Tehnica ELISA

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbet Assay) reprezint la ora actual,

una din cele mai des folosite metode, de indentificare i apreciere cantitativ
pentru anticorpi, antigene, ormoni, citokine i o palet larg de alte
molecule, inclusiv peptide sintetice!
"enica ELI#A a fost inventat de un grup de cercettori de la $niversitatea
din #tokolm condus de %eter %erlmann i Eva Engval, acetia public&nd
primul articol despre ELI#A 'n ()*(! Articolul descria aprecierea cantitativ a
Ig+ 'n serul de iepure folosind fosfataz alcalin ca enzim de indentificare!
Avanta,e de siguran- crescut i cele economice, fa- de testarea
radioimun(.IA) au fcut din tenica imunoenzimatica ELI#A una
indispensabil pentru domeniul medicinei clinice, biologiei si al
biotenologiei!
1. PRINCIPIUL METODEI
%rincipiul metodei, indiferent de tipul de ELI#A ales, este 'n esen-
acelai i se bazeaz pe reac-ia antigen/anticorp! Antigenul sau anticorpul de
captur este fi0at pe un suport solid dup care este pus 'n contact cu o
imunoglobulin, un antigen sau respectiv orice molecul pentru care are
specificitate! 1 enzim cuplat fie direct de imunoglobulin sau de un alt
anticorp anti/imunoglobulin degradeaz un substrat cromogen incolor
produc&nd un compus colorat ce poate fi detectat spectrofotometric la o
lungime de und corespunztoare!
2. PUNCTE CRITICE N PROTOCOLUL ELISA
2n implementarea oricrei tenici ELI#A 'n-elegerea proceselor de baz
i aplicarea corect a acestora reprezint un factor esen-ial 'n atingerea
obiectivului propus!
Etapele fundamentale ale tenicii sunt reprezentate de3
Prepararea conjua!u"ui
4on,ugatul este reprezentat de un antigen sau un anticorp cu specificitate
pentru molecula de determinat, cuplat cu o enzim! 4uplarea enzimei se
realizeaz prin cross/linkare sub ac-iunea unor agen-i favorizan-i cum ar fi
glutaraldeida, di/iso/cianat toluen, p/benzocinona, etc!
5ei un grup mai mare de enzime au fost utilizate de/a lungul timpului,
fosfataz alcalin i pero0idaz din rean(6.%/7*orserac77s7) peroxidase)
rm&n cele mai populare datorit randamenului oferit prin prelucrarea rapid
a substratului i a gamei vaste de tenici de developare e0istente!
Alte enzime folosite 'n tenica ELI#A sunt (8/galactozidaza, glucozo0idaza,
pirofosfataza, etc!
'n cazul 'n care con,ugatul folosit este reprezentat de un grup enzim/
anticorp, anticorpul respectiv trebuie s fie ales 'n aa fel 'nc&t s recunoasc
alt determinant antigenic al moleculei de determinat cum ar fi fragmentul 9c
al imunoglobulinei sau alt epitop al antigenului!
E0ist o multitudine de protocoale pentru prepararea con,ugatului disponibile
'n literatur dar realizarea acestora presupune e0perien- 'n domeniu i timp
consumat 'n plus! :ai convenabil este acizi-ionarea con,ugatului de la
firme specializate 'n domeniu!
#i$area an!icorpu"ui %au an!ienu"ui &e cap!ur' pe p"ac'
%entru pregtirea unei determinri ELI#A, pregtirea plcii de reac-ie este
foarte important!
4u toate c diferite tipuri de plci gata pregtite pot fi acizi-ionate de
la productori, acestea pot fi adesea scumpe aa c prepararea plcilor 'n
laborator reprezint 'nc un punct ceie 'n tenica ELI#A!
2n general se folosesc plci de microtitrare cu ); de godeuri fabricate din
material plastic!
:a,oritatea proteinelor pot fi adsorbite pe suprafe-e din plastic datorit
interac-iunilor idrofobice 'ntre structurile proteice nepolare i structurile
nepolare ale matricei polimerului!
E0ist mai multe protocoale de fi0are, dar cele mai des folosite, implic
incubarea unei dilu-ii a anticorpului sau antigenului de captur 'n godeul
plcii de microtitrare 'ntr/un tampon carbonat la p6 )/(<!
Incubarea poate fi de c&teva ore sau peste noapte i se face la 8*=4 sau la
temperatura camerei!
%laca de microtitrare astfel pregtit poate fi pstrat la >=4 p&n la ; luni!
5eoarece fi0area anticorpilor de plac nu este una specific este necesar
blocarea situsurilor de legare nespecific pentru a preveni fi0area celorlal-i
reactan-i de plac 'n locul interac-iunii acestora cu anticorpul fi0at! ?locarea
se realizeaz de obicei prin incubarea cu un tampon de blocare, format de
obicei dintr/o protein inert i un detergent neionic!
Incu(area an!ienu"ui %au an!icorpu"ui &e &e!er)ina! *n
p"ac'
Adugarea dilu-iei de antigen sau anticorp 'n placa de reac-ie reprezint
prima etap efectiv a tenicii ELI#A i nu un pas pregtitor!
2n aceast etap molecula de determinat se ataeaz prin legturi de
idrogen, ionice, interac-iuni idrofobice i for-e de interac-iune van der
@aals, de anticorpul7antigenul completentar, de captur!
Incubarea se realizeaz de obicei la temperatura camerei timp de A ore!
4u toate c numrul de legri specifice 'n timp de A ore este de obicei
suficient pentru a ob-ine un semnal puternic 'n reac-ia cromogen, saturarea
situsurilor de legare(starea de ecilibru) este atins 'n apro0imati0 B/(< ore,
aa c o incubare mai lung poate duce la rezultate mai bune!
*n&ep'r!area reac!an+i"or "i(eri &in p"ac' ,Sp'"area-
$n pas foarte important 'n tenica ELI#A 'l reprezint etapele de splare!
:oleculele nefi0ate fie 'n timpul aderrii la plac fie 'n timpul legrilor
specifice cu anticorpii de captur trebuiesc eliminate din godeuri pentru a nu
iniba legarea reactan-ilor ce urmeaz a fi aduga-i ceea ce ar conduce la un
rezultat eronat!
1 etap de splare presupune 'ncrcarea godeurilor cu o anumit cantitate
de tampon de splare i 'ndeprtarea tamponului de splare dup o perioad
scurt de timp!
"amponul de splare este reprezentat 'n general de o solu-ie de tampon
fosfat salin("9#) la care se poate adaug <,<BC azid de sodiu,NaN.-.
%entru a asigura o splare bun a plcii i implicit o 'ndeprtare eficient a
reactan-ilor liberi din plac sunt necesare mai multe splri 'ntre etapele
determinrii!
La sf&ritul fiecrei etape de splare, indiferent de numrul de splri din
respectiva etap, este bine s se elimine orice urm de tampon de splare
din godeuri! %entru aceasta, placa este 'ntoars i scuturat energic pe un
prosop de &rtie!
9oarte importante rm&n splrile dup fi0area antigenului pe plac, dup
prima incubare i dup incubarea cu solu-ia de con,ugat!
Dumrul de splri 'ntr/o etap poate fi cuprins 'ntre A i B dar at&t timp c&t
splrile nu sunt fcute 'ntr/o manier EbrutalF un numr mai mare de
splri nu poate dec&t s creasc calitatea tenicii!
#plarea se poate face manual folosind o pipet multicannell sau cu un
spltor automat ELI#A!
La folosirea spltorului automat trebuie acordat aten-ie deosebit folosirii
unor plci recunoscute de aparat i a,ustarea setrilor aparatului la tipul de
godeuri / cu fundul plat, conic, rotund!
Incu(area conjua!u"ui *n p"ac'
'n func-ie de tipul de ELI#A aplicat, adugarea con,ugatului 'n reac-ie
presupune legarea acestuia de anticorpul de determinat sau de antigenul
specific!
4a i 'n etapa de incubare a anticorpilor sau antigenelor de determinat
prelungirea timpului de reac-ie poate oferii un semnal mai puternic!
5up incubare, plcile sunt splate i pot fi pstrate la >=4 c&teva luni p&n
la adugarea substratului cromogen!
A&'uarea %u(%!ra!u"ui cro)oen
Adugarea substratului cromogen reprezint o etap critic 'n tenica ELI#A
deoarece este etapa 'n care rezultatul pozitiv sau negativ poate fi apreciat!
Este de asemenea prima etap 'n care putem semnala dac vreo etap 'n
protocol a fost e0ecutat greit sau unul dintre reactivi nu func-ioneaz!
#ubstratul cromogen este adugat 'n godeuri i placa este incubat la
'ntuneric o anumit perioad de timp, 'n func-ie de caracteristicile enzimei i
ale substratului, i reac-ia este oprit prin adugarea unei solu-ii de stopare!
"impul de incubare al substratului cromogen 'n proba cu con,ugatul fi0at se
determin empiric prin observarea modificrii culorii amestecului de reac-ie
p&n la o intensitate comparabil cu cea teoretic a produsului final!
4on,ugatul poate fi reprezentat de o enzim cuplat cu straptavidin, o
protein tetrameric ob-inut din bacteria Streptomyces avidinii, ce are o
afinitate foarte mare pentru biotin(vitamina 6)! ?iotina poate fi cuplat prin
diverse procedee la un aticorp i astfel, pe baza afinit-ii streptavidinei
pentru biotin, con,ugatul se poate cupla la anticorpul biotinilat fr a fi
nevoie de un con,ugat enzim/anticorp specific! Aceast procedur este
deosebit de important 'n cazul tenicilor ELI#A sandvi 'n care se dispune de
o cantitate mic de anticorpi monoclonali, folosirea comple0ului stravidin/
biotin amplific&nd sensibilitatea analizei de A/B ori!
5ei aceast incursiune presupune adugarea de pai la protocolul ini-ial,
efortul este unul recompensat printr/o imbunt-ire considerabil a
sensibilit-ii analizei!
In!erpre!area re/u"!a!e"or
4onst 'n aprecierea culorii probei! Intensitatea culorii se apreciaz mai 'nt&i
vizual, pentru determinarea virrii de culoare dup adugarea substratului i
stabilirea timpului de men-inere a lui p&n la stoparea reac-iei!
5ensitatea optic a fiecrei probei se apreciaz la stectrofotometru, la o
lungime de und corespunztoare!
Aprecierea rezultatelor se face prin dou metode 3
(. Me!o&a ca"i!a!i0a de apreciere a pozitivit-ii probelor, prin
calcularea valorilor prag (cut off) fa- de care se raporteaz absorbanta
fiecrei probe! Aceast valoare este determinat corform formulei3
41GH A 5#
unde 41 este valoarea prag (cutt off), G / media valorilor negative, 5# este
devia-ia standard! %robele cu valoarea absorbantei sub limita prag sunt
considerate negative iar cele peste aceast valoare sunt considerate pozitive!
A! Me!o&a can!i!a!i0a presupune folosirea unor probe standard, de
concentra-ii cunoscute, cu a,utorul crora se traseaz o curba standard!
Aceasta se realizeaz prin introducerea concentra-ilor probelor standard pe
a0a G a unui grafic, a valorilor densit-ilor optice respective pe a0a I i
stabilirea punctelor de intersec-ie! 4urba standard se definete ca cea mai
apropriat ecua-ie liniar care s intersecteze c&t mai multe din punctele de
pe grafic!
9olosindu/ne de valorile cunoscute putem e0trapola o func-ie, a rela-iei dintre
densitatea optic i concentra-ia probei, prin regresie liniar! Ecua-ia ob-inut
fiind de forma3
51J4Kk H 51
<
unde 51 este densitatea optic a probei, 4 / concentra-ia probei, k /
constanta, 51
<
/valoarea absorbantei la o concentra-ie a probei egal cu <!
Laloarea lui 51
<
poate fi calculat 'n orice program de calcul computerizat
printr/o func-ie ce returneaz valoarea unei curbe 'n punctul de intersec-ie cu
a0a I! 'n :icrosoft E0cel putem folosi func-ia ID"E.4E%" av&nd ca parametri
pe de/o parte valorile concentra-iilor probelor standard i pe de alt parte
valorile densit-ilor optice respective!
5up calcularea lui 51
<
putem afla valoare lui k i de aici prin rezolvarea
ecua-iei ob-inem formula de calcul a concetra-iei probelor 'n func-ie de
valoarea densit-ii optice 3
4 J (51 / 51
<
)7k
8! CLASI#ICAREA TE1NICILOR ELISA
5atorit multiplelor aplica-ii ale metodei imunoenzimatice ELI#A, au
aprut diferite protocoale pentru e0ecutarea acesteia 'n func-ie de
particularit-ile moleculei de determinat i de modul 'n care procesele
fundamentale ale metodei ELI#A se desfoar!
1 prima clasificare a tenicilor ELI#A se poate face referitor la modul de
fi0are al anticorpului la antigenul de captura, astfel facandu/se distinc-ia intre
fi0are competitiva i necompetitiva!
1 alt clasificare se face 'n func-ie de modul direct sau indirect 'n care
con,ugatul se fi0eaz de antigenul sau anticorpul de captura!
1 categorie separat de tenici ELI#A o reprezint tenicile sandvi, 'n care
un antigen este prins intre A sau ciar 8 anticorpi, dintre care primul este cel
de captur i ultimul este cel din con,ugat!
"enica ELI#A celulara, denumit de unii autori i cELI#A reprezint o
determinare 'n care antigenul sau anticopul fie el de determinat sau de
captur este o molecul e0primat la suprafa-a membranei celulare
"enici ELI#A folosite curent
ELI#A ID5I.E4"M
Aceast tenic este util pentru determinarea concentra-iei
anticorpilor serici sau din supernatantul celulelor de tip ibridoma! :etoda se
preteaz situa-ilor 'n care cantit-i de ordinul miligramelor din antigenul
purificat sau semipurificat sunt disponibile!
%rotocolul presupune fi0area antigenului pe fundul plcilor de microtitrare i
blocarea situsurilor de legare nespecific, incubarea solu-iilor de testat i
splarea anticoprilor necuplati din plac
dup incubare! #olu-ia de con,ugat (con,ugat enzim/anticorp anti/anticorpul
de determinat) se adaug 'n reac-ie, se incubeaz i o noua etap de splare
inlatur con,ugatul nefi0at din plac! #e adaug substratul cromogen i dup
parcurgerea timpului de incubare reac-ia este stopata! 4antitate de substrat
descompus de enzim este determinat prin citire la spectrofotometru!
Lalorile densit-ilor optice vor fi direct propor-ionale cu cantitatea de
anticorpi din solu-ia testata!
ELI#A 41:%E"I"ILA 5I.E4"A
Aceast tenic se poate folosii pentru a detectarea calitativa i
cantitativa a antigenelor solubile i este indeosebi util cand at&t antigenul
c&t i anticorpii specifici sunt disponibil 'n cantit-i de ordinul miligramelor!
%rotocolul presupune fi0are antigenului de captur pe fundul plcii i
adugarea 'n acelai timp a con,ugatului enzim/anticorp specific i a solu-iei
de testat care con-ine antigene solubile! 4uplarea con,ugatului la antigenul
de captur este inibat de cuplarea la antigenul solubil! 5up incubarea cu
amestecul de con,ugat i antigen solubil inibitor, reactan-ii nefi0ati sunt
indeparta-i prin splare! #e adaug subtratul cormogen i dup incubare
reac-ia este stopata! 4antitatea de antigen din solu-ia de testat este direct
propor-ional cu gradul de inibare al transformrii substratului i poate fi
cuantificat prin intrapolare pe o curba de inibare generat prin realizarea
unor dilu-ii seriale ale solu-iei standard de antigen!
ELI#A #AD5LIN
"enicile care folosesc principiul anticorpi/sandvi ar putea reprezenta unele
din cele mai utile determinri imunoenzimatice pentru determinare
antigenelor deoarece frecvent ofer o sensibilitate de A/B ori mai mare dec&t
alte tenici de determinare a antigenulei
%rotocolul presupune folosirea unor anticorpi specifici de captur fi0a-i pe
placa de microtitrare peste care se adaug solu-iile de antigen de testat!
5up incubare antigenul nelegat este inlaturat prin splare iar 'n plac se
adaug solu-ia de con,ugat(con,ugat enzim/anticorp specific pentru alt
epitop al antigenului), etap creia ii urmeaz o noua incubare! 4on,ugatul
nelegat este inlaturat prin splare! #e adaug substratul cromogen i dup
parcurgerea timpului de incubare reac-ia este blocata! 4antitatea de substrat
idrolizat este direct propor-ional cu cantitatea de antigen din solu-ia de
testat!
ELI#A 5$?L$/#AD5LIN
"enic folosit 'n special pentru detectarea anticorpilor specifici 'n cazul 'n
care se dispune de o cantitate mic de anticorp specific i nu se dispune de
antigen purificat! "enica se poate folosi i pentru investigarea pozi-iei
epitopilor diferi-ilor anticorpi monoclonali forma-i impotriva unui antigen
comun!
#uportul solid este acoperit cu anticorpi anti/imunoglobulina (imunoglbulina
provenit de la speciile imunizate)! #olu-ia de anticorpi de testat se
incubeaz 'n plac i la sf&rit anticorpii nelega-i sunt inlatura-i prin splare!
#e adaug solu-ia de antigen i se incubeaz! 5up inc o etap de splare
se adaug con,ugat enzim/antigen specific i se incubeaz din nou!
4on,ugatul nelegat este indepartat prin splare i se adaug substratul
cromogen!
%robele din godeurile 'n care apare reac-ia de culoare sunt desemnate posibil
pozitive adic ar putea s con-in anticorpi specifici! Lerificarea rezultatelor
fals pozitive sau a probelor cu o pozitivitate incert se poate face prin
retestarea probelor respective! %robele vor fi lucrate 'n patru e0emplare 'n
godeuri 'n care s/a fi0at anticorpul de captura! 'n doua dintre godeuri se va
adaug antigenul iar 'n celelalte doua doar un tampon de blocare! 'n toate
cele patru godeuri se continua cu adugarea con,ugatului i a substratului
cromogen! %lcile vor fi citite dup o ora! Acesta
procedur va elimina rezultatele fals pozitive ob-inute pe fondul reac-iei
dintre anticorpii de testat cu anticorpii din con,ugat!
%entru a distinge rezultatele pozitive dar cu o concentra-ia mic de anticorpi
specifici plcile pot fi citite din nou dup c&teva ore sau zile de la adugarea
substratului cromogen!
ELI#A 4EL$LA.M 5I.E4"A
"enica este folosit pentru evaluarea prezen-ei antigenelor sau a
receptorilor de suprafa-a pe membrana celulelor de testat folosind anticorpi
e0isten-i sau al-i liganzi specifici antigenelor membranare!
%rotocolul presupune determinarea densit-ii optime a suspensiei celulare
per godeu prin analiza intersectat a dilu-iilor seriale i ob-inerea suspensiei
celulare prin centrifugare i resuspendare 'n volumul determinat! $n volum
fi0 de suspensie celular este adugat 'n godeurile plcii de microtitrare,
placa este centrifugat i supernatantul este inlaturat! Etapele urmtoare
presupun desprinderea butolunul celular i resuspendarea celuleror 'n
con,ugatul enzim/anticorp specific anti/molecule membranare! 5up
incubare plcile sunt centrifugate i con,ugatul nelegat este inlaturat printr/o
splare bl&nda! La acest moment se adaug substratul cromogen!
In timpul etapelor de incubare 'n prezen-a con,ugatului sau a substratului
cromogen placa va fi agitat uor la interval de (B minute pentru a asigur o
buna interac-iune intre reactan-i!
Divelul de e0primare antigenic la suprafa-a celular este direct propor-ional
cu nivelul de transformare a substratului!
4elulele eucariote secret cantit-i variabile de fosfataz alcalina cea ar
putea interfera 'n tenica ELI#A din aceast cauz o evaluare a cantit-ii de
fosfataz alcalina e0primat de celulele de testat va fi efectuat intr/un
e0periment preliminar! 5ac celulele secret fosfataz alcalina la un nivel ce
ar putea interfera cu protocolul de analiza, enzim din con,ugat va fi inlocuit
cu o alta, cum ar fi (8/galactozidaza!
4elulele folosite pot fi fi0ate inainte de analiz dar numai dac se poate
demonstra c celulele fi0ate ii pstreaz antigenicitatea membranare!
9i0area se poate face prin suspendarea celulelor intr/o solu-ie de
glutaraldeid <,BC timp de 8< de minute i splare ulterioare!
Aceast tenic poate fi la fel de sensibil ca i citometria 'n flu0 'n
cuantificarea nivelului de e0primare antigenic al unei popula-ii celulare dar
spre deosebire de metoda citometric aceast metoda nu face distinc-ia intre
popula-iile celulare i prin urmare nu poate fi aplicat unei popula-ii
eterogene de celule!
ELI#A 4EL$LA.M ID5I.E4"A
Aceast tenic este conceput pentru detectarea anticorpilor specifici
impotriva antigenelor mebranare!
Anticorpii anti/antigene membranare sunt detecta-i prin incubarea celulelor
cu o solu-ie de anticorpi primari de testat! 5up centrifugare i splare
pentru inlaturarea anticorpilor nelega-i, celulele sunt incubate cu o solu-ie de
con,ugat enzim/anticorp secundar(anticorp anti/anticorpul primar)! %lcile
sunt centrifugate i con,ugatul nelegat este inlaturat prin splare! #e adaug
substratul cromogen!
4antitatea de anticorpi primari din solu-ia de testat este direct propor-ional
cu cantitatea de substrat transformat!
2. MATERIALE 3" REACTI4I NECESARI *n TE1NICA ELISA
"enicile ELI#A, indiferent de tipul folosit, necesit 'n general acelai
set de materiale i reactivi, e0cept&nd evident solu-iile de testat i anticorpii,
respectiv antigenele, complementare care definesc fiecare protocol 'n parte!
Lista de materiale i reactivi necesari pentru e0ecutarea unei analize ELI#A
de rutina :A"E.IALE3
/ pipete automate de volume diferite(( /B<<ul) i v&rfuri
corespunztoareO
/ pipet multicannel i v&rfuri corespunztoareO
/ placi de microtitrare corespunztoare modelului e0perimentalO
/ piset de plasticO
/ spectrofotometruO
/ cuve plastic pentru pipeta multicannelO .EA4"ILI3
/ solu-ie agent de developare (con,ugat enzim/anticorp7antigen)O
/ solu-ie antigenO
/ solu-ie anticorpi de testatO
/ "9# (tampon fosfat salin)O
/ ap distilat sau deionizataO
/ substrat cromogen D%%(p/nitrofenil fosfat) sau
":?(tetrametilbenzidina)O
/ tampon de blocare a legrilor nespecificeO
/ solu-ie de stopare (Da16, 6
A
#<
>
)
/ tampon de splareO
/ tampon de fi0are a anticorpilor7antigenelor pe placO
'n cazul tenicilor ELI#A celulare(cELI#A) la lista de materiale i reactivi
se adaug3
/ solu-ie de suspensie celulareO
/ solu-ie de con,ugat enzim/anticorp specific
/ tampon de splare, -inut pe gea-aO
/ placi de microtitrare cu fundul rotund sau conicO
5. SURSE DE EROARE
"eoretic, orice etap din protocolul ELI#A poate reprezenta o sursa de eroare,
dar studiile au demonstrat c numai o parte din proceduri pot fi considerate
ca surse semnificative de eroare! Aceste proceduri critice sunt pipetarea
solu-iei de testat i a substratului cromogen i absorbanta inerent a plcilor
de microtitrare! Acestea sunt totui probleme de fine-e pe care le pot
intampina pana i cei cu e0perien-a 'n tenica ELI#A!
$rmeaz o trecere 'n revist a condi-iilor de indeplinit i posibilelor surse de
eroare3
P "o-i reactivii i plcile de microtitrare se aduc la temperatura camerei
inainte de utilizareO
P 5ei tenica ELI#A nu impune condi-ii de sterilitate, sticlria i
consumabilele (v&rfuri, cuve, etc!) trebuiesc s fie c&t mai curate i far urme
de detergen-iO
P 4oncentra-ia reactivului ce urmeaz a fi adsorbit pe suportul solid trebuie
determinat pentru fiecare cuplu suport/proteina i p6/ul solu-iei trebuie s
fie unul adecvat!
P ?locarea situsurilor de legare nespecific este o etap foarte important 'n
protocol! "amponul de blocare asigur at&t saturarea suprafe-ei godeului,
prevenind astfel fi0area anticorpilor de detec-ie sau a con,ugatului de faza
solida, c&t i inibarea legrii anticorpilor specifici la antigenul7anticorpul de
captura!
P Aran,amentul probelor 'n plac poate influen-a rezultatul determinrii!
%entru un protocol de mare precizie este bine s lsam marginile
placii(randurile A i 6) libere pentru a msura absorbanta plcii iar probele de
control, pozitiv i negativ, pot fi distribuite aleatoriu 'n zone diferite ale plcii
(4aciagli i Lerderio, A<<8)!
P 5ilu-ia probei pozitive cercetate trebuie s corespund unei valori a
absorbantei semnificativ pozitive!
P Enzima utilizat 'n con,ugat trebuie s aibe o specificitate ridicat i un
randament ridicat 'n transformarea substratului! Este de asemenea important
ca problele de testat s nu con-in substan-e care ar putea intefera cu
stabilitatea sau activitatea enzimei!
P 4oncentra-ia con,ugatului enzimatic trebuie s corespund celei mai mici
valori care asigur vizualizarea comple0ului format!
P %entru rezultate mai bune, probele se lucreaz 'n duplicat sau ciar
triplicat! :edia valorilor absorbantei este folosit pentru determinarea
concentra-iei probei!
P :anevrarea brusc a plcii sau adugarea prea rapid a probelor,
tamponului de splare 'n plac poate duce la desprinderea moleculei de
captur de pe suportul solid!
P 5ac folosi-i spltorul automat, asigura-i/v c aparatul este potrivit
pentru tipul de plac folosit i acorda-i aten-ie ad&ncimii la care coboar acul
de splare 'n plac! #etarea neadecvat a aparatului poate duce la aspirarea
anticorpilor de captura, zgarierea fundului plcii sau ciar la stricarea
aparatului! Este de preferat s folosi-i spltorul automat doar 'n cazul
folosirii unor kituri ELI#A cumprate al cror protocol prevede folosirea unui
astfel de aparat! %lcile pregtire 'n laborator pot fi mai sensibile la mecanica
spltorului automat i astfel rezultatul protocolului are de suferit!
P In cazul folosirii tenicii cELI#A, etapele de splare necesit o aten-ie
deosita! %lcile vor fi mai intai centrifugate la parametrii specifica-i 'n
protocol i supertanatul trebuie inlaturat cu gri,a pentru a nu desprinde
butonul celular! Adugarea tamponului de splare se va face intr/un mod
bl&nd! La finalul unei etape de splare, placa va fi agitat pentru
desprinderea butonulu celular i celulele vor fi resuspendate 'n reactivul
aferent etapei urmtoare! "amponul de splare trebuie s fie -inut pe geata!
P 4oncentra-ia solu-iei de captur va fi invers propor-ional fa-a de
concentra-ia teoretica a solu-iei de testat pentru a prevenii legarea
con,ugatului sau anticorpilor secundari la molecula de captura!
6I6LIO7RA#IE
(! ?ianci A!"!Q!, :oonen/Leusen 6!@!:, van der 6ei,den %!Q!, ?okout ?!A!,
"e use of a double antibody sandRic ELI#A and monoclonal antibodies for
te assessment of porcine Ig:, Ig+ and IgA concentrations, Leterinary
Immunology and Immunopatology, >>, 8<)/8(*, ())B
A! 4aciagli %!, Lerderio A!, E0perimental layout, data analysis, and tresolds
in ELI#A testing of maize for apid/borne viruses, Qournal of Lirological
:etods, Lolume ((<, Issue A, %ages (>8/(BA, 8< Qune A<<8
8! 4larck :! 9!, Lister .!:!, ?ar/Qosep :!, ELI#A "ecniSues, :etods in
enzymology, voi ((T,*>A/*;;, ()T;
>! Eva Engval, Enzyme immunoassay ELI#A and E:I", :etods in
enzymology, voi *<, p! >()/>8), ()T<
B! 6eck 9! 4, @illiams Q! 5!, %ruett Q! Interpretation of #pectropotometric
Absorbance Lalues to 5efine .esults of Enzyme/Linked Immunosorbent
Assays, Q1$.DAL 19 4LIDI4AL :I4.1?I1L1+I, Apr! ()T<, p! 8)T/><(
;! Qon @iley and #ons, Enzyme/Linked Immunosorbent Assays (ELI#A), $nit
((!A in 4urrent %rotocols in :olecular ?iology #upplement 8>,());
*! Uricka L!Q!, #elected strategies for improving sensitivity and reliability of
immunoassays, 4linical 4emistry, ><, 8, 8>*/8B*, ())>
T! Uuby Q!, +oldsby .!, Uindt "!, 1sborne ?!, Immunology , B
t
edition, A<<8
)! Le +off 4, "iaucourt 9!, A competitive ELI#A for te specific diagnosis of
contagious bovine pleuropneumonia (4?%%), Leterinary :icrobiology, Lolume
;<, Issues A/>, %ages (*)/()(,AT 9ebruary())T
(<! LeSuin .udolf :! , Enzyme Immunoassay (EIA)7Enzyme/Linked
Immunosorbent Assay (ELI#A), 4linical 4emistry B(, Do! (A, A<<B
((! :icael #teinitz, Lea ?araz, A rapid metod for estimating te binding of
ligands to ELI#A microRells, Qournal of Immunological :etods, A8T, (>8/(B<,
A<<<
(A! :ire/#luis A!.!, +aines/5as .!, "orpe .! Qournal of Immunological
:etods, Lolume (T;, Issue A, %ages (B*/(;<, A; 1ctober ())B
(8! 1linescu A!, 5olganiuc A!, Imunologia practica 'n clinica i e0periment,
subcapitolul3 Analiza imunoenzimatica ELI#A, pg! (B8/(B*, Ed! Lia-a :edicala
.omaneasca, ?ucureti, A<<( V
(>! 1sucoRski :! 9!, .emick 5! +!, "e repetitive use of samples to measure
multiple cytokines3"e seSuential ELI#A, Methods 38, 304-311, 2006
(B! %lebani A!, Avanzinia :! A!, :assaa :! and $gazioa A!+!, An avidin/biotin
ELI#A for te measurement of serum and secretory Ig5, Qournal of
Immunological :etods, Lolume *(, Issue A, %ages (88/(><, ; Quly ()T>
(;! Wian @!, Iao 5!, et al!, Immobilization of Antibodies on $ltraflat
%olystyrene #urfaces, 4linical 4emistry >;3 (>B;/(>;8, A<<<
(*! #ato A!, Uo,ima U!, Uoyama "!, 1gaRa 6!, :atsumoto I!, Immobilization
of #accarides and %eptides on );/@ell :icrotiter %lates 4oated Rit :etyl
Linyl Eter/:aleic Anydride 4opolymer, Analytical ?iocemistry, Lolume
A;<, Issue (, %ages );/(<A, (B Qune ())T
(T! #ittampalam #!, #mit @!4!, et al!, Application of e0perimental design
tecniSues to optimize a competitive ELI#A, Qournal of Immunological
:etods, ()<, (B(/(;(, ());
()! Loller A!, ?artlett A! and ?idRell 5!E!, Enzyme immunoassays Rit special
reference to ELI#A tecniSues, Qournal of 4linical %atology,8(, B<*/BA<,
()*T
A<! @ilco de Qager, +er "! .i,kers, #olid/pase and bead/based cytokine
immunoassay3 A comparison, :etods, Lolume 8T, Issue >, %ages A)>/8<8,
April A<<;
A(! Iuzuru 6ayasi et al! , An e0pression of Ritin/plate uncertainty in
sandRic ELI#A, Qournal of %armaceutical and ?iomedical Analysis, 8;, AAB/
AA), A<<>