duratelor de staionare mici, celulele nu se pot multiplica i doar o mic cantitate de substrat este consumat. Pe msur ce concentraia substratului limitativ se mrete, crete i concentraia de biomas din reactor.

Turbidistatul n cazul creterii celulelor n exces de neutrieni, se poate realiza reglarea procesului pe principiul turbidistatului, care permite folosirea unor diluii apropiate de diluia critic. Msurarea densitii celulare este realizat prin intermediul densitii optice (turbiditii) i se regleaz prin modificarea debitelor de alimentare (evacuare), deci a diluiei.

Tubidistatul ofer posibilitatea urmririi comportrii culturii n prezena unui exces de nutrieni. Operarea la diluii apropiate de diluia critic permite maximizarea productivitii. Acest sistem nu asigur, ns, suficient stabilitate fazei staionare, fiind necesare modificri mari ale debitelor pentru a obine meninerea concentraiei.

Bioreactorul cu recirculare extern Bioreactorul n care mediul de biosintez de la ieirea din bioreactor este supus unei operaii de separare (prin centrifugare, filtrare, sedimentare), iar concentratul coninnd biomasa se recircul parial n bioreactor. Bioreactorul ideal cu deplasare (curgere tip piston) Este un reactor tubular i prezint avantaje: Construcie simpl fr zone stagnante, ridicarea la scar industrial se realizeaz uor, fr riscuri. Se poate regla durata de staionare a celulelor n bioreactor, a.. conversia substratului s fie mai mare, concentraia produsului finit mai mare. Spumarea mai mic Distrugerea pereilor celulelor este mai mic.

Configuraia bioreactoarelor Tipuri constructive Criterii de alegere: Configuraia (cu agitare mecanic, sau un vas cu aerare fr agitare). Mrimea reactorului pentru rentabilitate. Condiiile bioprocesului (temperatur, pH, etc). Sistemul de operare (continuu sau discontinuu). Dup natura proceselor biotehnologice Reactoare biologice (cu biomas) -Pentru procese anaerobe sau aerobe Reactoare biochimice (procese enzimatice). -cu enzime libere,imobilizate i cu faz solid. Reactoare pentru procese aerobe Dup modul de introducere a energiei necesare amestecrii fazei lichide (substrat i microorganisme) i dispersrii fazei gazoase (aer) reactoarele aerobe pot fi: Cu amestecare mecanic Cu pomp de recirculare Cu aer comprimat

Bioreactoare cu agitare mecanic: a-cu motorul aejat la baza vasului, b-cu motorul la baza vasului i cu draft interior, c-cu agitator de turaie mare Bioreactoare pentru cultivare n sistem submers Bioreactoare cu mediu lichid, agitat i aerat.

1. Bioreactoare cu agitare mecanic Cele mai utilizate. Amestecarea i dispersia bulelor de aer se asigur prin agitare mecanic. Doar 70-80% din volumul reactorului este umplut cu lichid, ceea ce permite degajarea bulelor n partea superioar, unde se instaleaz un sprgtor de spum. Este prevzut cu un sistem de rcire (serpentin intern, manta de rcire etc).

Circulaia lichidului n bioreactor cu agitare mecanic cu agitator tip elice (stnga) i turbin deschis (dreapta)

2. Bioreactoare cu agitare mecanic i cu draft interior Circulaia lichidului poate fi modificat dac n interiorul bioreactorului se introduce un draft (cilindru metalic axial fr fund i capac). Circulaia lichidului n bioreactor cu draft complet imersat n lichidul de cultur (stnga) i cu revrsare (dreapta)

3. Bioreactoare cu aer comprimat 3.1 Bioreactoare tip coloan cu bule Nu exist sistem de agitare mecanic Agitarea se face prin barbotare de aer (consum energie mai puin). Se utilizeaz n industria berii, vinului, tratarea apelor reziduale. Sunt mai ieftin de realizat Transferul de mas i energie satisfctor. Bioreactor tip coloan cu bule

3.2. Bioreactoare air-lift Sunt preferate pentru culturile de celule vegetale, animale, celule imobilizate. Aerul este introdus la partea inferioar printr-un barbotor, urc la partea superioar, iar amestecarea se realizeaz nspre margini. Se poate interpune un cilindru n mijloc, iar barbotorul mpinge aerul spre cele dou margini amestecnd mediul, sau se poate introduce aerul doar dintr-o parte, iar mediul cade spre cealalt parte.

Bioreactoare air lift (a,b-cu o singur regiune aerat, c-cu circulaie extern)

4. Bioreactoare cu dializ Motivele utilizrii membranelor de dializ: Sunt un mijloc eficient pentru ndeprtarea eficient a inhibitorilor sau a produselor toxice rezultate din fermentaie. Cultura microbian poate fi alimentat cu substrat prin membran. Se pot obine concentraii mari de microorganisme, deoarece substratul este separat de microorganism i nu l inhib.

Principiul dializei Dializa: procesul prin care o soluie trece printr-o membran semipermeabil de la o concentraie mai mare la o concentraie mai mic, pn este atins echilibrul.