Tehnici utilizate n biologia molecular Enzimele utilizate n biologia molecular Enzimele de restricie fac posibil manipularea de tip recopiere,

e, tiere, lipire a secvenelor acizilor nucleici. Acestea particip la fenomenul de restricie, adic un sistem de aprare al bacteriilor fa de bacteriofagi. Unele tulpini sau sue bacteriene conin enzime din familia endonucleaze i decupeaz ADN la nivelul secvenei recunoscut specific. Dac o colonie bacterian infectat de un bacteriofag sintetizeaz aceast enzim, i dac bacteriofagul posed n genom secvena recunoscut de enzimele de restricie a bacteriilor, acesta va fi incapabil s se multiplice i s lizeze bacteria.

 Ca urmare ADN-ul su va fi secionat n fragmente n care exist situsuri specifice genomului fagic. De ce ADN bacterian nu este distrus de aceste enzime? Exist 2 posibiliti: fie ADN bacterian nu conine secvene recunoscute de enzim, fie acesta este metilat la nivelul resturilor de A sau C de ctre metilaza bacterian ceea ce determin nerecunoaterea acestor secvene metilate de ctre enzimele de restricie. Numele de restricie vine de la faptul c exist o restricie a infeciei fagilor fa de anumite sue bacteriene care sintetizeaz endonucleaze, altele fiind lizate. Numele enzimei de restricie provine de la numele genului i speciei de la care au fost izolate.

 ADN polimeraza catalizeaz sinteza catenelor de ADN i au rol n replicare i n reparaia ADN. Ele necesit o matrice fa de care se sintetizeaz secvena complementar. Este necesar iniierea reaciei de ctre o amors, prin intermediul creia ADN polimeraza realizeaz elongaia prin adiia de precursori trinucleotidici dNTP. Enzimele particulare utilizate sunt: ADN pol I specific E. coli i fragmentul Klenow, ADN polimeraza fagilor T7 i T4 i ADN pol. termostabile. Transferaza terminal poate fi considerat o ADN pol. particular. Aceast enzim nu copie matricea dar adiioneaz nucleotide la extremitatea 3' a lanului de ADN.

 ADN polimeraza catalizeaz 3 tipuri de reacii: -activitatea de ADNpol propriu-zis necesit matrice ADN care este copiat prin extensie unei amorse. Polimeraza ncorporeaz nucleotide ncepnd la nivelul 3'OH a amorsei. -activitate exonucleazei 3'-5' in vitro este o activitate de reacie care are ca scop eliminarea tuturor bazelor adugate eronat n cursul sintezei lanului de ADN. Eliminarea bazelor eronate este urmat de ncorporarea bazei corecte cu ajutorul ADN polimerazei. Aceast activitate se exercit pe ADN simplu sau dublu catenar. - activitatea exonucleazei 5'-3', enzimele elimin nucleotidele de la 5' a ADN dublu catenar. Aceast activitate este utilizat n tehnica de marcaj prin translaia seciunii.

 ADN polimeraza I Aceast enzim a fost purificat la nceput din culturi bacteriene ale E. coli, exercit o activitate de ADN polimeraz, astfel c are dou activiti de exonucleaze. Activitatea exonucleazic 5'-3' a ADN pol I poate fi exercitat pe un hibrid ARN/ADN , ea este rezultatul deci a unei activiti de RNaz H intrinsec care const n eliminarea unui lan de ARN prin activitatea exonucleazei 5'-3'. Aceast proprietate a fost exploatat n reacia de revertranscripie pentru eliberarea primului lan de ADN sintetizat i va permite sinteza unuia secundar.

 El va avea rol de amors necesar i la sinteza celui de-al doilea lan complementar. n activitatea exonucleazei 5'-3' a ADN pol I are loc eliminarea unui grup fosfat n 5', care duce la imposibilitatea reaciei de elongaie. n consecin domeniul de aplicaie al acestei enzime este de a limita marcajul sondei prin translaia seciunii, aplicaie n care ea este utilizat n strns legtur cu DNaza I.

 Fragmentul Klenow se realizeaz printr-o proteoliz limitat a ADNpol I de la E.coli, enzim monomeric care genereaz dou fragmente, foarte mari. Ele au pierdut activitatea exonucleazic 5'-3' dar conserv activitatea exonucleazic 3'-5' i cea de ADNpolimeraz. Aplicaiile fragmentului Klenow: secvenierea dup metoda Sanger sinteza unui lan de ADN complementar marcare izotopic (32PdNTP) a extremitii 3' a ADN prin reacia de schimbare a nucleotidelor reci contra nucleotidelor marcate, catalizat prin activitate exonucleazic.

 ADN polimeraza bacteriofagului T4 i T7 catalizeaz transferul fosforului radioactiv 32P pe ATP. Astfel ATP este marcat cu 32P pe a treia grupare a fosfatului de pe extremitatea 5 a fragmentului de ADN. Tehnica este aplicat pentru obinerea oligonucleotidelor marcate care vor fi utilizate ca sonde pentru criblajul bncilor. T4 ADN polimeraza Aceast enzim a fost izolat la nceput din bacterioagul T4. ADN pol T4 i are o activitate exonucleazic 3'-5' foarte eficace pe ADN monocatenar i este de 200 de ori mai activ dect fragmentului Klenow de la E.coli

 T7 ADN polimeraza Aceast enzim a fost obinut prin izolarea ei de la bacteriofagul T7, dup infecia bacteriei E.coli cu fagul. Este caracterizat prin eficacitate de sintez, replicarea rapid a fagului n cursul ciclului de infecie. Ea posed n acelai timp o activitate exonucleazic 3'-5' puternic exprimat, de aproximativ de 1000 de ori mai mare dect a fragmentului Klenow. Aceast activitate important exonucleazic explic fidelitatea mare a T7 ADN pol. Aplicaii principale: marcarea ADN n 3' mutageneza dirijat

 T7 ADN pol modificat: secvenoza Tratamentul chimic al T7 ADNpol modific enzima diminund considerabil activitatea lor exonucleazic. Enzimele obinute secvenoza 1.0 i 2.0 sunt utilizate n reaciile de secvenializare de bun calitate. Prin genie genetic o versiune 2.0 a fost produs 100%, lipsit de activitate exonucleazic dotat cu o mare activitate specific mai puin sensibil la structura secundar ea este folosit la tehnica de secvenializare.

 Taq ADNpol i enzimele operante au fost izolate din Thermus aquaticus. Prezint particularitatea de a se dezvolta n izvoare calde la 80C. Este supus la temperaturi extreme. Este o ADN pol dependent. Posed de asemenea activitate exonucleazic 5'-3' dar este lipsit de funcii corectoare. Temperatura optim de funcionare de 70-75C. Originea sa i confer o stabilitate remarcabil la temperaturi nalte.

 Aceast termorezisten st la baza utilizrii sale n metode de amplificare genic precum PCR n timpul crora se efectueaz numeroase cicluri termice care presupun temperaturi de 90-95C. Alt avantaj hibridarea amorselor cu matricea se face la o temperatur mai mare ceea ce determin hibridarea specific. Un anumit numr de ADN pol termostabile au fost extrase din alte bacterii Archebacterii i Eubacterii. Fiecare are o particularitate i o utilizare specific.

 Revertranscriptaza Aceast enzim retrotranscrie ARNm n ADNc. RT permite remontarea fluxului gen, ARN, proteine i sinteza secvenei complementare unui ARN numit ADNc efectund aciune invers a transcripiei. Exist trei posibiliti: ncepnd de la amors sau primer specific ncepnd de la oligo dT care permite activarea RT de la coada poliA a unui ARNm ncepnd de la amorse aleatorii numite hexanucelotide . RT este o ADN polimeraz ARN dependent.

 ARN polimeraza T7 ARNpol este produs de bacteriofagul T7, are o specificitate crescut pentru situsul promotor al fagului T7 de iniiere a transcripiei. Este foarte utilizat pentru sinteza 5'-3' in vitro a ARN obinnd sonde ARN i poate fi utilizat pentru secvenializarea ADN clonat ntr-un vector care conine secvena promotoare T7. Aplicaii: sinteza ARN pornind de la ADN pentru obinerea de sonde. SP6 ARNpolimeraza Spre deosebire de cealalt enzim aceasta este produs de SP6 , cu afinitate foarte mare pentru secvena situsului promotor SP6. Este utilizat pentru sinteza sondelor ARN.

 T3 ARNpolimeraza Este ADN dependent avnd o mare afinitate pentru secvena promotorului bacteriofag T3, transcrie ADN n ARN de la 5' la 3'. Aplicaii identice cu T7 ARNpolimeraza. QB replicaza este ARN dependent in vitro avnd funcia de replicare a ADN genomic al fagului QB. Ea identific ADN de replicat pe baza structurii secundare. Enzime de modificare Fosfataza alcalin catalizeaz hidroliza gruprii 5' PO4 a ADN i ARN elibernd un rest fosfat i crend o extremitate 5'OH. Aplicaii: prevenirea legrii vectorilor de clonaj pe ei nsi eliminnd posibilitatea de formare a legturilor fosfodiester; eliminarea gruprii 5'PO4 nainte de marcajul acizilor nucleici prin T4 polinucleotid kinaza.

 Aceast enzim este foarte des utilizat ca generator de semnal de unde natura dependent de substratul utilizat n sisteme de detecie a acizilor nucleici. Polinucleotidkinaza catalizeaz transferul unei grupe gama fosfat de la un ATP la extremitatea 5'OH a unui ADN sau a ARN. ADN nativ fosfatat n 5' este adesea necesar s fie tratat n prealabil cu fosfataz. n unele condiii experimentale reacia permite un schimb de fosfai ntre fosfatul poziiei gamma a unui ATP i fosfatul din 5' a unui ADN. Aceasta permite evitarea etapei de tratament al ADN cu fosfataza. Aplicaii: marcarea unei sonde ADN sau ARN n 5' terminal; marcarea unei amorse utilizate pentru secvena markerilor radioactivi utiliznd gamma 32P, gamma 33P i gamma 35S.

 ADN ligaza asigur formarea legturilor fosfodiester ntre deoxiriboz 3'OH i 5'PO4 a dou nucleotide adiacente. Permite legarea sau lipirea a dou ADN dublu catenare. Are ntr-un fel activitate invers enzimelor de restricie. Aplicaii: subclonarea produilor de amplificare n vectori. Exist T4 ADN ligaz care leag extremitatea 5'PO4 a unui ADN sau ARN monocatenar cu extremitatea 3'OH. Nucleazele sunt enzime care ataca acizii nucleici fie de la extremitatea 5' sau 3' numite i exonucleaze, fie din interior sau endonucleaze. ARNaza sau RNaze sunt endonucleaze care hidrolizeaz puntea fosfodiesteric de ARN: A, T1 i H. - RNaza A extras din pancreasul de bovine distruge ARN monocatenar ndeosebi dup resturile C i U. Hibrizii ADN-ARN i ARN dublu catenar sunt rezisteni.

 Inhibitorii de RNaz Inhib activitatea RNazelor i mpiedic distrugerea ARN de ctre acestea. Aplicaii: protejeaz ARNm n cursul RT; crete randamentul sintezei sondelor de ARN cu ajutorul ARN polimerazelor; toate aplicaiile n care exist riscul de degradare a ARN de ctre RNaz Proteinaza K, enzim utilizat de extracia acizilor nucleici. Diger celule ntregi, nucleul chiar esuturi fcnd astfel accesibil ADN i ARN. Este stabil la 40-60Ci eficace n prezena detergenilor, dintre care cel mai bun este SDS anionic.

 Ali detergeni neionici pot fi utilizai Non I, P40 i TWIN20. Ea i pierde activitatea proteazic la temperatua de 90C. Aplicaii: extracia acizilor nucleici. Agaraza permite eliberarea acizilor nucleici dintr-un gel de agaroz. Diger agaroza, dar nu distruge acizii nucleici. Este un mijloc de extragere a ADN din agaroz.

 Extracie i purificarea ADN Extracia ADN Comport:recoltarea i pstrarea probelor i extracia propriu-zis Probele ADN trebuie potejate de: inhibitori ai enzimelor utilizate (inhibitori ai Taq polimeraz), nucleaze care pot degrada acizii nucleici (ARN este n special sensibil). Frecvent sunt probe totale de snge ele pot fi separate n plasma , ser i leucocite. Alte medii curent folosite sunt din:culturi (fagi, bacterii), urin, lichid cefalorahidian, expectoraii, probe rezultate prin puncionare i biopsie. Condiii de prelevare Probele trebuiesc recoltate steril.

 O prob de snge poate fi colectat n tub uscat dac cercetrile obinute se realizeaz din ser sau pe EDTA sau ACD dac se lucreaz pe plasm. Este recomandat lizarea globulelor roii nainte de extracia ADN ( de exemplu liza cu clorur de amoniu) apoi purificarea globulelor albe. Dac se utilizeaz un anticoagulant trebuie s inem cont de natura sa. Heparina este un inhibitor pentru Taq polimeraz mai mult sau mai puin dificil de eliminat dup procesul de extracie utilizat. Probele de snge total destinat unei analize genetice ADN poate fi trimis prin pot. Acesta poate fi conservat la 4C cteva sptmni esuturile sunt bogate n nucleaze (proteaze, DNaze i RNaze). n cazul LCR este recomandat pstrarea la frigider, imediat dup recoltare. Este cunoscut faptul c LCR i urina sunt medii bogate n inhibitori.

 ARN este o molecul fragil, foarte sensibil la RN azele care sunt frecvente n mediu pn i pe degete. n cazul studiilor de ARN probele sau fraciunile lor trebuiesc congelate la -80C n primele 3 ore dup recoltare. Probele pot fi expediate n ghea carbonic. n timpul manipulrii este indispensabil s evitm contaminarea probei i ARN s fie conservat (este fragil). Se recomand: purtarea mnuilor, autoclavarea materialelor, utilizarea de pipete special rezervate acestui scop la capete cu filtre sterile.

 n funcie de tipul ADN-ului se cunosc 2 tehnici de extracie pentru tipul genomic i pentru cel plasmidic. Extracia ADN cromozomial sau genomic Metoda fenol cloroform Extracia ADN din snge total este cea mai utilizat. Parcurge 3 etape: -liza celulelor i denaturarea complexelor nucleoproteice pentru eliberarea ADN din mediul intracelular -extracia propriu-zis pentru eliminarea proteinelor -precipitarea pentru purificarea ADN

 Obinerea fraciunii de extras n practic ADN situat n celulele nucleate se recupereaz centrifugnd leucocitele pe baza gradientului de densitate. Se poate centrifuga tubul la vitez joas i se recolteaz de la interfa dintre plasm i coagulul de globule roii. Dup splare cu soluie tampon proba este gata de extracie. n cazul mycobateriilor eliberarea acizilor nucleici necesit un tratament mai drastic pe baz de ultrasunete sau asociate cu sod caustic i nclzire, sau adugnd detergeni SDS i proteinaza K.

 Este indispensabil spargerea peretelui mycobacterian care este foarte rezistent. Liza celulelor i denaturarea complexelor nucleoproteice pentru eliberarea ADN din mediul intracelular Un sistem utilizat curent adaptat la toate tipurile de probe este amestecul detergent/proteinaz care disociaz esuturile, celulele, capsida virusurilor i eliberaaz acizii nucleici. Proteinaza K, enzim utilizat pentru extracia acizilor nucleici. Diger celule ntregi, nucleul chiar esuturi fcnd astfel accesibil ADN i ARN. Este stabil la 40-60Ci eficace n prezena detergenilor, dintre care cel mai bun este SDS (dodecylsulfat de sodiu) anionic. Ea i pierde activitatea proteazic la temperatua de 90C.

 Extracia propriu-zis ADN coninut n lizat este separat de proteine prin tehnica fenol/cloroform. Fenolul este un agent deproteinizant puternic. Adiia sa la faza apoas are ca efect denaturarea proteinelor din mediu. Dup centrifugare ele se depoziteaz, n timp ce acizii nucleici sunt situai n faza apoas. Dup transferul fazei apose n alt tub, acizii nucleici sunt tratai cu un amestec cloroform/alcool izoamilic pentru a elimina urmele de fenol (care este un produs toxic i inhibitor al anumitor enzime inclusiv Taq polimeraza). n acest stadiu dup centrifugarea i eliminarea fazei organice acizii nucleici se gsesc solubilizai n faza apoas.

 Precipitarea ADN Permite obinerea ADN pur, concentrat i se face fie cu etanol 100% la -80C, fie cu izopropanol (fr sruri i la +4C) mai ales pentru probe de volum mai mare. Este indispensabil o splare cu etanol 70% pentru eliminarea srurilor. Precipitatul este transferat ntr-o soluie tampon cu for ionic slab n general utiliznd tampon TE (Tris 10 mM i EDTA 1 mM).

 Extracia ADN plasmidic n cercetare plasmidele sunt utilizate pentru inserarea unor secvene care sunt multiplicate concomitent n celule gazd (E.coli). Extracia are ca scop separarea ADN plasmidic de cel al celulei gazd. Tehnica cea mai frecvent include o etap de liz alcalin n prezena de SDS n care cele dou tipuri de acizi nucleici sunt denaturai. pH neutralizat rapid face ca ADN plasmidic s fie solubil iar cel cromozomial se transform n agregat insolubil incluznd i proteine denaturate i SDS precipitat.

 Dup centrifugare ADN plasmidic coninut n supernatant, este precipitat cu etanol i depozitul dup centrifugare este eluat cu TE sau ap steril. Exist numeroase variante. Utilizarea de cuar, rini, ageni haotropici i kituri pe baza acestor procedee. Tehnica fenol/cloroform este adaptat extraciei ADN plasmidelor. Extracia ARN Eliberarea ribonucleazelor RNazele sunt ubicvitare i dificil de inactivat, deoarece spre deosebire de ADNaze funcionarea lor nu necesit cofactori.

 Unele esuturi ca pancreasul, sunt foarte bogate n RNaze. Dei nu este posibil s le eliminm, ele sunt capabile s se renatureze dup supunerea la oc termic. Totui dup nczire adaosul de mercaptoetanol agent reductor, ajut la pstrarea RNazelor n stare denaturat mpiedicnd reformarea punilor disulfidice. Este indispensabil neutralizarea aciunii lor n lizatul celular tratnd proba cu detergeni i ageni haotropici ca mercaptoetanol i tiocianat de guanidin.

 n laborator sunt dou surse de contaminare cu RNaze: minile operatorului i germenii n suspensie din aer care se depun pe sticlrie i consumabile. Deci este esenial s se lucreze permanent cu mnui, s se utilizeze materiale de unic folosin, sticlria s fie tratat cu dietilpirocarbonat (DEPC 0,1%) inhibitor puternic de RNaz - apoi autoclavat ( DEPC intr n reacie cu bazele purinice), fie s fie supus la temperaturi foarte mari (200C) la autoclav fr tratament cu DEPC. Materialul plastic este decontaminat cu sod caustic 0,1 N i EDTA 1 mM apoi splat cu DEPC. Reactivii i tampoanele trebuie tratate cu DEPC apoi autoclavate. Pentru tamponul TRIS nu se face autoclavare dar se utilizeaz ap tratat cu DEPC pentru prepararea tamponului. Apa deionizat este n principiu lipsit de ARNaz.

 Sunt necesare trei etape succesive pentru obinerea ARN purificat. 1. Liza celular. Se folosesc dou grupe de detergeni puternici care inhib RNazele. n prima grup agentul disociant utilizat este tiocianatul de guanidin (GTC) iar n a doua se asociaz cu mercaptoetanol. Ambii sunt inhibitori de RNaz. Utilizarea combinat permite disocierea proteinelor liza celulelor, inactivarea RNazelor i denaturarea ARN. Dac se dorete eliminarea riscului de contaminare ARN cu ADN este necesar tratarea cu DNaz. Tehnica unete metode care necesit utilizarea fenolului i a detergentului. Adesea se adaug un inhibitor de RNaze /RNasin) izolat din pancreas de bovine. RNazele sunt de asemenea inactivate cu SDS, proteinaza K.

 2. Extracia propriu zis a ARN ARN este extras cu fenol/cloroform. Separarea se face pe baza precipitrii diferite a ARN i ADN n funcie de pH. n condiii de pHacid ARN rmne n soluie apoas. n mediu alcalin ADN rmne n soluie apoas. 250l material patologic (sange integral, ser, lichid de ascita) + 1000l ARN + 250l cloroform in tuburi eppendorf de 1,5 ml; pentru fecale se dilueaza o cantitate de 1 ml apa D, se vortexeaza foarte bine, apoi se centifugheaza, iar lichidul clar se repartizeaza in tuburi si se prelucreaza la fel ; se agita foarte bine si se cenrifugheaza 15 minute / 12000 rpm, la +40C . Dupa centrifugare se observa aparitia a doua faze (una guanidinica la baza tubului si una apoasa, in care se gaseste ARN-ul)

 in alt tub eppendorf de 1,5 ml se recolteaza cu atentie faza apoasa (lichid foarte clar), in cantitate aproximativa de 700l ; peste aceasta se adauga 700l izopropanol se introduc tuburile la congelator la -200C, unde se lasa pana a doua zi; se centrifugheaza 20 de minute / 12000 rpm, la +40C, dupa care se poate observa la fundul tubului, ARN-ul precipitat sub forma unui buton, cu o marime direct proportionala cu cantitatea de ARN din proba ;

 se indeparteaza izopropanolul si se inlocuieste cu 1000l etanol 60% si se centrifugheaza 20 minute la 12000 rpm, la +40C ; se indeparteaza toata faza lichida din tub, ramanand doar depozitul de ARN ; se introduce la termostat la 370C pentru uscare (10-15 minute), pana cand depozitul devine translucid ; se adauga 50l apa distilata si se omogenizeaza foarte bine si se conserva la 800C .

 Pentru determinarea concentratiei de ARN din proba se detemina densitatea optica (DO) a unui amestec ce contine 95l apa distilata si 5l ARN. Lungimea de unda la care se face citirea este de 260 nm. Formula dupa care se calculeaza cantitatea de ARN este urmatoarea : [ARN] = DO(260 nm) x 40 x 20 40 factor de corectie 20 dilutia Rezultatul se exprima in g/ml . [ADNds] = DO(260 nm) x 50 x 20 50 factor de corectie 20 dilutia Rezultatul se exprima in g/ml .

Proba 43 44 45 45bis 46 47 48 49 50 50 bis 51 52

DO (260nm) 0,067 0,064 0,186 0,116 0, 189 0,061 0,036 0,088 0,057 0,100 0,055 0,064

Concentratia ARN (g/ml) 53,6 51,2 148,8 92,8 151,2 48,8 28,8 70,4 45,6 80 44 51,2

53
53 bis 55 55bis 56

0,053
0,143 0,072 0,081 0,035

42,4
114,4 57,6 64,8 28

56bis
57 57bis 1 57bis 2 58 58bis

0,075
0,065 0,039 0,043 0,291 0,144

60
52 31,2 34,4 232,8 115,2

 3.Precipitarea ARN. Se efectueaz similar cu a ADN cu izopropanol sau etanol de asemenea se face splare cu etanol 70%. ARN se mai poate obine cu bile magnetice. Exist numeroase kituri de extracie rapid. Dozarea ARN. Poate fi necesar n Northern blot, RNazin Protein Assey. Spectrofotometria. Este cea mai utilizat i msoar densitatea optim la 260-280 nm a unei diluii de ARN.

 Sinteza unui ADNc in vitro Manipularea i studiu ARN este diferit din cauza marii sensibiliti la ribonucleaze care-l distrug. Este necesar recopierea secvenei de ARN pentru a crea o structur stabil i care va fi amplificat n funcie de necesiti. ARNm purificat, utilizd cromatografia prin afinitatea pe o coloan de oligodezoxitimidina, este legat n prima etap cu oligonucleotide poliT care se ataeaz la coada polyA. Pornind de la extremitatea 3 a acestei amorse poly T, transcriptaza invers, care este o ADN polimeraz, sintetizeaz un lan de ADN complementar al mesagerului de pornire

 Odat ce s-a realizat aceast sintez se degradeaz ARN printr-o baz tare sau o ribonucleaz specific. Lanurile de ADN constituite formeaz spontan o bucl la extremitatea 3, sub forma de agraf de pr, care se hibrideaz pe ea nsi. Extremitatea 3 a acestei bucle va servi ca situs de demaraj pentru ADN polimeraza, care va sintetiza un lan de ADN complementar primei. O ribonucleaz specific ADN-ului monocatenar va suprima bucla la extremitate. ADNc dublu catenar este sintetizat. Se poate astfel constitui att ADNc ci ARNm exist ntr-o celul; ansamblul acestor ADNc formeaz o banc de ADNc.

 Electroforeza Electroforeza este o metoda de separare a particulelor incrcate electric prin migrare diferenial sub actiunea unui cmp electric. Ne permite cuantificarea de manier precis a ADN i ARN, iar n anumite cazuri, aprecierea cantitii de acizi nucleici prezeni (prin raportarea la un marker de talie cunoscut). Se poate utiliza hrtie, acetat de celuloza, gel de poliacrilamid, gel de agaroz, gel de amidon, gel de siliciu. Exist dou tipuri de gel utilizate mai frecvent agaroz i poliacrilamid care permit o separare mai bun. Agaroza, polizaharid extras dintr-o varietate de alg roie, este un polimer al unei uniti dizaharidice; la nclzire n soluii apoase formeaz hidrosoli, care la rcire se transform n hidrogel.

 Electroforeza n gel poliacrilamid Gelul de poliacrilamid se formeaz prin polimerizarea vinilic a monomerilor de acrilamid CH2=CH-CO-NH2 n lanuri lungi de poliacrilamid i prin reticularea lanurilor n urma includerii unui comonomer bifuncional adecvat de obicei N, N metilen bisacrilamid (Bis). CH2=CH-CO-NH-CH2- NH-CO-CH=CH2 Reacia de polimerizare d natere n mod aleatoriu unor asemenea lanuri de poliacrilamid ce ncorporeaz o mic cantitate de molecule Bis, acestea putnd reacioana cu alte grupuri ale altor lanuri determinnd reticularea i formnd o reea. Concentraia poliacrilic utilizat determin lungimea medie a lanului de polimer, n timp ce concentraia de Bis determin gradul de reticulare. Ambele concentraii decid proprietile fizice ale gelului precum densitatea, elasticitatea , rezistena mecanic i dimensiunile porilor.

 n trecerea prin mediul de agaroz sau acrilamid, moleculele se separ n funcie de dimensiune. Cele mai mari sunt reinute, iar cele mai mici migreaz. Acrilamida are putere mai mare separatoare dect agaroza ns este mai toxic. Tehnica electroforezei Dup formarea, turnarea gelului, trasarea godeurilor i solidificarea acestuia se vor introduce probele de ADN. n primul godeu se introduce un marker cunoscut, care permite estimarea mrimii fragmentelor de ADN. Se utilizeaz frecvent ADN de fag restrictat cu o anumit enzim. Fragmentele rezultate au o mrime cunoscut, ceea ce permite folosirea lor ca etalon. n godeurile rmase se introduc pe rnd probele care urmeaz s fie analizate.

 Se adaug doi colorani: unul bine vizibil pe gel care va migra foarte rapid, albastru de bromfenol, pus naintea fragmentelor de ADN pentru a delimita distana parcurs pn la anod. Al doilea, bromura de etidiu, care se intercaleaz ntre bazele de acizi nucleici i imprim o culoare oranj cnd acestea sunt expuse la lumina UV. Astfel, moleculele de ADN complexate cu bromur de etidiu devin vizibile. Aparatul de electroforez se cupleaz la o surs de curent . Polul pozitiv este opus godeurilor.Cnd frontul de migrare ajunge n apropierea captului opus al gelului, se ntrerupe sursa de curent. Se scoate tvia cu gel i se vizualizeaz n UV la 254 nm, se vor fotografia fragmentele de ADN digerate n gel.

 Distana de migraie este proporional masa molecular: exist o proporionalitate invers ntre mobilitatea i logaritmul masei, dar relaia este valabil pentru moleculele liniare avnd sub 20 kb. Se determin astfel mrimea fragmentelor de restricie obnute i se compar cu a celor de mrime cunoscut. migrarea moleculelor mari de 20kb este aproape independent de mrime i nu mai apare o relaie de linearitate; conformaia cerc deschis CD/OC - open circle, cerc covalent nchis CCI/CCC covalenty closed cirle. La aceeai mas molecular, CCI au cea mai mare mobilitate pe cnd conformaia CD este mai lent. Moleculele liniare au o mobilitate intermediar. tamponul de electroforez folosit este Tris Acetat (TAE).

 Dup migrare probele se citesc la UV. n unele cazuri moleculele care trebuiesc separate sunt marcate prin ncorporarea unui izotop radioacitv care permite detectarea prin autoradiografie. Particulele energetice emise de radioizotop imprim un film fotografic pe gel. Se developeaz pentru a se vedea benzile negre care corespund moleculelor marcate radioactiv. Efectele dimensiunii porilor n mediile gelificate, trecerea oricrei particule este ntrziat de structura matricei i depinde de mrimea relativ a particulelor i a porilor din reeaua gelului. Att dimensiunile ct i sarcina moleculelor au un rol important n procesul de separare. n gelurile de agar dimensiunea porilor este mare . Poliacrilamida are avantajul uurinei cu care mrimea porilor poate fi modificat prin concentraia acrilamidei i a proporiei de agent de reticulare. Pe msura creterii proporiei de agent de reticulare cinetica de reacie este ncetinit i matricea de gel devine mai puin omogen.

 Alegerea gelului i a sistemului tampon adecvat De exemplu un amestec de proteine virale sau acizi nucleici cu greuti moleculare mari ar putea impune alegerea unui gel cu pori mari avnd o concentraie de poliacrilamid T sub 5% pentru a evita efectul excesiv de sit molecular. T=15-20% sau mai mult se preteaz pentru polipeptide ori histone cu greutate molecular mic, aceste concentraii accentund diferenele minore de dimensiuni n cadrul aceluiai nivel de greutate molecular. La separarea unui amestec de proteine este puin probabil alegerea acelui set de condiii s poat garanta cel mai bun grad de separare a fiecrei componente de celelalte. Dac ntr-un gel se obine o singur band aceast nu conine n sine dovada prezenei unei singure componente omogene.

 Gelurile plate verticale Grosimea gelurilor 0,5-1,5 mm. Cu ct sunt mai subiri cu att sunt mai rapide i eficiente pentru colorare, decolorare, iar rcirea din timpul electroforezei este mai rapid i mai uniform. Aceasta permite aplicarea unei tensiuni mai mari i a unor timpi de aciune mai redui. Gelurile sunt obinute n forme separate care ulterior sunt inserate n aparat cu ajutorul unor garnituri de cauciuc i introduse n tamponul ce reprezint mediul de rcire (rcire realizat prin mijlocirea tuburilor de ap). Un colorant trasor este albastru de bromfenol. Acesta migreaz cu o vitez mai mare dect oricare dintre componententele macromoleculare ale probei i indic momentul stoprii electroforezei. Gelurile se introduc n baie de colorant cu bromur de etidiu 3 minute, apoi se examineaz la o lamp cu ultraviolete.

 Lipoproteinele, au caracter parial proteic pot fi colorate naintea electroforezei pentru a le deosebi de proteine. Se folosete Sudan Black B. Exist densiometre laser care scaneaz gelurile la nivele de rezoluie extrem de ridicat. Rspunsul scanner-ului poate fi computerizat ceea ce permite nregistrarea, redarea, evaluarea i stocarea datelor pe disc sau imprimarea lor, precum i compunerea a dou geluri diferite. Semnalul densiometric este preluat pe un nregistrator i este cuantificat prin msurarea suprafeelor de sub peak-urile individuale. Se poate recurge la integrarea electric sau prin achiziionarea de date pentru calcul computerizat al suprafeelor de sub peak, metod folosit pentru scanarea unui numr mai mare de geluri. nlimea peak-ului depinde de distana materialului parcurs prin gel.

 Electroforeza proteinelor Proteinele se pot separa prin electroforez ca i acizii nucleici. Suportul poate fi acetat de celuloz, pentru proteinele din serul uman, sau hrtie, ntr-un tampon de pH de 8,6. Benzile corespunztoare proteinelor separate, sunt vizualizate prin colorare cu un colorant specific i printr-o scanare densiometric se obin indicaii despre cantitatea relativ a proteinelor din fiecare band separat. Dei mobilitatea proteinelor depinde n special de sarcina electric relativ a acestora, dimensiunea proteinelor joac de asemenea un rol important i aceasta contribuie desigur la poziia benzii corespunztoare moleculei de globulin.

 Electroforeza proteinelor n gel de poliacrilamid Gelul de poliacrilamid se poate folosi n locul acetatului de celuloz sau al hrtiei pentru separarea proteinelor native. Un astfel de gel este folosit n mod obinuit n prezena dodecil sulfatului de sodiu (SDS). n acest caz proteinele oligomerice (alctuite din cteva uniti polipeptidice) se pot separa n subunitile lor individuale. Proteinele se separ ntr-o soluie SDS 1%. Acest detergent desface majoritatea legturilor dintre proteine i dintre acestea i lipide. Pentru a desface i punile disulfurice, se adaug foarte des i 2-mercaptoetanol.

 Mobilitatea electroforetic a majoritii proteinelor (dar nu i a glicoproteinelor), depinde de dimensiunea lor, deoarece sarcina negativ adus de moleculele SDS legat de protein este mult mai mare dect sarcina net a proteinei nsi. O distribuie specific (pattern) de benzi se obine la colorarea gelului cu Albastru Comassie. Gelul de agaroz poate fi folosit n locul celui de poliacrilamid n cazul proteinelor mai mari sau pentru a obine o separare diferit n absena SDS. Se poate aplica metoda PAGE bidimensional, folosind condiii de lucru diferite de cele dou direcii de migrare: de exemplu un gradient constant de pH (pH 4-7%) pe o direcie i un pH 11-14%poliacrilamid n cealalt direcie.