Fondul Social European Investeste n OAMENI!

Proiect cofinantat din Fondul Social European Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013 Axa prioritara 3. Cresterea adaptabilitatii lucratorilor si a ntreprinderilor" Domeniul major de interventie: 3.2. Formare si sprijin pentru ntreprinderi si angajati pentru promovarea adaptabilitatii

"Sistem de formare profesionala a personalului medical in domeniul noilor tehnologii din sistemul de sanatate (diagnostic molecular) "/TDM POSDRU/81/3.2/S/58819
CURS HIBRIDIZARE IN SITU SI PCR IN DIAGNOSTICUL MOLECULAR HISTOPATOLOGIC vol I
website: www.tdm-dru.ro e-mail : tdm-dru@ivb.ro Dr. Florin Zugun-E.

Preambul: Mesaje esentiale pentru abordarea investigatiilor

[0. Indicatia de explorare in situ.]

1. Cunoasterea a) aplicatiei (actualizare probabil anuala a cunostintelor/accesibilitatii), si a b) protocolului de lucru.

2. Controlul (trasabilitatea) a) probelor (primare, de investigatie), si a b) materialelor asociate (baza de date, inventarul de stocare, fisierele electronice, parametrii de procesare, medii de stocare electronica). 3. Validarea constanta (si documentarea in baza de date) a calitatii a) materialelor biologice, b) reactivilor, c) echipamentelor, d) procesarii (sesiunilor de lucru) e) documentarii.

Preambul: Mesaje esentiale pentru abordarea investigatiilor

4. Configurarea cu exactitate a intrebarii de lucru experimental, cu fixarea a) planului procedural (anticiparea consumului stocurilor!) b) identificarea datelor asteptate, c) controalelor experimentale, d) comportamentului in caz de discordante intre date, e) integrarii contextuale a datelor (curenta sau in dezvoltare).
5. Gestiunea a) atit a rezultatelor individuale, b) cit si a traseului de asamblare si utilizare finala (raport, publicatie, teza doctorala, patent).

Preambul: Mesaje esentiale pentru abordarea investigatiilor

[6. Controlul interactiei cu pacientii / beneficiarii imediati ai rezultatelor]. [7. Costuri]

Probleme principale anticipate - primar in logistica: 2.a), 3.e), 4.a), 4.d), [4.e)], 5.b).

Status curent al explorarilor moleculare

1. Cadrul general de aplicare curent - conceptul de Biologie a Sistemelor (Systems Biology)

- evocat si in scopul extinderii posibilitatilor de control (terapeutic, profilactic) dincolo de limitele inerente manierelor reductioniste (pragmatice, traditionaliste), dar si pentru facilitarea integrarii multitudinii de date furnizate de cercetarea bio-medicala recenta.

Status curent al explorarilor moleculare

2. Relationarea diagnostica (cadrul aplicatiilor clinice curente)

- Infrastructura fiziopatologica curenta evolueaza spre extinderea determinismului molecular in tot mai multe maladii (medicina moleculara).
- Modele fondatoare ale medicinei moleculare: anomalii genetice, maligne hematologice distincte.

- Semnificatiile practice imediate ale documentarii (diagnostice) lezionale la nivel molecular sint reflectate in: - tendintele de design a agentilor terapeutici (emergenti), - si nivelurile de eficienta terapeutica crescute asociate conformarii la criteriile de patologie moleculara (cu consecinta reconfigurarea / nuantarea indicatiilor terapeutice pe criterii moleculare).

Status curent al explorarilor moleculare

3. Relationarea la alte tehnici multiple conexiuni si interferente -Imunohistochimia (diagnostica oncologica, experimentala in profil de patologie, farmacologie, evaluare a noxelor) -microscopia de fluorescenta cu variantele sale -biochimia acizilor nucleici -biologia moleculara -secventierea ADN -analiza citogenetica (cariotiparea) -investigarea programelor de dezvoltare (embrionara, cicatriceala, regenerativa, tumorala) si de reactie genice, -investigarea contaminarii genice (alogenice, xenogenice)

Definitii
1) hibridizare - stare conformationala de asociere necovalenta (reversibila termic si/sau prin alterarea contextului ionic al solventului) intre 2 sau mai multe lanturi sau segmente de acizi nucleici pe sectiuni prezentind complementaritate structurala,

Relevanta in vivo este tripla: -asigurarea stabilitatii informatiei genice prin restringerea suprafetelor reactive expuse (ale nucleotidelor din componenta bazelor azotate) si accesul la situsurile caracteristice starii de duplex a unor factori moleculari dedicati (precum histonele, precum componentele proteice ale ribozomilor) -asigurarea functiei de matrita in sinteza de copii (autoreplicare; (revers-)transcriptie, translatie)

-asigurarea controlului (auto-)catalitic a homologilor aptamerici (dezoxi- si ribozime)

Definitii
Principial, hibridizarea este etapa componenta intrinseca a majoritatii tehnicilor de biologie moleculara (prototip - PCR). Caracteristic unitara a acestora din urma este insa operarea pe tinte (acizi nucleici) extrase din contextul structural originar : -organit cromozomial, ribozomial, mitocondrial; -arie de localizare nucleara sau citoplasmatica -celula din populatia de indivizi diferentiabili prin trasaturi micro-morfologice si , -zona arhitecturala tisulara.

Definitii
Prin aceasta detasare sint ignorate (compromise) relatiile privind contextul structural - cu consecinte variate in raport cu rezultatul investigarii: -fie nule, neglijabile, -eventual compensabile (prin pre-selectie ghidata LCMD a probelor, de exemplu), -fie inacceptabile (in defectele de tip translocatii echilibrate, mozaicism, sau in evaluarea heterogenitatii celulare si tisulare).

Definitii
in situ - mentinerea caracterelor: -arhitectural de organit, de specie celulara ca: diferentiere stare functionala localizare in tesut -populational (de ecosistem tisular sau biologic) ISH necesita obtinerea de material celular (prezervabil al pacientului): -gameti / blastomer / vilozitati coriale / amniocite / singe / exfoliat mucos / foliculi pilosi / fragment bioptic sau de exereza tisulara / prelevat tisular post-abort sau necroptic -variantele de cartare cromozomiala necesita (inductia in cultura celulara de) metafaze. ISH necesita controlul (empiric) interactiilor nespecifice la nivelul probelor tisulare. ISH multi-tinta necesita strategii si metode speciale de discriminare a semnalelor.

Forme de vizualizare a datelor si varietati tehnice

Analitice - metode radioactive - metode de fluorescenta microscopica clasica, de colocalizare/confocala, virtuala in citometrie de flux -metode (imuno-)enzimatice

Preparative -sortare in flux de cromozomi marcati in fluorescenta / adsorbiti specific la microbile

Glosar (nomenclatura)
1. Termeni intensiv folositi (si) in alte tehnici oligodezoxinucleotide (ODN) proba (probe) replicon plasmid clona semnal fluorocrom zgomot de fond (background) gama dinamica / contrast sisteme informatice de cautare a secventelor (genomic browsers)

2. Termeni cu relevanta si nuante particulare in ISH (ex: chromosome paints)

Glosar (nomenclatura)
1. Termeni intensiv folositi in alte tehnici (ex: proba) 2. Termeni cu relevanta si nuante particulare in ISH (ex: chromosome paints) probe BAC probe YAC probe PNA fiber-FISH / quantitative DNA fiber mapping (QDFM) m-FISH SKY cariotipare spectrala chromosome paints COT secvente repetitive telomerice secvente repetitive centromerice

Scurta actualizare a elementelor de genetica

Acizii nucleici - suport esential al codarii (pastrarii), utilizarii si transmiterii informatiei genetice (* prioni)

Biopolimeri (poli-nucleotide; >>13 nucleotide; ~20bp-25 - small interfering RNA - 247Mbp hu chr.1).

Molecule polare (lineare; capete 5, 3), hidrosolubile, a caror configuratie permite interactii hibridizante (cuplante antisens) bazate pe legaturi de hidrogen (seturi de 3, pentru bazele purinice, sau de 2, pentru cele pirimidinice constituente).

Scurta actualizare a elementelor de genetica

bazele azotate (N): purinice (R): guanina, adenina; pirimidinice (Y): citozina, timidina (DNA), uracil (RNA) (conventie: atomii de carbon sint notati fara sufix)

cuplate (legatura glicozidica) la carbonul 1 al pentozei (conventie: atomii de carbon notati cu sufix): riboza sau 2deoxiriboza - (nucleozide)

Scurta actualizare a elementelor de genetica

Atasarea de grupari fosfat (la atomii de oxigen ai zaharului; confera electronegativitate pronuntata) -> nucleotide (mono-esteri) Oligo/polimerii de nucleotide: polimeri fosfodiesteri (lineari)

Scurta actualizare a elementelor de genetica

* variante de polimeri artificiali: PNA (Peptide Nucleic Acids; PE Nielsen, M Egholm, RH Berg, O Buchardt, 1991, substituind riboza si gruparile fosfat prin N-(2-aminoethil)-glicina (cadru peptidic), si cuplaj al bazelor prin legaturi metilen-carbonilice.

Scurta actualizare a elementelor de genetica

-gruparile hidroxil si amino libere ale bazelor azotate: legaturi de hidrogen (O-H-O; N-H-N; N-H-O), asigurind, in interactii antiparalele, hibridizarea prin complementaritatea de imperechere a bazelor. -ARN - tipic monolant, adoptind complicate structuri secundare/tertiare

Scurta actualizare a elementelor de genetica

-cromozomii: succesiune de secvente (regiunii) codante (asociind in proximitate secvente reglatorii) fragmentate de secvente intercalare - intergenice (mult mai frecvente si mai sofisticate in cromozomii eucariotici, inclusiv umani sau ai plantele cu flori); fie circulari, fie lineari (capete dedicate: telomeri, si zona mediana: centromer)

-starea nativa: asociere cu nucleoproteine (cromatina interfazica) si ARN dedicate

Scurta actualizare a elementelor de genetica

- secvente genice codante - probabil 500 la Mycoplasma genitalium (580kbp); probabil 30000 la om (3Gbp) -introni (intervening sequences) /exoni => transcripti primari ARN si splicing -pseudogene (procesate, deprivate de sectiuni intronice -monocopii, ocupind <5% spatiul genomic (locus) versus

secvente repetitive ( noncodante; tRNA; rRNA si altele) -intercalare (interspersed) sau succesive (tandem repeats) - aliniabile in raport cu tipurile de secvente originare (consensus sequences)
-25% (hu): sute-mii de copii (moderat repetitive): tRNA, rRNA LINE (long interspersed elements), probabil derivati ai unor retrovirusuri ancestrale; din familia L1 (<=7000bp, tipic insa ~900bp; capabili de retrotranspunere ) peste 20000-50000 in genomul mamifer

Scurta actualizare a elementelor de genetica

10%: sute de mii la milioane de copii (inalt repetitive) -SINE (Short Interspersed Elements): -Alu element (300bp) (clivabil la tipic 170bp proximali via Alu), care, la 300-500K copii, ocupa ~7% din genomul uman; 2 (tandem) a 130bp plus 31 orfani -diversitate de specie: la soarece (50k copii) 130bp (Alu-related B1 element) -MIR (mammalian wide interspersed repeat family), ~130bp, ~400kbp sateliti (satellite sequences) - grupaje compacte (clusters) prin multiplicare succesiva inalta (tandem repeats), centromerice si telomerice predispune la dezalinieri in meioza si crossing over inegal.

Scurta actualizare a elementelor de genetica

secventele repetitive telomerice si replicarea cromozomilor liniari eucarioti TTAGGG (tipic 20-sute) telomeraza / ligaza

Scurta actualizare a elementelor de genetica

-palindromii, structurile tip trunchi-bucla (stem-loop)

-tracturile A multiple

Scurta actualizare a elementelor de genetica

-supra-impachetarea ADN (bacterian) -gyraza versus topoizomerazele I si IV -linking number, L = T+W

Scurta actualizare a elementelor de genetica

-supra-impachetarea ADN (eucariot) histone fibre cromatide

Scurta actualizare a elementelor de genetica

-supra-impachetarea ADN (eucariot) histone fibre cromatide

Scurta actualizare a elementelor de genetica

denaturarea / renaturarea ADN * refacerea helixului dublu initial depinde de panta de racire * * o panta lenta acorda timp partenerilor pentru repozitionare conforma * * scaderea mult peste 20-25oC sub Tm precipita formarea cuplajelor de slaba complementaritate *

Scurta actualizare a elementelor de genetica

impactul micromediului asupra starii de dublu helix: - pH alcalin deprotoneaza bazele azotate; >11.3 - denaturare completa menajanta pentru legaturile glicozidice -pH acid : protonare excesiva; risc de destabilizare a legaturilor glicozidice -formamida, ureea: denaturanti -puterea ionica crescuta: stabilizare duplex -putere ionica nula (dH2O) - denaturare totala chiar la RT

Scurta actualizare a elementelor de genetica

Gama de aplicatii ale metodelor in situ

Originea tintei analizate -material constitutiv (uman, animal, vegetal, microbian) -material defectiv (asociat oncogenezei, asociat autoimunitatii) -material exogen alogenic (medicina legala, transplant) -material exogen xenogeneic (viral, bacterian, fungic, shot-gun)

Natura acidului nucleic -ADN -ARNm (splicing) -ARNt -snARN

Gama de aplicatii ale metodelor in situ

Localizare/delocalizare -in situ ARN() ADN -extracte Southern (ADN) Northern (ARN) EMSA

Aplicatii -CGH -ploidie -diagnosticul de contaminare infectioasa/alogenica -evaluarea raspunsului transcriptional la varii stimuli -evaluarea programului (si a efectului interferentelor) ontogenetic

Perspective de evolutie a metodelor in situ

-array CGH (impropriu in situ)

-miniaturizare - single cell assays

Elemente de documentare publicatii periodice manuale sesiuni aplicative (seminarii, congrese) - accesabile electronic - pagini web de referinta - biblioteci virtuale: pubmed - documentatii de firma (latenta in accesul comercial: sub 2-3 ani)

Elemente de documentare Bibliografie 1. Cadru Thomas Liehr, FISH-Application Guide, Springer-Verlag, 2009 D Clark, Molecular Biology, Elsevier, 2005 Ian A Darby, In Situ Hybridization Protocols, Second Ed., Methods in Molecular Biology 123, Humana Press Inc. Ian A Darby, TD Hewitson, In Situ Hybridization Protocols, Third Ed., Methods in Molecular Biology 326, Humana Press Inc. Vladimir V. Didenko, In Situ detection of DNA Damage, Methods in Molecular Biology 203, Humana Press Inc. Yao San Fan, Molecular Cytogenetics, in Molecular Biology 204, Humana Press Inc. John Swansonburry, Cancer Cytogenetics, in Molecular Biology 220, Humana Press Inc S Hahn, LG Jackson, Prenatal Diagnosis, in Methods Molecular Biology 444, Humana Press Inc MP Brukez, CZ Hotz, Quantum Dots, in Methods Molecular Biology 374, Humana Press Inc

Elemente de documentare Bibliografie S Zhao, M Stodolsky, Bacterial Artificial Chromosomes, Vol. 2, in Methods in Molecular Biology 256, Humana Press Inc SW Paddock, Confocal Microscopy, in Methods in Molecular Biology 122, Humana Press Inc GI Murray, Laser Capture Microdisection, in Methods in Molecular Biology 756, Humana Press Inc JM Bridger, EV Volpi, FISH, in Methods in Molecular Biology 659, Humana Press Inc TS Hawley, RG Hawley, Flow Cytometry Protocols, Second Ed., in Methods in Molecular Biology 263, Humana Press Inc Alasdair MacKenzie, YAC Protocols, in Methods Molecular Biology 349, Humana Press Inc Franck Pellestor, PRINS and in situ PCR, in Methods Molecular Biology 334, Humana Press Inc GI Murray, S Curran, Laser Capture Microdissection, in Methods Molecular Biology 293, Humana Press Inc

Elemente de documentare Bibliografie B Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 5th Ed, Garland Press, 2008 E Passarge, Color Atlas in Genetics Second Ed, Thieme, 2001 TR Robinson, Genetics for Dummies, Willey, 2005 Watson et al, Molecular Biology of the Gene, Fifth Ed, Pearson, 2004 W Goodwin et al, An Introduction to Forensic Genetics, Willey, 2007 2. Aplicatii bibliografice

Date de istoric al metodelor in situ Motorul primar al aparitiei ISH: suplimentarea datelor de cariotipare (cartarea cromozomiala genica). Premize istorice (dark ages , reviews: DFCM Smeets [2004] - ClinBiochem 37:439; BJ Trask [2002] - NatRevGen 3:769 T Liehr [2009]; TC Hsu, 1979)

1856-63 experimentele pe plante ale lui Gregor Mendel (; impact real dupa 1900)

1867 JF Miescher; nucleina ca extract alcalin dupa expunerea la sulfat a exudatului purulent

Date de istoric al metodelor in situ Motorul primar al aparitiei ISH: suplimentarea datelor de cariotipare (cartarea cromozomiala genica). Premize istorice (dark ages , reviews: 1868 C Darwin - conceptul de pangeneza si speculatia existentei de gemmule transmisibile de la parinti la urmasi ca suport al ereditatii (ulterior preluat de altii precum HdeVries)

1882, W Flemming , primele ilustratii ale cromozomilor; descrierea mitozei

Date de istoric al metodelor in situ Miza primara a aparitiei ISH: suplimentarea datelor de cariotipare (cartarea genica). Premize istorice (dark ages) 1888 W Waldayer - crearea termenului de cromozom 1880 si ulterior, T Boveri; lucrul pe arici de mare; teoriile continuitatii cromozomilor si individualitatii cromozomilor; descrie fusul de diviziune si kinetocorii;

W Roux - teoria epigenetica tip mozaic a dezvoltarii (embrioni batracieni si aviari mentinuti in conditii de cultura) sugereaza incarcarea cu informatie genetica distincta a fiecarui cromozom

Date de istoric al metodelor in situ Miza primara a aparitiei ISH: suplimentarea datelor de cariotipare (cartarea genica). Premize istorice (dark ages)

1900s HM de Vries: conceptul de pangeneza (suporturi individuale pentru fiecare dintre caracterele ereditare - particulele unitare numite pangene, ulterior redenumite de W Johannsen ca gene) si a termenului de mutatie, anticipeaza transmisia orizontala, reitereaza bazele experimentale ale lui Mendel; sugereaza existenta recombinarilor (crossover)

Date de istoric al metodelor in situ Miza primara a aparitiei ISH: suplimentarea datelor de cariotipare (cartarea genica). Premize istorice (dark ages) 1902 Archibald Garrod: inborn error of metabolism; alcaptonurie

1915 W Sutton, demonstarea suportului cromozomial al ereditatii mendeliene (teoria cromozomiala mendeliana Boveri-Sutton)

Date de istoric al metodelor in situ Miza primara a aparitiei ISH: suplimentarea datelor de cariotipare (cartarea genica). Premize istorice (dark ages)

incepind cu 1909 TH Morgan - studii de inducere a mutatiilor si validare a implicarii cromozomiale in ereditate (culoare ochi si forma aripilor in larve sexuate de Drosophila), ajungind la prima cartare genetica (1913) pe baza studiilor de inlantuire (genetic linkage) . 1915 - The Mechanisms of Mendelian Heredity; statutul de facto de organism model pentru Drosophila

Date de istoric al metodelor in situ Miza primara a aparitiei ISH: suplimentarea datelor de cariotipare (cartarea genica). Premize istorice pre-1950 neclaritati privind numarul cromozomilor umani (clarificate abia in 1955 in culturi de celule epiteliale embrionare pulmonare, Tjio )

Date de istoric al metodelor in situ Miza primara a aparitiei ISH: suplimentarea datelor de cariotipare (cartarea genica). Premize istorice 1952 TC Hsu: socul hipotonic si plajele cromozomiale metafazice 1956 CE Ford & JL Hamerton - efectul colchicinei asupra fusului mitotic clasificarea pe grupe a cromozomilor (A-G, + cromozomii de sex)

Date de istoric al metodelor in situ potrivit standardelor actuale, metodele relativ rudimentare disponibile au generat rapoarte al caror ecou continua si in prezent: trizomia 21 (Down) 1959 45, X (Turner) 1959 47, XXY (Klinefelter) 1959 trizomia 13 1960 trizomia 18 1960 cromozomul Philadelphia 1960 (1973 - descrierea consecintei efectorii a fuzatului BCR-ABL) Cri du Chat (del 5p) 1966 deletie a bratului lung al unui cromozom D in retinoblastom bilateral (1967), argument important in sustinerea ipotezei Knudson (Knudsons Double Hit in oncogenesis, Cavenee 1983) (implicind pierderea unei alele a genei gena RB, 13q14 , asociata unei mutatii suplimentare)

Date de istoric al metodelor in situ

defecte grosiere centromerice ale cromozomului 1 au permis alocarea pozitiei genei raspunzatoare pentru grupul sanghin Duffy 1968 (Donahue, PNAS 1968)

1966 Steele & Breg: cultura de amniocite in diagnosticul citogenetic fetal extensia investigatiei citogenetice in avort: anomalii de ploidie in peste 50% avorturi extrem de frecvente anomalii asociate cu meioza baza diagnosticului prenatal curent

Date de istoric al metodelor in situ

1971 - Standardization in Human Cytogenetics: Birth Defects. Paris Conference; Cytokenetics 11:313 (1972); ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) cen (centromer); ter (terminal structure, telomere), p (petit), q (queue)

precedentele metodologii: solid chromosomial staining

Date de istoric al metodelor in situ Premize moderne: tehnicile de bandare cromozomiala, normala (standard): Q-banding, Dr. Lore Zeck (Torbjorn Caspersson, 1968, 1971) colorare fluorescenta cu quinacrina (quencing!) Chromosomal BARCODE ulterior G-, R-, C-, NOR-banding) rezolutia : 500 benzi per genom 6Mbp ~50 gene per banda

Date de istoric al metodelor in situ Premize moderne: tehnicile de bandare cromozomiala, si de inalta rezolutie (Yunis, 1983) sincronizare a limfocitelor in cultura: ~1000 benzi

Date de istoric al metodelor in situ Premize moderne: tehnicile de bandare cromozomiala permit revelarea defectelor cromozomilor mici, micro-deletiilor, de contiguitate genica sindromul Prader Willi - Angelman (deletie in 15p) Smith-Magenis, Miller-Dieker (deletie in 17p) DiGeorge/Velo Cardio Facial (VCF) (deletii in 22q)

Date de istoric al metodelor in situ Premize moderne: tehnicile de bandare cromozomiala, permitind inclusiv ameliorarea (si standardizarea) diagnosticului in genetica si constituirea motivatiilor de explorare secventiala extinsa a materialului genetic.

Date de istoric al metodelor in situ -citogenetica imagistica clasica : in uz indefinit

-anii 1970: presiunea competitiva a descrierilor defectelor moleculare

1965 somatic cell hibrids (Ephrussi + Weiss, PNAS) ca surse de referinta cu material genic hibridant fie cromozomial, fie fragmentar, inclusiv cu origine maladiva

Date de istoric al metodelor in situ

Rapoarte primare pentru in situ prin detectie radioactiva:

Gall + Pardue (1969), hibridizare a ARNr tritiat la tinte genomice in frotiuri de oocite de Xenopus, si detectie autoradiografica;

John HA & (1969)

Date de istoric al metodelor in situ

Introducerea marcajului fluorescent al tintelor: etapa moleculara a citogeneticii Pinkel D et al, PNAS 1986

Date de istoric al metodelor in situ

Elementul esential: introducerea marcarilor (de tip biotinic) si a controlului via nick-translation, PR Langer (PNAS, 1981) - constituirea aplicatiilor de tip FISH

Date de istoric al metodelor in situ

aplicatiile de sortaj in citometrie de flux (anii 1990)

ulterior extinse la marcaje tintite multispectrale,

Date de istoric al metodelor in situ

ameliorarea sensibilitatii si rafinamente ulterioare: hibridizari multicolore Schrock & 1996; Speicher & , 1996 Luke & Shepelsky, 1998 Csaki & , 2007

ameliorarea calitatii achizitiei in epifluorescenta, a contrastului in microscopia confocala (inventata de Marvin Minsky, 1955)

Date de istoric al metodelor in situ tehnica PRINS (primed in situ labeling, Koch 1989, 1995), limitata insa la detectia de tinte repetitive

reverse chromosome banding (RCP, Carter , 1992) chromosomal-specific banding (Liehr, 2006) multispectral / multicolor / multiprobe FISH CISH,

Date de istoric al metodelor in situ in paralel emergentei tehnicilor de tip array

Comparatii intre tehnicile tip FISH (Liehr & Pellestor, 2009)

Comparatii intre tehnicile tip FISH (Liehr & Pellestor, 2009)

Comparatii intre tehnicile tip FISH (Liehr & Pellestor, 2009)

Elementele protocolului FISH - vizualizare Luminiscenta: emisia de fotoni de catre specii de electroni aflati in stare excitata. Termen introdus in 1888 de Eilhardt Wiedemann pentru a caracteriza fenomenele emisive distincte de incandescenta (incalzire). Materia capabila de liminiscenta poate fi variata: inorganica (UO2+, Eu+3, Tb+3, sticla dopata cu metale precum Mn, Ce, Cu, Ag), cristale (ZnS, CdS, ZnSe), sau organica (compusi continind nuclee aromatice precum naftalina, antracen, phenantren; fluoresceina, rodamina, oxazine, aminoacizi (triptofan, tirozina, fenilalanina) Instante: radioluminiscenta luminiscenta catodica chemiluminiscenta bioluminiscenta triboluminiscenta fotoluminiscenta (fluorescenta, fluorescenta intirziata, fosforescenta)

Elementele protocolului FISH - vizualizare - termenii (fluorescenta / fosforescenta) au fost separati urmare a disputei experimentale dintre Edmond Becquerel (1842) si Stokes (1852), care au descris emisia luminoasa secundara expunerii la lumina solara a sulfidului de calciu si respectiv a sulfatului de chinina. - intelegerea mecanismelor acestor fenomene a fost conditionata de clarificarea comportamentului cuantic al componentilor atomici. -importanta curenta a fluorocromilor este data atit de comportamentul lor special in raport cu cuantele de energie, dar si de maniera in care vecinatatile moleculare le pot influenta proprietatile. [Bernard Valeur, 2002]

Elementele protocolului FISH - vizualizare Formal, probele fluorescente sint clasificabile in 3 grupe: probe intrinseci (relativ rare - precum triptofanul) probe extrinseci legate covalent (a caror pozitionare poate fi cunoscuta) probe asociabile extrinsec.

Elementele protocolului FISH - vizualizare - atasarea la (functionalizarea) tinte de tipul proteinelor (protein tagging) poate avea varii solutii: via animo (izotiocianati, derivati de clorotriazinil, esteri hidroxisuccinimidici) via sulfidril (cu grupuri iodoacetamidice si maleimidice). - natura micromediului (si a structurii interne) probei conditioneaza plaja de comportamente ale acesteia in raport cu interactia fotonica.

Elementele protocolului FISH - vizualizare

Elementele protocolului FISH - vizualizare - din perspectiva interesului de detectie in interactiunile acizilor nucleici, o diversitate rezonabila de fluorocromi pot fi disponibili si pot fi cuplati acestora - unii sint de interes pentru capacitatea de a raporta interactii de spatialitate (tehnici de tip real time) - fluorocromii comuni utili in marcajul hibridizarilor de captura :

Elementele protocolului FISH - vizualizare detectia eficienta a acestora presupune sisteme optice selective si performante

Elementele protocolului FISH - vizualizare detectia eficienta a acestora presupune sisteme optice selective si performante

Elementele protocolului FISH - vizualizare Elementele de filtrare disponibile (inclusiv dicroicul) sint configurabile in raport cu aplicatiile programate.

Elementele protocolului FISH - vizualizare Determinarile de tip multiplex utilizeaza strategii de alocare a reactivitatii care maximizeaza rezolutia de identificare a tintelor - cazul cariotiparii multicromozomile.

Elementele protocolului FISH - vizualizare Detectia si identificarea sint asigurabile la nivel informatic - fiind insa posibila utilizarea unor artificii de reprezentare pentru a face posibila analiza vizuala (pseudoculoarea) [M Sommerauer, 2009]

Elementele protocolului FISH - vizualizare Detectia si identificarea sint asigurabile la nivel informatic - fiind insa posibila utilizarea unor artificii de reprezentare pentru a face posibila analiza vizuala (pseudoculoarea)

Elementele protocolului FISH - vizualizare Detectia si identificarea sint asigurabile la nivel informatic - fiind insa posibila utilizarea unor artificii de reprezentare pentru a face posibila analiza vizuala (pseudoculoarea)

Elementele protocolului FISH - vizualizare Detectia si identificarea sint asigurabile la nivel informatic - fiind insa posibila utilizarea unor artificii de reprezentare pentru a face posibila analiza vizuala (pseudoculoarea)

Elementele protocolului FISH - vizualizare Aplicatiile restrinse (precum identificarea unui numar limitat de tinte, tipic 1 specie de secventa tinta, si 1 singur plasament cromozomial) pot fi relativ comod realizate in conditii modeste (3 fluorescente)

Variante uzuale ISH - protocoale

1. FISH in tesut arhivat in parafina BM Sumergill, 2010

-macheta procedurala

Variante uzuale ISH - protocoale

1. FISH in tesut arhivat in parafina BM Sumergill, 2010

-rezultate in investigatiile tip tissue array

Variante uzuale ISH - protocoale

2. analiza comparativa CISH-FISH (a) ref: T Garcia-Caballero, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

2. analiza comparativa CISH-FISH (a) ref: T Garcia-Caballero, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

2. analiza comparativa CISH - FISH(a) ref: T Garcia-Caballero, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

2. analiza comparativa CISH - FISH(a) ref: T Garcia-Caballero, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

2. analiza comparativa CISH - FISH (a) ref: T Garcia-Caballero, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

2. analiza comparativa CISH - FISH (a) ref: T Garcia-Caballero, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

2. analiza comparativa CISH-FISH (a) ref: T Garcia-Caballero, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

2. analiza comparativa CISH-FISH (b) ref: V Arena, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (a) ref: FAlbano

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (a) ref: FAlbano

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (a) ref: FAlbano

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (a) ref: FAlbano

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (a) ref: FAlbano

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (a) ref: FAlbano

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (a) ref: FAlbano

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (b) ref 5: M Jaras, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (b) ref 5: M Jaras, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (b) ref 5: M Jaras, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (b) ref 5: M Jaras, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (b) ref 5: M Jaras, 2010

Variante uzuale ISH - protocoale

3. FISH in oncohematologie (b) ref 5: M Jaras, 2010

Protocoale de ISH particulare

1 Caracterizare mozaicism in frotiuri celulare

ref 1: KMrasek, 2009, mozaicism constitutiv

-miza: definirea impactului heterogenitatii somatice asupra prognosticului si manifestarilor clinice - surse de celule multiple (singe, epiteliu bucal, foliculi pilosi, epiteliu urinar) -variata: FISH Elemente: -prelevare probe celulare -preprocesare lame -hibridizare -tratament post-hibridizare -evaluare microscopica

Protocoale de ISH particulare

1 Caracterizare mozaicism in frotiuri celulare

ref 1: KMrasek, 2009

Protocoale de ISH particulare

2 investigarea gametilor

ref 2: MO Bonet, 2009

motivatii: frecventa afectiunilor (infertilitate) conditiile particulare ale protocolului de lucru

detalii macheta protocolului de lucru

Protocoale de ISH particulare

2 investigarea gametilor

ref 2: MO Bonet, 2009

particularitati de procedura pentru: procesarea materialului sursa (celule, fragment bioptic gonadal) reactivii de spalare conditiile de decondensare regimul de fixare, tratamentul post-fixare procesarea frotiurilor regimul de hibridizare, contracolorare evaluarea marcarii

Protocoale de ISH particulare

3 analizele multiplex (a)

ref 3: T Liehr, 2009

motivatii: complexitatea tehnica distincta existenta de platforme de investigatie competitive (analizate: M-FISH si SKY) cu documentarea realizata in cadrul unui consortiu potentialul pentru diagnostic (aplicatia: cariotipare spectrala in leucemii) varianta: 5 culori

Protocoale de ISH particulare

3 analizele multiplex (a)

ref 3: T Liehr, 2009

tipurile de rezultate imagistice:

Protocoale de ISH particulare

4 analizele multiplex (b)

ref 4: KM Greulich-Bode, 2009

motivatie: documentarea parametrilor de procesare si utilizarea unei linii de referinta

Protocoale de ISH particulare

5 probe PNA

ref 5: L Cerguieira 2011, BMC Microbiol

motivatie: potentialul diagnostic important al metodologiei

Protocoale de ISH particulare

5 probe PNA

ref 5: L Cerguieira 2011

Protocoale de ISH particulare

6 metode citometrice

ref 6: KJ Robertson 2010 motivatie: accesibilitatea metodei potentialul diagnostic

Protocoale de ISH particulare

6 metode citometrice

ref 6: KJ Robertson 2010

Protocoale de ISH particulare

6 metode citometrice

ref 6: KJ Robertson 2010

Protocoale de ISH particulare

6 metode citometrice

ref 6: KJ Robertson 2010

Protocoale de ISH particulare

6 metode citometrice (b)

ref 7: G Coquillard 2009, SUSHI motivatie: potentialul aplicativ

Protocoale de ISH particulare

6 metode citometrice (b)

ref 7: G Coquillard 2009, SUSHI

Protocoale de ISH particulare

6 metode citometrice (b)

ref 7: G Coquillard 2009, SUSHI

Protocoale de ISH particulare

6 metode citometrice (b)

ref 7: G Coquillard 2009, SUSHI

Protocoale de ISH particulare

6 metode citometrice (b)

ref 7: G Coquillard 2009, SUSHI

Protocoale de ISH particulare

6 metode citometrice (b)

ref 7: G Coquillard 2009, SUSHI

Protocoale de ISH particulare

6 diagnosticul preimplantare

ref 8: NR Treff, 2010

motivatie: revelarea limitelor indicatiei metodologice

Protocoale de ISH particulare

6 diagnosticul preimplantare

ref 8: NR Treff, 2010

motivatie: revelarea limitelor indicatiei metodologice

Protocoale de ISH particulare

6 diagnosticul preimplantare

ref 8: NR Treff, 2010

motivatie: revelarea limitelor indicatiei metodologice

Protocoale de ISH particulare

6 diagnosticul preimplantare

ref 8: NR Treff, 2010

motivatie: revelarea limitelor indicatiei metodologice

LCMD - protocoale
Atit natura distribuita a proceselor biologice - fie asigurate de aparate biomoleculare dedicate, desfasurabile diferentiat, adesea in varii vecinatati de situsuri biologice, fie indeplinite de indivizi celulari distincti, angajati in varii parteneriate celulare, cit si performantele de sensibilitate ridicate furnizate prin tehnicile moleculare (susceptibile la bruiajul dat de diversi contaminanti) pot reclama tehnici de izolare, de extractie selectiva din volumul heterogen de proba a tintelor. Confidenta multor tehnici de exploare este in mod implicit asigurata prin selectia si pretratamente ale probelor.

In varianta lor extrema, aceste tratamente se constituie in tehnici distincte (precum sortarea in flux, in mediu magnetic, si altele) cu volum de lucru inalt (! micropipete/ micromanipulatoare)

LCMD - protocoale
scurt istoric

- anii 70: tentative de raclare artizanala (Lowry and Passoneau) - 1993 : dezintegrare UV- mediata sub protectie cromatica (Shibata), limitata doar la degradarea ADN
- 1990 : Dr. Emmert-Buck, NIH, Bethesda ML - prototip (IR) extins comercial (si in prezent) ca PixCell (Arcturus Engineering, Sunnyvale CA) - motor in cancer genome anatomy project (CGAP). Ulterior: IR+UV (Veritas, Arcturus) -PixCell II: IR, aderenta activata la membrane de ethylene vinyl acetate (EVA) prin expunere la pulsuri IR de energie joasa, 6mm plasata in capacul unui tub Eppendorf transiluminat de laser; imobilizare via vacuum a preparatului histologic. Spot: 7.5microni.

LCMD - protocoale

-PixCell II: parametri laser:

100-1mW; pulsuri 0.5 - 5ms spatiate la 2microsecunde; regim termic in membrana: 90oC pentru citeva milisecunde

variatii precum geometrie de captura tip intra-cilindru

LCMD - protocoale
Laser Capture/Assisted Microdissection (LCM) este un subtip microscopic de tehnica de izolare si colectare din probe celulare sau tisulare heterogene de material biologic (populatie de organite, de specii celulare sau spatiu extracelular) cu destinatie analitica - (q)RT-/-PCR, bloturi, spectroscopie de masa - in maniera minim disruptiva, comoda, si compatibila cu marcaje pentru discriminarea tintelor de selectie.

Un set de 4 elemente sint asigurate: - inspectarea (vizual / in IF) cimpul microscopic in vederea delimitarii de granite de separare (elements) in jurul tintelor etalate pe suprafata de acces - detasarea (formal prin disruperea materialului de suport) insulele de selectie - colectarea fragmentele de decupare (fie in maniera balistica, fie pasiva gravitationala) in microeprubete distincte - documentarea etapelor de executie in sistem informatic.

LCMD - protocoale
Platforme tehnice de lucru

- mediu de lucru: -membrane de etalare (frotiu / microsectiune obtinuta criogenic* sau in parafina) -vase de cultura*
- microscop: fie inversat*, fie drept (upright)*

- sistem de decupaj (/ catapultare*): foto-disruptie UV (eventual si IR). Impropriu - ac de raclare piezoelectric

LCMD - protocoale
Tipuri:

PALM (curent Zeiss: PALM MicroBeam, PALM MicroTweezers) - catapultare

Leica (LMD6500 - LMD7000) - gravitational MicroDevices (ArcturusXT)

Molecular Machines & Industries (mmI CellCut Plus si mmI SmartCut Plus)
[Eppendorf, piezzo]

[acces video]

LCMD - protocoale
fixatori formaldehida compatibila cu analize la scala de ~ 200bp ADN morfologie standard; utilizare arhivate interferente neglijabile in regimul de fotosectionare etanolul relativ protectiv pentru ARN uscarea asociata poate afecta decuparea

criopreparate degradari moleculare minime, dar distorsiuni morfologice

volum: optim 5microni - 12 microni

contracolorare: HE, methylen blue, Wright-Giemsa, toluidine blue relativ anodine ! tehnologie inca in dezvoltare!

LCMD - protocoale
! tehnologie inca in dezvoltare!

- replicate (cu procesare deliberat diferentiata)

- inocuitatea pentru tintele nonutilizate justifica conservarea post-utilizare primara a probelor

rapoarte existente: analiza clonalitatii prin evaluarea inactivarii cromozomului X, hipermetilarii de promoteri, RFLP, statusului mutational p53, K-RAS LOH in tumori endocrine

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 1: ref GI Murray, Humana Press, 2011 Laser Microdissection for Gene Expression Profiles, Ch2, LA Field, DCIS, Breast

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 1: ref GI Murray, Humana Press, 2011 Laser Microdissection for Gene Expression Profiles, Ch2, LA Field, DCIS, Breast

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 1: ref GI Murray, Humana Press, 2011 Laser Microdissection for Gene Expression Profiles, Ch2, LA Field, DCIS, Breast

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 1: ref GI Murray, Humana Press, 2011 Laser Microdissection for Gene Expression Profiles, Ch2, LA Field, DCIS, Breast

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 2: ref GI Murray, Humana Press, 2011 Laser Microdissection for Gene Expression Profiles, Ch13, PA Meithner, PFFE Gastrointestinal

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 2: ref GI Murray, Humana Press, 2011 Laser Microdissection for Gene Expression Profiles, Ch13, PA Meithner, PFFE Gastrointestinal

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 2: ref GI Murray, Humana Press, 2011 Laser Microdissection for Gene Expression Profiles, Ch13, PA Meithner, PFFE Gastrointestinal

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 3: ref Rhoden JCEM 2006

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 3: ref Rhoden JCEM 2006

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 3: ref Rhoden JCEM 2006

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 3: ref Rhoden JCEM 2006

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 3: ref Rhoden JCEM 2006

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 3: ref Rhoden JCEM 2006

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 3: ref Rhoden JCEM 2006

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 4: ref Natsuizaka Carcinogenesis 2010

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 4: ref Natsuizaka Carcinogenesis 2010

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 4: ref Natsuizaka Carcinogenesis 2010

LCMD - protocoale
Analiza de protocol

Protocol 4: ref Natsuizaka Carcinogenesis 2010

Concluzii

- performantele evaluarilor ISH intr-o gama mai mult sau mai putin restrinsa de instante sint fezabile / accesibile in cadrul laboratoarelor din centre regionale.

- elemente esentiale: kiturile de lucru, seturile tinta de diagnostice / aplicatie.