Replicarea ADN

CE ESTE REPLICAREA ADN?

Biosinteza ADN
Are loc astfel nct s fie asigurat
stabilitatea genetic n organism i n
cadrul speciei (este o modalitate
specific de biosintez care permite
conservarea i transmiterea informaiei
genetice de la o generaie la alta).
Cnd i unde are loc replicarea ADN?



Faza S a ciclului
celular
Nucleu
Mitosis
-prophase
-metaphase
-anaphase
-telophase
G
1
G
2
S
phase
interphase
La eucariote replicare are loc doar n faza S, de sintez, a ciclului
celular, faza separat de faza mitotic M prin perioadele de gol
(gap) sintetic G1 i G2.
REPLICAREA ADN PE SCURT
Dublul helix al ADN se desface i se
construiesc pe fiecare dintre cele dou
catene parentale (numite catene matri
sau template) cte o caten complementar
replica celor parentale.
Replicarea cu ceva mai multe detalii
1. Dublul helix se desface.
2. La jonciunea dintre cele dou
catene parentale desfcute ia
natere bifurcaia de replicare.

3. O nou caten se formeaz prin
mperecherea nucleotidelor libere
cu bazele complementare de pe
catena veche.

4. Rezult dou molecule-fiice
de ADN care conin cte o caten
Parental i o caten nou.
1. semi-conservativ
2. complet
3. bi-direcional (dei are loc ntotdeauna n
direcia 5 3 !!!)
4. semi-discontinu
CARACTERISTICILE REPLICARII ADN
1. Replicarea ADN este semi-conservativ
(Meselson-Stahl, 1958).
Fiecare molecul
fiic de ADN conine
o caten parental
intact asociat cu o
caten nou
sintetizat.

Meselson & Stahls Famous Experiment (1958)
2. Replication este complet
Replicarea ADN antreneaz ntregul
cromozom, rezultand doi cromozomi
identici.
Cromozom circular
(procariote)
3. Replicarea ADN este bi-direcional
(Cairns, 1963).

Replicarea ncepe ntr-un punct bine
determinat numit origine de replicare (ori) i
pornind din acest punct se deruleaz simultan
n ambele direcii.
bidirecional
4. Replicarea este semi-discontinu

Reiji Okazaki a propus i demonstrat n 1968 c n timp ce sinteza
unei catene (catena leading) este continu, sinteza celei de-a doua
catene (catena lagging ) este discontinu (n runde de 150-250 nt).
ntrebare:
Urmtoarele afirmaii n ceea ce privete
replicarea ADN sunt corecte:
1. Replicarea se realizeaz pe anumite poriuni din
cromozom.
2. Sinteza ADN pe catena lagging este continu.
3. Fiecare moleucl fiic de ADN conine dou
catene nou sintetizate.
4. Fiecare caten a ADNdc acioneaz ca
matri/template pentru o nou caten de ADN.


Elementele eseniale necesare
replicrii
Sunt necesare cinci elemente esniale :

1. ADN parental- matria (fiecare caten de ADN
servete ca matri)
2. cele 4 dezoxiribonucleozid trifosfai dNTP (dATP,
dGTP, dTTP, dCTP)
3. cele 4 ribonucleozid trifosfai NTP (ATP, GTP,
UTP, CTP); aceasta sugereaz necesitatea sintezei
de ARN n cursul sintezei de ADN!!!
4. Proteine specifice, majoritatea enzime
5. Mg2+

Proteine specifice implicate n replicare
Proteina Funcia
Helicaza Desface dublul helix ADN
Single-stranding
binding proteins (SSB)
Stabilizeaz ADNmc i previn renaturarea lui (refacerea
dublu helixului)
Topoisomeraze Elimin torsiunile produse de helicaz printr-un
mecanism de tiere-coasere
ADN primaza Iniiaz sinteza ARN (!!!) primer
ADN polimeraze -ADN
dependente
Polimerizarea dezoxiribonucleotidelor folosind matria
de ADN
ADN ligaza Leag fragmentele de ADN nou sintetizate
Enzimele implicate n replicarea ADN
Helicase desface
dublu helix
SSB stabilizeaz
ADNmc
ADN polimeraza III
leag nucleotidele
pt. a forma noul ADN
Ligaza leag /coase
fragmentele de ADN
(frag. Okazaki).
Primaza sintetizeaz
un ARN primer pe
matri de ADN
ADN polimeraza I
(exonucleaza)
nlocuiete ARN primer
cu ADN
Helicaza desface dublul helix
Proteina DnaB
Hexamer
Catalizeaz un fel de denaturare in vivo a
ADN (catenele dezrsucite pot fi citite de
ctre enzimele replicrii)
necesit energie; consum 2 molecule de
ATP per 2 legturi de hidrogen desfcute.
Single stranded proteins (SSBs)
Tetramer
Se leag de cele dou catene ADN i le
menine separate prevenind renaturarea lor
Trebuie s fie ndepartate nainte ca noua
caten de ADN s poat fi sintetizat
Topoisomerazele
enzime care rezolv tensiunile sterice
(torsiuni +, de dreapta) aprute n cursul
dezrsucirii (cu o vitez de 100 revoluii/sec
!!!) duplexului ADN, i care ar putea bloca
replicarea
Clase de topoizomeraze: topoizomeraza I
acioneaz ca o endonucleaz reversibil, printr-un mecanism
de tiere-coasere care permite rotaia liber a ADNmc (aciune
de suveic) .
economic (nu necesit aport energetic): hidrolizeaz o
legtur fosfat diesteric a crei energie o conserv ntr-o legtur
fosfat esteric implicnd Tyr din centrul activ al enzimei i
ulterior o folosete la refacerea catenei incizate


Enzima
ADN
Enzima
tiere
relaxare
coasere
Clase de topoizomeraze: topoizomeraza II
ADN-giraza
Dimer
Introduce n molecula de ADN supertorsiuni (-
), spre stnga, n sens contrar celor create de
naintarea bifurcaiei de replicare; astfel
compeseaz n avans constrngerile impuse de
desrsucirea duplexului de ADN
Necesit energie (consum de ATP)





ADN polimerazele-ADN dependente:
Copiaz catena matri n direcia 3 5

Sintetizeaz catena nou n direcia 5 3: formeaz legturi
fosfat diesterice ntre dou dNTP vecine dictate de template, prin atacul
nucleofil realizat de ctre gruparea 3-OH al primului nucleotid asupra gruprii
fosfat din dNTP urmtor)

Necesit un primer deoerece nu poate initia sinteza unei catene noi (ARN-
ul sintetizat de primaz servete drept primer)

AUTO-CONTROL: Au activitate 3' -> 5' exonucleazic, care st la baza
capacitii de autocontrol sau de PROOF-READING: desface nucleotidele
greit mperecheiate de la captul 3 al catenei n cretere.

PROCESIVITATE (Procesivitatea este capacitatea polimerazei de a se menine
legat de matri; este o expresie a numrului de nucleotide adugate la lanul
ADN n cretere nainte ca polimeraza s se disocieze de matir)

P
P
P
P
P
P
P
P
P P
CH
2

CH
2

CH
2

OH
OH
O
O
O
Base
Base
Base
CH
2

CH
2

CH
2

OH
O
O
O
Base
Base
Base
Cap 5'
Cap 3 (n cretere)
3'
5'
3'
H
2
0
+
REACTIA CATALIZAT DE ADN POLIMERAZ
Piro-
fosfat
Clase ADN polimeraze -ADN
dependente:
procariote:
ADN pol I, II, III, IV, V

eucariote:
- ADN pol , , , ,

Proprietile ADN polimerazelor la procariote
ADN polimeraza I II III
Gena Pol A Pol B Pol C
Nr. subuniti 1 >4 >10
Activitate exonucleazic (3' -> 5')
sau proofreading?
da da da
Activitate exonucleazic 5' -> 3'? da nu nu
Viteza polimerizrii (nucleotide
adugate/sec)
16-20 5-10 250-1000
Procesivitatea (nucleotide
adugate nainte de disociere)
mic
(3-200)
mare
(10,000)

foarte mare
(500,000)

Este ADN polimeraza I
polimeraza replicativ principal?
DNA polimeraza I nu este
polimeraza replicativ principal!
Enzima este prea lent!

ADN polimeraza I catalieaz ncorporarea dNTP cu o vitez maxim de 20
nt/sec: ar avea nevoie de 53 zile pentru a replica integral cromozomul E. coli,
care n realitate se divide la fiecare 20 min.

Enzima nu este suficient de procesiv.

Enzima este prea abundent.

Exist aproxiamtiv 400 molecule de ADN polimeraza I per celul E. coli i
doar 2 bifurcaii de replicare per celul.


Celulele prezentnd mutaii polA1 sunt viabile.
DNA polimeraza III este
polimeraza replicativ

Proprietile ADN pol III sunt potrivite pentru o
enzim care deine un rol central n replicarea
ADN: are o procesivitate foarte mare i
catalizeaz polimerizarea la o vitez foarte
nalt (250-1000 nt/sec).
Sinteza catenei leading.
Care este rolul ADN polimerazei I ?
La ce folosete activitatea 5-
3exonucleozic, specific
acestei polimeraze?

La ce folosete activitatea
polimerazic a ADN pol I ?


ndeprtarea primerului de la
captul 5 al lanului n
cretere

Sinteza catenei lagging,
nlocuirea cu dNTP a locului
lsat liber de primer i
repararea leziunilor ADN (ex.
leag dNTP pe locul liber
aprut dup ndeprtarea baze
greit mperechiate)

ADN polimerazele la procariote
(continuare)
ADN pol II este implicat n reparea leziunilor ADN (are activitate
3' -> 5 exonucleazic.

ADN pol IV
- Pol IV este o ADN polimeraz predispus la erori de mperechere
(nu are activitate de proof-reading ca la pol III, pol II i pol I)
- Pol IV este responsibil de 50% din mutaiile adaptative.

ADN pol V
- Pol V aparine unei ci speciale de reparare (un fel de ultima
barier) denumit calea SOS de reparare a ADN.
- Pol V este sintetizat cnd celula este expus la doze mari de
radiaii sau de mutageni, cnd pot s apar lez. majore ADN.

Proprietile ADN polimerazelor la eucariote
ADN pol
localizare nucleu nucleu mitocondrie nucleu nucleu
funcie nlocuire
primer

Sinteza
catena
lagging
reparare sinteza ADN
mitocondrial
Replicaza


Sinteza
caten
leading
reparare
similaritate
cu enzime
de la
procariote
Pol I Pol II Pol II Pol III Pol II
Primaza:
- Sintetizeaz
oligoribonucleotidul
(ARN primer) iniial
pe care se ataeaz
ADN polimeraza.

- ARN primer este
format din 4-12
ribonucleotide.

- Noua caten de ADN
se constuiete prin
adugarea de
nucelotide la captul 3
al ARN primer.

- ARN primer e nlocuit
n final cu ADN.
ntrebare:
ADN polimeraza:
A. Initiaz sinteza lanului polinucleotidic
B. Sintetizeaz un lan polinucleotidic n diercia 3- 5
C. Citete matria de ADN n direcia 5- 3
D. Produce cte o molecul de pirofosfat la adugarea
fiecrei nucleotide la catena n cretere.


ETAPELE REPLICRII ADN
(i elementele-cheie ale fiecrei etape)
Iniierea: primozomul- un complex de proteine
i originea replicrii ori

Elongarea: replizomul- un complex de proteine,
asociate cu ADN cu rol n sinteza
catenelor noi de ADN
Terminarea: proteina Tus- situsul de
terminare ter

REPLICAREA ADN LA
PROCARIOTE
1. INIIEREA

controleaz ntregul proces de
replicare!
Iniierea replicrii
Identificarea originii de
replicare

Dezrsucirea mediat de
ctre helicaz (denaturarea)
duplexului ADN cu fomarea
ADNmc i a bifurcaiilor de
replicare


Legarea SSB la ADNmc


Formarea primozomului
(conine i primaza)

Sinteza ARN primer
Originea replicrii
5
3
3
5
5
5
3
3
5
5
3
3
5
5
3
3
5
5
3
3
3 5
3 5
Originea replicrii
Originea replicrii
(oriC) este o regiune de
245 perechi baze bogat
n AT
OriC este recunoscut
de ctre proteina dnaA
care se leag la oriC, i
care mpreun cu
proteina dnaB (helicaza)
desface ADNdc
(folosind ATP).
oriC
Primozomul
- elementul cheie al iniierii-
Primozomul este un complex de proteine care este
format din:
- dnaB (helicaz)
- dnaC (aperon al dnaB: asist plicaturarea dnaB)
- primaza
- alte proteine
Primozomul se deplaseaz mpreun cu
bifurcauia de replicare, consumnd ATP
Primozomul este responsabil pentru sinteza ARN
primer.

2. ETAPA DE ELONGARE
Etapa de elongare
5
5
3
3
5
3
5
5
5
3
3
3
3 5
3 5
-Sinteza de ADN prin adugarea de dezoxiribonucleotide (una cte
una) iniial la captul 3 al ARN primer, ulterior la captul 3 end
al catenei n cretere.
Etapa de elongare
-Catena parental 3- 5 (care este citit n aceei direcie cu
deplasarea bifurcaiei de replicare) este copiat continu.
-Catena nou astfel sintetizat este catena leading.

Etapa de elongare
-Catena parental 5- 3 (care este citit n direcie opus fa de
deplasarea bifurcaiei de replicare) este copiat discontinu.
Catena nou astfel sintetizat este catena lagging i este sintetizat
n fragmente mici (1fragment per rund sintez)-fragmentele Okazaki
Replizomul
- elementul cheie al elongarii-
complex de proteins care cuprinde toate
enzimele i factorii necesari replicrii ADN.
Probabil ataat de membrana nuclear, iar
ADN ar strbate replizomul.
este responsibil pentru sinteza a dou catene
noi de ADN.

Leading Strand
Laging Strand
3
5
3
5
Schema etapelor de iniiere i elongare
5
5
5
3
3
5
3
3
5
Single strand
binding
proteins
DNA
Polymerase
Okazaki
fragment
RNA
Primers
Primase
5
3
5
Helicase
3. ETAPA DE TERMINARE
Terminarea replicrii
Regiunea de terminare :
- situat la 180 grade fa de ori;
conine capcane petur bifurcaia
de replicare
- la acest nivel bifurcaiile de
replicare se ntlnesc i dezleag
catenele de ADN nc asociate.

Situsurile de terminare
- sunt pori care permit trecerea
bifurcaiei de replicare ntr-un
singur sens;
- conin 23 perechi de baze
oriC
TerD
TerC
TerB
TerA
Terminarea Replicarii
TerA
TerB
Un set de situsuri Ter opresc bifurcaia de replicare
care progreseaz n sensul acelor de ceasornic, al 2-lea
set blocheaz bifurcaia de replicare care avanseaz n
Invers acelor de ceasornic:
Cromozom
Situsurile Ter
foreaz cele dou
bifurcaii de
replicare s se
ntlneasc ntr-un
punct specific.

SSB previn renaturarea ADN.
Helicaza se leag la originea de replicare i
dezrsucete dublu helixul ADN.
5
3
5
3
Primaza sintetizeaz ARN primer.
3 5
5 3
Replicarea
Direcia de avansare a
bifurcaiei de replicare
5 3
5
3
5
3
3 5
DNA pol adaug nucleotide la ARN primer.
Replicarea
5
5
Direcia de avansare a
bifurcaiei de replicare
5
3
5
3
3
3
DNA pol verific bazele mperecheate i le nlocuiete
pe cele greit mperecheate.
Replicarea
5
5 3
5
3
3
5
3
Direcia de avansare a
bifurcaiei de replicare
Sinteza catenei leading continu n direcia 5 to 3.
Replicarea
3 5 5
5 3
5
3
3
5
3
Direcia de avansare a
bifurcaiei de replicare
Fragment Okazaki
Sinteza discontinu produce segmente ADN numite
fragmente Okazaki.
Replicarea
5 5
5 3
5
3
3
5
3
Direcia de avansare a
bifurcaiei de replicare
3
Alungirea fragmentului Okazaki.
Okazaki fragment
Replicarea
5
5 3
5
3
3
5
3
3
5
5 3
Alungirea catenei leading i sinteza de noi fragmente
pe Okazaki msur de bifurcaia mai avanseaz.
Replicarea
3
5
3
5
5
3
5
3
3
5
5 3
Alungirea noului fragment Okazaki, n paralel cu
alungirea catenei leading .
Replicarea
5
5
3 3
5
3
5
3
5
3
3
5
Activitatea exonucleazic a ADN pol I
ndeprteaz ARN primer.
Replicarea
Activitatea polimerazic a ADN pol I umple golurile.
Ligaza formeaz legturi fosfatdiesterice ntre
gruparea 3 OH de la captul unui fragment Okazaki cu
gruparea 5 fosfat de la captul altui fragment Okazaki.
.
3
5
3
5
3
5
3
3
5
Replicarea
Topoisomerase
nicks DNA to
relieve tension
from unwinding
2
3
1
4
5
6
7
Pol III synthesises leading strand
Helicase opens helix
Primase synthesises RNA primer
Pol III elongates primer;
produces Okazaki fragment
Pol I excises RNA primer; fills gap
DNA ligase links Okazaki
fragments to form
continuous strand
REPLICAREA ADN
ntrebare:
Fragmentele Okazaky sunt:
Produsul aciunii helicazei
Lanuri ADN sintetizate n cadrul catenei leading
n cursul replicrii
Regiuni ale ADN care nu codific informaie
pentru sinteza de ADN.
Fragmente relativ scurte de
polidezoxiribonucleotide cu cteva ribonucleotide
la captul 5.




Replicarea simultan prin formarea
de bucle ale matriei catenei
lagging.
Replicarea simultan: molecula ADN pol III este
responsabil de sinteza ambelor catene de ADN.
Caracteristici ale replicrii la
eucariote
Multiple origini de replicare
Replicarea este bidirectional
Are mai multe origini de replicare
deoarece molecula de ADN este foarte
lung i viteza de aciune a replizomului
este mic
Histonele vechi se asociaz cu duplexul
nou care conine catena leading.

Multiple regiuni ori la eucariote
Bubbles
Bubbles
Tabel comparativ:
Procariote Eucariote
1 ori region Multiple ori regions
2 bifurcaii de replicare per
cromozom
100 bifurcaii de replicare per
cromozom
Viteza replicrii
1.000 perechi baze/sec
Viteza replicrii
100 perechi baze/sec
Lungime frag. Okazaki
1000-2000 nucleotide
Lungime fragmente Okazaki
150-200 nucleotide

1 eoare la 1mil-10mil 1 eroare la 1000 mil
replication.swf