1

UNIVERSITATEA BUCURETI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
coala Doctoral n Biologie
REZUMAT TEZ DE DOCTORAT
DETERMINAREA ECOTOXICITII AGENILOR DE
SUPRAFA CATIONICI I AMFOTERICI I EVALUAREA
RISCULUI GENERAT ASUPRA MEDIULUI ACVATIC
Coordonator Prof. Dr. Anca Dinischiotu
Doctorand Ivan (Gheorghe) tefania
Bucureti 2012
2
CUPRINS
INTRODUCERE 3
PARTEA I - STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII N DOMENIU 4
CAPITOLUL I Surfactani: tipuri, utilizri i ecotoxicitate 4
CAPITOLUL II - Biomarkeri ai stresului oxidativ la peti 6
CAPITOLUL III Acte normative care reglementeaz regimul detergenilor in
mediul acvatic
7
PARTEA II CONTRIBUII ORIGINALE 7
CAPITOLUL IV Controlul analitic al surfactanilor cationici i amfoterici 8
CAPITOLUL V Evaluarea biodegradabilitii 9
CAPITOLUL VI Evaluarea toxicitii asupra unor specii de organisme acvatice 13
CAPITOLUL VII Evaluarea stresului oxidativ indus de expunerea la surfactanii
cationici i amfoterici
18
CAPITOLUL VIII - Evaluarea modificrilor histologice 27
CAPITOLUL IX - Caracterizarea riscului acvatic 28
CONCLUZII GENERALE 31
LISTA PUBLICATIILOR 37
BIBLIOGRAFIE SELECTIV 39
3
INTRODUCERE
n cadrul industriei chimice, industria de detergeni a fost ntotdeauna o industrie competitiv, cu o mare
deschidere pentru inovaie i spre cretere economic. n ultimul secol a fost i va continua s fie, un factor
cheie pentru progresul societii. Aceasta este industria responsabil pentru creterea nivelului de igien al
oamenilor i al spaiilor locuite de acetia i n acelai timp pentru reducerea timpului i efortului necesar
ndeplinirii acestui scop. Consumul crescnd de detergeni a contribuit la mrirea concentraiilor acestora n
reeaua de canalizare a oraelor i implicit, la impurificarea apelor de suprafa, dar i la crearea unor
depozite de deeuri solide att n faza de fabricare i utilizare ct i n faza de sfrit de via al produselor.
Cele mai importante substane chimice din compoziia produselor de curat agenii de suprafa
(surfactanii) se ncadreaz n categoria chimicale HPV (high-production-volume) i sunt responsabili pentru
influena detergenilor asupra factorilor de mediu. Dup utilizare, detergenii sunt eliminai n apele uzate
fr s sufere modificri structurale, ceea ce face ca agenii de suprafa s-i pstreze proprietile
superficiale i deci ecotoxicitatea.
n acest context, prezenta tez de doctorat abordez o tematic de mare actualitate i noutate att la
nivel naional, ct i al Uniunii Europene i anume implementarea celei mai importante reglementri
legislative europene privind detergenii i produsele de curare Regulamentul European CE nr.
648/2004 i amendamentele sale ulterioare, prin care sunt stabilite reguli stricte privind libera circulaie a
detergenilor pe piaa U.E. Actualul Regulament impune productorilor/ importatorilor/ distribuitorilor de
detergeni i produse de curat, s furnizeze, prin intermediul fielor cu date de securitate, informaii privind
biodegradabilitatea agenilor de suprafa i riscul generat asupra mediului acvatic, evaluat pe baza datelor
obinute n urma efecturii de teste de toxicitate.
Principalul scop al lucrrii a fost de a caracteriza din punct de vedere ecotoxicologic agenii de suprafa
cationici i amfoterici respectnd cerinele Regulamentului European CE nr. 648/2004 i de a evalua
riscul generat de acetia asupra componentei acvaticea mediului.
n cadrul lucrrii, o atenie deosebit a fost acordat surfactanilor cationici, utilizai frecvent n
fabricarea detergenilor i balsamurilor de rufe i vase, dar i n produse biocide,precum i surfactanilor
amfoterici, folosii la fabricarea produselor de ngrijire personal (ampoane, balsam pentru pr, spun lichid
i loiuni de curare pentru fa) i n industria detergenilor de curare, deoarece:
controlul agenilor de suprafa cationici i amfoterici nu a fost legiferat pn la apariia
Regulamentului European nr. 648/2004 i nu a existat o metod standard norm european EN sau
internaional ISO sau metod asociat unei directive europene pentru determinarea chimic cantitativ a
acestor categorii de substane active;
pn la nivelul anului 2004, nu a existat nici pe plan european, nici la nivel naional, o metod-standard
sau asociat unei directive pentru testarea biodegradabilitatii agenilor de suprafa cationici i/sau
amfoterici, dei existau reglementri privind gradul minim de biodegradabilitate acceptat pentru aceste
tipuri de substane active utilizate n compoziia detergenilor comerciali;
n literatura de specialitate referinele privind caracteristicile ecotoxicologice i efectele subletale a
agenilor de suprafa cationici i amfoterici sunt foarte reduse;
sunt substane nenormate n eflueni staiilor de epurare i ape de suprafa, att la nivel naional ct i la
nivel internaional, dei sunt utilizate frecvent n produse comerciale i se regsesc des n probe de
mediu;
4
Contribuiile originale aduse tematicii de cercetare n prezenta tez de doctorat vizeaz n mod special
informaii noi privind caracterizarea ecotoxicologic a surfactanilor cationici i amfoterici (toxicitate,
biodegradare, inducerea stresului oxidativ, modificri histologice) i identificarea / evaluarea potenialelor
riscuri directe i indirecte determinate de prezena acestora n mediul acvatic.
S-au obinut informaii importante privind aciunea toxic a clorurii de benzentoniu (surfactant cationic) i
cocamidopropil betainei (surfactant amfoteric) asupra sistemelor enzimatice de aprare ale organismelor
acvatice (peti din specia Cyprinus carpio) i modificrile induse de acestea la nivel tisular, subiecte
neabordate n literatura de specialitate.
De asemenea, deoarece aceste substae nu sunt normate n legislaia de mediu, cercetrile efectuate au
condus la evaluarea riscului acvatic determinat de prezena acestor dou categorii de surfactani (cationici i
amfoterici) n apa de suprafa i stabilirea limitelor maxime admise astfel nct s nu fie afectat viaa
acvatic.
Din punct de vedere metodologic i economic, pe parcursul studiilor efectuate n cadrul acestei lucrri, s-au
verificat / dezvoltat i s-au implementat n practica curent a Laboratorului Bioteste Analize Biologice al
INCD ECOIND Bucureti (gazda i susintorul financiar al studiilor de cercetare) diverse metode de
evaluare a toxicitii (inhibiia asupra creterii algelor, inhibiia bioluminiscenei bacteriilor, inhibiia
creterii microbiene) i biodegradabilitii ultime, aplicate, n urma acreditrii, i la diveri beneficiari pentru
produse de curat n compoziia crora se gsesc aceste tipuri de surfactani.
Prezenta lucrare de doctorat a fost structurat n 9 capitole reprezentative pentru subiectele abordate dup
cum sunt descriese mai jos. Stadiul cunoterii i analiza reglementrilor privind detergenii a fost realizat n
proporie de 21% din totalul lucrrii. Contribuia original privind caracterizarea ecotoxicologic i
evaluarea riscului acvatic al surfactanilor cationici i amfoterici (experimente, rezultate, metodologii,
interpretri, concluzii) reprezint 67%din volumul lucrrii. Restul de 12%reprezint introducerea, listele de
abrevieri, diseminarile, cuprinsul i bibliografia.
PARTEA I - STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII N DOMENIU
Obiectivul principal al primei pri a lucrrii l-a reprezentat analiza literaturii de specialitate i a
reglementrilor internaionale privind detergenii i n special substanele active din compozitia lor
(surfactanii, mai ales cei cationici i amfoterici). S-a avut n vedere identificarea urmtoarelor aspecte:
clasificare i tipuri de surfactani, ecotoxicitate (biodegradare, ci de degradare, toxicitate, bioacumulare),
efecte la nivelul sistemelor enzimatice (n special la nivelul sistemului enzimatic antioxidant) i acte
normative internaionale, n vederea evidenierii contribuiilor originale pe care acest lucrare le aduce
domeniului.
CAPITOLUL I Surfactani: tipuri, utilizri i ecotoxicitate
Conform rapoartelor CESIO (European Committee of Surfactants and their Organic Intermediates), jumtate
din consumul de detergeni s-a utilizat n aplicaii casnice iar cealalt jumtate n industria cosmetic,
prelucrarea metalelor, fabricarea hrtiei i n industria pielriei. La nivelul anului 2007 cei mai utilizai
surfactani au fost anionici i neionici, mpreun acoperind jumtate din volumul de surfactani produi [Ute,
2009]. n anul 2008, s-a estimat c n Europa de Est s-au folosit anual >4,2 milioane de tone de detergeni i
1,2 milioane de tone de balsamuri, n cretere fa de anul 2006 [Tomislav, 2010].
S-a constatat c n perioada 1990-2010, n apele uzate internaionale au fost identificate urmtoarele intervale
de concentraii ale surfactanilor: anionici 330 -9450 g/l, neionici 5 395 g/l, cationici 0,1 325 g/l (i
chiar 6000 g/l n apele uzate provenite de la spitale)[Berger., 1997; Guang, 2006; Tomislav, 2010;
HERA, 2008; NICNAS, 2003]. Nu au fost identificate date privind concentraia surfactanilor amfoterici n
apele uzate.
5
n apele de suprafa s-au estimate urmtoarele intervale de concentraii: anionici <4 81 g/l, neionici
<0,002 -31 g/l, amfoterici <0,01 3,8 g/l, cationici <0,1 34 g/l [Kazuaki i colab., 2008; Kees van L.
i colab., 1992; Detergent Products Environmental Project, 2001].
Primul criteriu in evaluarea riscului de mediu i respectarea condiiilor impuse prin reglementrile n vigoare
este evaluarea biodegradabilitii. Literatura de specialitate evideniaz c biodegradabilitatea primar a
surfactanilor cationici i amfoterici ndeplinete condiiile impuse de legislaie, aceasta fiind n majoritatea
cazurilor >80%. n ceea ce privete biodegradabilitatea ultim a surfactanilor cationici i amfoterici, studiul
literaturii a evideniat c majoritatea acestor compuiprezint biodegradabilitate ultim n condiii de aerobie
(>60% -100%) dar i anaerobie (64 100%). Probleme de biodegradabilitate se evideniaz n cazul
surfactanilor cationici quaternizai att n condiii de aerobie (>5%) ct i n lipsa oxigenului (24%), i n
cazul alchil betainelor n condiii anaerobe (0 ->60%).
Metodologia de testare a gradului de biodegradare primar i ultim este impus prin Regulamentul nr.
648/2004 privind detergenii, anexele III i VIII, care prevede limitele de biodegradare ale substanele active
surfactante din produsele de curat n vederea comercializrii.
Datele de biodegradabilitate i informaiile de utilizare, consum i condiiile actuale de expunere n mediu a
substanei (ex. situaia tratrii deeurilor), fac posibil prezicerea concentraiei de substan n mediu
(PEC).
Comportamentul ecotoxicologic (evaluarea toxicitii compusului asupra organismelor acvatice) reprezint al
doilea criteriu n evaluarea riscului ecologic. Detergenii pot manifesta efecte toxice pentru toate tipurile de
organisme acvatice dac se regsesc n cantiti suficiente i dac includ detergeni biodegradabili. Toi
detergeni distrug mucoasele externe care protejeaz organismele de parazii i bacterii, n plus pot afecta
grav branhiile.
Deoarece este imposibil s se realizeze studii de ecotoxicitate asupra tuturor organismelor care pot fi expuse
la un anumit compus, la nivel internaional s-au stabilit anumite specii reprezentative pentru lanul trofic
acvatic, pornind de la microorganisme, alge, crustacee (bentonice i planctonice) i finaliznd cu petii
(evideniate n metodologia OECD, EN ISO, EPA). Odat cu implementarea Regulamentului REACH, gama
de teste s-a diversificat prin implementarea de microbioteste (teste de toxicitate la scara micro) ca alternativ
la testele convenionale pentru reducerea sau nlocuirea animalelor utilizate n testare.
Aplicarea testelor de toxicitate acute sau cronice conduc la estimarea concentraiilor CL50/ CE50
(concentraiile la care se pot nregistra mortaliti / imobilizri pentru 50% din organismele testate) i NOEC
(concentraia la care nu se observ efecte adverse fa de martor) care reprezint o baz considerabil n
stabilirea valorilor PNEC (concentraiile la care sunt excluse efectele toxice ale unui contaminant
asupra organismelor dintr-un compartiment al mediului) necesar procedeului de evaluare a riscului de
mediu. Datele experimentale obinute n laborator se extrapoleaz prin aplicarea unor factori introdui de UE
pentru evaluarea riscului. Valoarea factorilor de evaluare depinde de numrul de specii pe care s-au realizat
testele de toxicitate (peti; peti + crustacee + alge) i regimul testului (acut sau cronic). Aceti factori
variaz n mod normal ntre 10 i 1000.
Datele ecotoxicologice identificate n literatura de specialitate pentru civa surfactani cationici i amfoterici
relevani pentru industria detergenilor / cosmeticelor/ biocidelor au evideniat urmtoarele:
- Toi surfactani (cationici i amfoterici) manifest o toxicitate moderat spre toxic n majoritatea testelor de
toxicitate acut efectuate pe diverse specii de peti (CL50 = 0,07 42 mg/l), iar valorile de concentraie fr
efect observabil (NOEC) sunt cuprise n intervalul 0,004 3,5 mg/l.
- Toxicitatea acut fa de Daphnia variaz n intervalul 0,006 520 mg/l, iar NOEC in intervalul 0,043
3mg/l.
6
- Efectul toxic acut asupra algelor al surfactanilor cationici variazn intervalul 0,03-11 mg/l, cu valori
NOEC n intervalul 0,12-1,8 mg/l, n timp ce pentru surfactanii amfoterici prezint valori CE50 mai mari
cuprinse n intervalul 0,5 48 mg/l i NOEC 0,09 3,2 mg/l.
- Surfactanii cationici quaternari inhib drastic respiraia bacterian n testele de toxicitate acut desfurat e
pe bacterii, cu CE50 n intervalul 0,15 6,9 mg/l pe cnd esterquaii prezint valori CE50 >130 mg/l.
Surfactanii amfoterici manifest o toxicitate sczut asupra bacteriilor.
Se remarc c intervalele valorilor de toxicitate sunt foarte extinse i diversificate, chiar pentru acelai
organism testat i metoda aplicat iar din acesta cauz literatura de specialitate este foarte permisiv.
Analiza datelor de literatur expuse n capitolul I al prezentei lucrri a condus la urmtoarele concluzii:
- Se apreciaz c exist suficiente studii de evaluare a ecotoxicitii surfactanilor anionici precum i
pentru o mare parte dintre cei neionici, i de aceea cercetarea viitoare ar trebui ndreptat n mod
special pentru elucidarea efectelor toxice ale surfactanilor cationici i amfoterici al cror profil
ecotoxicologic este puin cunoscut, iar proprietile lor fizico-chimice pot influena semnificativ
rezultatele studiilor ecotoxicologice.
- S-a constatat un numr redus i neclar de informaii privind biodegradabilitatea i toxicitatea
compuilor selectai pentru cercetare (cationici clorura de benzentoniu i amfoterici
cocamidopropil betaina).
- n general pentru evaluarea ecotoxicitii se recomand metodologia standardizat OECD i ISO,
reglementat i recunoscut la nivel mondial;
- n ceea ce privete evaluarea gradului de biodegradare, cel mai des se utilizeaz metodele de
biodegradabilitatea ultim aerob reglementate de ctre Regulamentul 648/2004 privind detergenii.
- Gradul de toxicitate se evalueaz utiliznd o baterie de teste care s acopere toate nivele trofice din
mediul acvatic, pentru acestea se recomand teste acute i cronice n sistem clasic sau alternativ.
- S-a constatat c surfactanii cationici ntmpin probleme de biodegradare aerob, n timp ce
surfactanii amfoterici sunt uor biodegradabili.
- Att surfactanii cationici ct i cei amfoterici determin toxicitate acut (clasificai n clasele de
toxicitate TOXIC sau MODERAT TOXIC) asupra petilor, crustaceelor, algelor i bacteriilor.
n consecin, cercetarea experimental din prezenta lucrare a inut cont de concluziile analizei de literatur
prin utilizarea metodologiei OECD i ISO pentru evaluarea ecotoxicitii i bateriilor de teste de toxicitate
acute, cu timp de execuie i costuri reduse, conduse pe organisme acvatice specifice apelor de suprafa din
Romnia (crap, purici de balt, alge verzi i bacterii).
CAPITOLUL II - Biomarkeri ai stresului oxidativ la peti
Prezentul capitol i-a propus evidenierea aspectelor privind aprarea antioxidant i stresul oxidativ la
nivelul organismelor acvatice (n special peti) cu sublinierea efectelor induse de prezena surfactanilor
cationici i amfoterici.
Analiza literaturii de specialitate a vizat scoaterea n eviden a informaiilor privind efectele surfactanilor la
nivelul sistemului enzimatic antioxidant al organismelor acvatice (peti) i modificri survenite la nivel
tisular.Surfactanii determin deteriorarea componentelor lipidice din membranele celulare, iar la concentraii
mai mari pot conduce la suprimarea proceselor metabolice din celul. Aceste modificri celulare rezult n
special ca urmare a insuficientei respiratorii prin alterarea epiteliului branhiilor. n general se constat c
fiecare specie reacioneaz la toxic n mod specific, biomarkerii stresului oxidativ (enzimele antioxidante,
carbonilarea proteinelor, peroxidare lipidic, deteriorrile ADN, etc.) fiind influenai prin creterea sau
scderea capacitii lor defuncionare, n funcie de specificitatea fiecrui poluant, de modul de aciune i
condiiile de testare.
7
De asemenea studiul literaturii de specialitate a condus la ipoteza c, n general, surfactanii determin
deteriorri la nivel subcelular.Majoritate studiilor histologice conduse pe peti de ap dulce au fost realizate
pentru evidenierea impactului surfactanilor anionici i neionici (dodecil benzen sulfonat, linear alchil
benzen sulfonat), celelalte tipuri (cationici i amfoterici) fiind foarte putin studiate din acest punct de vedere.
Din analiza literaturii de specialitate s-a observat c nu exist date privind efectele surfactantului cationic -
clorura de benzentoniu i amfoteric - cocamidopropil betain, asupra sistemelor enzimatice de aprare din
organismul petilor. De asemnea s-a constata un numr redus de informaii privind efectele claselor de
surfactani cationici i amfoterici, n general, asupra sistemelor de aprare ale organismelor acvatice;
Literatura de specialitate recomand pentru evidenierea stresului oxidativ la nivelul organismelor acvatice
(peti) urmrirea urmtorilor biomarkeri: modificri la nivelul activitii enzimelor antioxidante, nivelul
peroxidrii lipidice, nivelul glutationului redus, modificri oxidative ale proteinelor, modificri oxidative la
nivel muscular, etc. Prin urmare cercetrile experimentale realizate n acest sens n prezenta lucrare au fost
conduse innd cont de aceti indicatori i de metodele indicate n literatur.
CAPITOLUL III - Acte normative care reglementeaz regimul detergenilor in mediul
acvatic
Obiectivul prezentului capitol a fost analiza actelor normative privind comercializarea, testarea i normarea
n compartimentele de mediu a detergenilor (substanelor active din compoziia lor surfactani), n vederea
evidenierii noutii i originalitii lucrrii privind stabilirea de limite n apa de suprafa pentru surfactanii
cationici i amfoterici.
Studiul literaturii de specialitate privind reglementarea detergenilor a condus la urmtoarele concluzii:
- La nivel internaional, i implicit la nivel naional prin transcriere, este aplicabil Regulamentul
648/2004 privind detergeniii amendamentele sale ulterioarecare impune reguli stricte de
comercializare a produselor de curat n vederea asigurrii proteciei sntii umane i a mediului.
De asemenea prezentul regulament prevede i ghiduri de evaluare a riscului complementar determinat
de surfactani n urma biodegradrii prin formare de metabolii potenial recalcitrani.
- n Romnia exist un singur laborator acreditat pentru evaluarea gradului de biodegradabilitate ultim
a surfactanilor n conformitate cu Regulamentul 648/2004 privind detergenii (Laboratorul Bioteste
Analize Biologice din cadrul INCD ECOIND Bucureti);
- Surfactanii cationici i amfoterici nu sunt normai n apele uzate i apele de suprafa de ctre
legislaia naional i nici n cea internaional, deii sunt clasai n clasa contaminanilor periculoi
pentru mediul acvatic (emerging contaminants);
- Exist pe plan mondial preocupare pentru evaluarea riscurilor surfactanilor i promovarea practicilor
de productie i consum durabile.
PARTEA II CONTRIBUII ORIGINALE
Partea a doua a lucrrii prezint contribuiile originale aduse domeniului prin cercetri experimentale de
laborator privind caracterizarea ecotoxicologic a surfactanilor cationici i amfoterici (determinri analitice,
evaluarea biodegradabilitii i toxicitii directe i indirecte, efecte asupra sistemelor enzimatice de aprare
i modificri histologice) i evaluarea riscului acvatic.
8
CAPITOLUL IV Controlul analitic al surfactanilor cationici i amfoterici
Obiectivul prezentului capitol a fost stabilirea parametrilor de performan a metodelor de determinare
cantitativ a surfactanilor cationici i amfoterici n vederea asigurrii controlului analitic n testele de
ecotoxicitate i n probele de mediu (ap de suprafa i ape uzate).
Determinrile analitice ale surfactanilor studiai au fost efectuate n conformitate cu metodele specificate n
Anexa II C a Regulamentului 648/2004 privind detergenii, dup cum urmeaz:
Metoda de control analitic al surfactantilor cationici- DIN 38409:1989, partea 20.
Metoda de control analitic a surfactanilor amfoterici - metoda spectrofotometric descris de
Boiteux, 1984.
Rezultate experimentale
Parametrii de performan a metodelor de determianre cantitativ a surfactanilor cationici i amfoterici sunt
prezentate succind n tabelul nr. 1.
Tabelul nr. 1 Parametrii de performan ai metodelor de determinare a surfactanilor cationici i amfoterici
Parametrii de
performan ai
metodei
DIN 38409:1989, partea 20
Surfactai cationici
Metoda Boiteux, 1984 Surfactai
amfoterici
Hyamin 1622
(clorur de benzentoniu) 99,99%
Cocamidopropil betaina 34,6%
Exactitate[%]
96,8% 99%
Fidelitate [CV (RSD)%] CV (RSD)% = 6,508 % CV (RSD)% = 3,392 %
Repetabilitate r = 2,8 x 0,0314 = 0,088 mg/l r = 2,8 x 0,0403 = 0,1128 mg/l
Reproductibilitate intern
(R
L
)
R
L
= 0,0115 R
L
= 0,5161
Sensibilitate x= 6,9108y 0,0069 x= 5,7837y 0,0925
Limita de detective
(LoD)
0,003 mg/l 0,002 mg/l
Robustee
Metoda este robust dac nu se modific
pH-ul de lucru, factor care produce
scderea semnificativ a concentraiei
msurate. Excesul de albastru de disulfin
produce, n schimb, o cretere a valorii
msurate.
Metoda este robust dac nu se modific pH-ul
de lucru, factor care produce scderea
semnificativ a concentraiei msurate. Excesul
de Orange II produce, n schimb, o cretere a
valorii msurate.
Limita de cuantificare
(LoQ)
0,035 mg/l 0,032 mg/l
Domeniul De Lucru
0,003 - 4 mg/l. 0,002 -2 mg/l.
Recuperarea 80 %- 110 % 80 %- 110 %
Interferene
Surfactanii anionici interfer puternic chiar
i la concentraii foarte mici (5-10 mg/l),
determinarea surfactanilor cationici n
prezena lor neputnd fi realizat dect
dup trecerea i reinerea surfactanilor
anionici pe un schimbtor de ioni adecvat.
Agenii de suprafa anionici cationici
interfer n determinarea surfactanilor
amfoterici, chiar la concentraii foarte sczute.
Interferenele se reduc prin trecerea i reinerea
surfactanilor anionici / cationici pe un
schimbtor de ioni adecvat.
Metodele analitice aplicate pentru determinarea catitativ a surfactanilor cationici i amfoterici (specificate
n anexele Regulamentul European nr. 648/2004/CE) sunt tehnici spectrofotomerice, de rutin care implic
costuri sczute. Limitele de detecie n soluii apoase sintetice / probe de mediu contaminate (ape uzate i ape
de suprafa) oferite de aceste metode sunt: 0,003 mg/l pentru surfactanii cationici i 0,002 mg/l pentru
surfactanii amfoterici. Interferenele metodelor sunt determinate de prezena altor categorii de surfactani
9
(anionici, cationici, substane organice) care reacioneaz fie cu surfactantul int fie cu reactivul de culoare
formnd compui stabili. Aceste probleme pot fi nlturate prin utilizare rinilor schimbtoare de ioni care
separ surfactanii int.
Selectivitate metodei pentru probele sintetice a fost asigurat prin utilizarea curbelor etalon realizate pentru
principalele substane studiate (Hyamin, Tetranyl i cocamidopropil betain).Pentru detecia selectiv a
compuilor cationici din probele de mediu recomandm utilizarea de tehnici performate tip HPLC.
CAPITOLUL V EVALUAREA BIODEGRADABILITII
Pentru respectarea primului criteriu de evaluare a ecotoxicitii / riscului acvatic, respectiv determinarea
gradului de biodegradabilitate a surfactanilor cationici i amfoterici au fost efectuate urmtoarele
experimentri:
Experimente de determinare a biodegradabilitii primare conduse pe soluii sintetice ale
substanelor active surfactante utilizate n produse de curat i soluii sintetice ale unor produse de
curat comerciale pe baz de surfactani cationici, n conformitate cu metoda specificat n Anexa
VIII.1 a Regulamentului 648/2004 Testul de confirmareOECD (Metoda 303A) Activated Sludge
Units-Simulation Test;
Experimente de determinare a biodegradabilitii ultime / finale conduse pe soluii sintetice ale
substanelor active surfactante utilizate n produse de curat comerciale i soluii sintetice ale unor
produse de curat pe baz de surfactani cationici i amfoterici, n conformitate cu metodele specificate
n Anexa III a Regulamentului 648/2004 (SR EN ISO 10707/2008 / OECD 301D/ EC C4-E i SR EN
ISO 7827/2001 / OECD 301A/ EC C4-B)
Surfactanii selectai pentru testarea biodegradabilitii
ageni de suprafa cationici sruri quaternare de amoniu Hyamin 1622 (clorur de benzentoniu)
puritate >99,99% (Sigma) CAS 121-54-0 i TETRANYL AT 7590 (dialchil hidroxietil amoniu
metasulfat) puritate >99% (KAO Corporation) CAS 93334-15-7;
agent de suprafa amfoteric alchil amino betain - AMFODAC LB (cocamidopropil betain / lauril
amido propil betain/ CAPB) puritate 34,6% (SASOL Italy) CAS: 4292-10-8;
produse pe baz de ageni de surprafa cationici i amfoterici: Biocid cationic - Bromur de
cetilpiridiniu (CAS 140-72-7); produse de curat comerciale (balsam de rufe) care conin substane
cationice (TEA esterquat CAS 91995-81-2 i CAS 157905-74-3); produs comercial de curare pe baz
de surfactant amfoteric detergent de toalet detrartant.
Dialchil hidroxietil amoniu metasulfat Cocamidopropil betain
10
Br
-
Clorur de benzentoniu Bromur de cetilpiridiniu
[Structuri chimice preluate din fiele tehnice de securitate]
Studiile de biodegradabilitate s-au efectuat n duplicat pentru fiecare substan sau amestec de substane,
conform cerinelor metodelor de testare, iar valorile prezentare reprezint media valorilor paramentrilor
monitorizai. Pentru reprezentarea grafic s-a utilizat programul Microsoft XCEL.
Rezultate experimentale
Evaluarea biodegradabilitii primare (Testul de confirmareOECD -Metoda 303A Activated Sludge
Units-Simulation Test)
Figura nr. 2 Instalaie pilot de laborator cu nmol
activ n flux continuu
n tabelul nr. 2 sunt prezentate centralizat rezultatele obinute dup realizarea studiilor de biodegradabilitate
primar efectuate n instalaii pilot de laborator.
n conformitate cu testul de confirmare OECD metoda de referin pentru evaluarea biodegradabilitii
agenilor de suprafa, publicat n Regulamentul European nr. 648/2004/CE, nivelul de biodegradabilitate
primar trebuie s fie de cel puin 80%, pentru ca agentul de suprafa studiat s poat fi declarat
biodegradabil i n consecin, s poat fi utilizat n compoziia de baz a unui produs comercial, care circul
liber pe piaa european. Procentul de 80% trebuie obinut n perioada efectiv de biodegradare minim 21
zile, dup perioada de amorsare, necesar instalaiei biologice cu alimentare n flux continuu, pentru a intra
n regim normal de funcionare.
Se constat pocente de biodegradare primar >90%n cazul surfactantului cationic (Tetranyl), surfactantului
amfoteric (cocamidopropil betain) i amestecurilor sintetice de surfactani (cationici + amfoterici), n timp
ce pentru surfactantul Hyamin i produsul comercial pe baz de cationic biocid (compus similar din aceeai
clas) gradul de biodegradare primar se afl la limita admis (80-84%).
Avnd n vedere criteriul de biodegradabilitate impus de Regulamentul 648/2004, putem afirma c agenii de
suprafa testai dialchil hidroxietil amoniu metasulfat (cationic), clorura de benzentoniu (cationic)
11
icocamidopropil betaina (amfoteric) ndeplinesc condiiile impuse, procentul de biodegradabilitate
obinut n toate cele 5 experimente de laborator realizate n conformitate cu metoda de referin menionat,
fiind 80%.
Rezultatele obinute (tabel nr. 2) se afl n concordan cu literatura de specialitate privind
biodegradabilitatea primar a surfactanilor cationici i amfoterici care indic procente >80% pentru aceste
dou categorii [Domsch, 1995; Comber, 2002; HERA 2008].
Tabelul nr. 2Rezultatele finale obinute pentru testarea biodegradabilitii primare
PARAMETRII
CATIONIC
Dialchil
hidroxietil
amoniu
metasulfat
(TETRANYL
AT 7590)
CATIONIC
Clorur de
benzentoniu
(Hyamin
1622)
AMFOTERIC
Cocamidopropil
betain
AMESTEC
(clorur de
benzentoniu
+cocamidopropil
betain)
AMESTEC
(dialchil
hidroxietil
amoniu
metasulfat +
cocamidopropil
betain)
PRODUS
COMERCIAL
Bromur de
cetilpiridiniu
Durata
experimental
36 zile 36 zile 30 zile 30zile 36 zile
Perioada de
iniiere
10 zile 12 zile 10 zile
Perioada efectiv
de biodegradare
26 zile 18 zile 26 zile
Randament de
ndeprtare CCO
70-89% 90% 61% 68% 50%
Randament de
ndeprtare
surfactant cationic
90% 84%
- - - 77-80%
Randament de
ndeprtare
surfactant
amfoteric
- -
99%
- - -
Randament de
ndeprtare total
a surfactanilor
cationic +
amfoteric
- - -
80% 90%
-
Randament de
biodegradare
91% 84% 97% 90,7% 97,6% 80%
Evaluarea biodegradabilitii ultime [SR EN ISO 10707:2001 Metoda prin analiza consumului
biochimic de oxigen (test n fiole nchise)]
Conform metodologiei descris de SR EN ISO 10707:2001, un compus organic este biodegradabil, atunci
cnd procentul de biodegradare este >60%, dup 28 zile de testare i curbele de biodegradare prezint o
form tipic, din care se pot deduce: timpul de laten, timpul de degradare i gradul maxim de degradare.
Lund n considerare prevederile mai sus-menionate, se poate aprecia c substanele cationice
analizate(dialchil hidroxietil amoniu metasulfat i clorura de benzentoniu) i produsele comerciale balsam
de rufe pe baz de surfactant cationic - sunt biodegradabile, nregistrndu-se pentru acestea procente de
biodegradabilitate >70%.
n corelaie cu literatura de specialitate pentru compui cationici asemntori ca structur apreciem c
rezultatele obinute experimental pentru surfactantul dialchil hidroxietil amoniu metasulfat (78%) ct i
produsele balsam de rufe pe baz de acesta (77%, 85%), pot fi comparabile cu valorile de biodegradabilitate
ultim pentru esterquai i diesterquai, intervalul de valori fiind cuprins ntre >60% - 79% utiliznd aceeai
metod de testare sau 75% - 92% utiliznd alte metode recomandate de OECD.
12
n ceea ce privete biodegradabilitatea ultim a clorurii de benzentoniu, literatura consultat specific valori
cuprinse n intevalul 0-81% utiliznd diverse metode OECD i >5% utiliznd metoda OECD 301D similar
cu SR EN ISO 10707 aplicat. Prin urmare, valoarea experimental de 67%obinut dup 28 zile de testare
se poate corela cu datele existente.
Tabel nr. 3 Centralizarea rezultatelor finale pentru experimentele de biodegradabilitate ultim conduse pe
metoda SR EN ISO 10707/2001
PARAMETRII
Dialchil hidroxietil
amoniu
metasulfat(TETRANYL
AT 7590)
Clorur de
Benzentoniu
(Hyamin
1622)
Balsam de
rufe I
(TEA
esterquat)
Balsam de
rufe II
(TEA
esterquat)
Substan de
referinAnilin
Durata testului 28 zile
Timp de laten 7-10 zile 7-10 zile 7-10 zile 7 zile 7 zile
Timp de
biodegradare
14 zile 14 zile 14 zile 21zile 12-14 zile
Randament de
ndeprtare
surfactant cationic
83,86% 73,15 84,70% 99,16% -
Procent de
biodegradabilitate
78,37 % la 28 zile 67,23%la
28 zile
77,34%la
28 zile
85,80%la
28 zile
95,23%la
28 zile
Figura nr. 1 Eficiena de ndeprtare a agenilor de
suprafa cationici i amfotericin testele de biodegradare
primar
Figura nr. 2 Curbele tipice de biodegradare ultim (SR
EN ISO 10707) pentru surfactaniicationici
Evaluarea biodegradabilitii ultime (SR EN ISO 7827/2001 - Metoda prin analizarea carbonului organic
dizolvat COD)
Testul de biodegradabilitate efectuat n conformitate cu standardul SR EN ISO 7827: 2001 apreciaz c o
substan este biodegradabil dac substana / produsul de testat nu se elimin abiotic n mod
semnificativ, iar curba de degradare prezint o form tipic, cu o faz de laten i una de degradare i n
consecin eliminarea COD poate fi atribuit procesului de biodegradare.
n concluzie, analiznd comparativ rezultatele obinute pentru soluia produsului inoculat cu nmol activ i
respectiv neinoculat i lund n consideraie condiiile impuse de standardul aplicat, apreciem c:
- procentul total de ndeprtare al carbonului organic dizolvat (% COD) pentru produsul testat (detergent
de toalet pe baz de surfactant amfoteric) este ~ 92%, din care 14% eliminare abiotic ;
- timp de biodegradare(intervalul cuprins ntre sfritul timpului de laten i momentul n care se atinge
un procent de eliminare de 90%) 20 zile ;
- produsul comercial detergent de toalet pe baz de surfactant amfoteric este biodegradabil.
13
n corelaie cu literatura de specialitate putem aprecia c valoarea biodegradabilitii ultime de 91%
(ndeprtare CCOCr sau COD) obinute experimental pentru cocamidopropil betain poate fi ncadrat n
intervalul de valori 57% -100% obinute prin aceeai metod sau prin diverse metode recomandate de
OECD pentru testarea biodegradabilitii ultime a surfactanilor amfoterici.
Tabel nr. 4 Rezultatele finale obinute pentru testarea biodegradabilitii ultime prin metoda SR EN ISO
7827: 2001
PARAMETRII
PRODUS COMERCIAL DE CURAARE PE BAZ DE
SURFACTANT AMFOTERIC (detergent detrartant de toalet)
Durata experimental 30 zile
Nivel maxim de biodegradare
91,80%- ndeprtare COD
91,43%- ndeprtare CCOCr
Timp necesar atingerii nivelului maxim de
degradare
28-30 zile
Timp de laten 3 zile
Timp de biodegradare 20 zile
Procent total de ndeprtare a agenilor de
suprafa amfoterici
72,85 % dup 30 zile
Procent de eliminare abiotica pentru martor 14% pentru COD i CCOCr
CAPITOLUL VI - EVALUAREA TOXICITII ASUPRA UNOR SPECII DE
ORGANISME ACVATICE
Pentru respectarea celui de-al doilea criteriului al caracterizrii ecotoxicologice/ riscului acvatic, prezentul
capitol a avut ca obiectiv determinarea gradului de toxicitate acvatic asupra unor specii de organisme
reprezentative ale lanului trofic i apelor de suprafa din Romnia. Capitolul a urmrit prezentarea
experimentelor i rezultatelor privind evaluarea toxicitii directe i indirecte determinat de intoxicaia cu
surfactani (cationic clorura de benzentoniu i dialchil hidroxietil amoniu metasulfat i respectiv amfoteric
cocamidopropil betain).
n primul subcapitol s-a urmrit efectuarea unei serie de teste de toxicitate acut direct (respectiv intoxicaie
cu substanele ca atare) pentru stabilirea valorilor de concentraie letal medie (CL
50
/ CE
50
) i evaluarea
efectelor generate asupra organismelor acvatice.
Activitile desfurate au presupus efectuarea biotestelor de toxicitate acut asupra urmtoarelor specii de
organisme acvatice: peti (Cyprinus carpio), crustacee (Daphnia magna), alge verzi (Selenastrul
capricornutum / Raphidocelis subcapitata / Pseudokirchneriella subcapitata), bacterii luminiscente (Vibrio
fischeri) i bacterii gram negative i positive.
Testele de evaluare a toxiciti acute a surfactanilor studiai s-au efectuat n duplicat pentru toate
organismele testate, conform protocoalelor de testare internaionale i lund n considerare prevederile
Regulamentului REACH cu privire la reducerea numrului de animale utilizate n testare, valorile prezentate
reprezentnd valoarea medie a parametrilor monitorizai.
Metodele de toxicitate acvatic aplicate au fost urmtoarele:
Bioteste de toxicitate letal acut pentru determinarea valorilor concentraiilor letale medii (CL
50
) fa
de organismele acvatice (pesti - sp. Cyprinus carpio) - OECD 203/ SR 13216:1994;
Bioteste de toxicitate acut pentru determinarea valorilor concentraiilor letale / imobilizare medii
(CE
50
) fa de crustacee (sp. Daphnia magna)- OECD 202;
14
Bioteste de toxicitate acut pentru determinarea valorilor concentraiilor inhibitorii medii (CE
50
) fa de
alge (sp. Selenastrum capricornutum)- OECD 201 i SR EN ISO 8692:2005;
Bioteste de toxicitate acut pentru determinarea valorilor concentraiilor inhibitoare medii (CE
50
) fa de
bacterii luminiscente (sp. Vibrio fischeri)- DIN EN ISO 11348-3;
Biotestede toxicitate microbian testul MARA (Microbial Array for toxicity Risk Assessment).
Utiliznd aceleai metode s-a evaluat i toxicitatea acvatic a eflueniilor (lichidelor) rezultai n urma
testelor de biodegradare a surfactanilor cationici pentru evaluarea riscului complementari toxicitatea acut a
unui produs comercial algicid.
Rezultate experimentale toxicitate direct
Pentru o vedere de ansamblu a efectelor nregistrate n cadrul bateriei de teste utilizate pentru testarea
toxicitii directe a surfactanilor studiai, rezultatele finale au fost centralizate n tabelul nr. 5.
Tabelul nr. 5 Centralizarea datelor de toxicitate obinute pentru surfactanii testai
ORGANISMUL
TEST
Clorur de benzentoniu
(cationic)
logPow 3
Dialchil hidroxietil
amoniu metasulfat
(cationic) logPow < 3
Cocamidopropil betain
(amfoteric)
logPow < 3
CL/CE50
mg/l
NOEC
mg/l
LOEC
mg/l
CL/CE50
mg/l
NOEC
mg/l
LOEC
mg/l
CL/CE50
mg/l
NOEC
mg/l
LOEC
mg/l
Cyprinus carpio
4,57
interval
ncredere
- 1,94 mg/l
+ 9,77 mg/l
0,5 1
22,90
interval
ncredere
- 11,22 mg/l
+ 33,65 mg/l
2 7
6,16
interval
ncredere
- 2,81 mg/l
+ 11,74 mg/l
0,84 3
Daphnia magna
0,39
interval
ncredere
- 0,15 mg/l
i + 0,48
mg/l
0,05 0,1
4,78
interval
ncredere
- 3,05 mg/l i
+ 6,13 mg/l
0,05 0,1
9,54
interval
ncredere-
7,25 mg/l i
+ 11,08 mg/l
1 5
Selenastrum
capricornutum
0,56
interval
ncredere
- 0,12 mg/l
i + 1,25
mg/l
0,05 0,1
3,48
interval
ncredere
- 1,67 mg/l i
+ 5,12 mg/l
0,05 0,1
5,55
interval
ncredere
- 3,59 mg/l i
+ 7,21 mg/l
0,5 1
Vibrio fischeri 1,2 0,3 - 2,89 0,4 -
>100
12 16
Bacterii gram
- si gram +
1,1 - 0,021
1,6 -
0,041 - - -
Clasificarea
toaxicitii
PUTERNIC
TOXIC(crustacee, alge) /
TOXIC(peti, bacterii)
TOXIC (crustacee, alge,
bacterii) / NOCIV (peti)
FOARTE SLAB
TOXIC(bacterii) /
TOXIC(peti, alge,
crustacee)
Comparaia cu literatura de
specialitate / interval de
toxicitate
Peti:
LC50 - 0,28 42 mg/l; NOEC: 0,004 3,5 mg/l
Crustacee:
EC50 - 0,0059 78 mg/l ; NOEC 0,0041 3 mg/l
Alge:
EC50 0,09 -11 mg/l; NOEC 0,16 -4,8 mg/l
Bacterii:
EC50 -0,5 ->130 mg/l; NOEC: -
Peti:
LC50 - 2 31 mg/l; NOEC: 0,16
1,7 mg/l
Crustacee:
EC50 - 2,15 >200 mg/l; NOEC
0,9 1,6 mg/l
Alge:
EC50 0,55 -48 mg/l;
NOEC 0,09 -10 mg/l
Bacterii:
EC50 5,2 - 900 mg/l; NOEC: -
15
Din analiz comparativ a rezultatelor de toxicitate letal acut obinute pentru surfactanii cationici se poate
observa c substana clorur de benzentoniu (puritate >99,99%) care prezint catene aromatice, manifest
un efect toxic pronunat, n timp ce dialchil hidroxietil amoniu metasulfatul (puritate 99%) care prezint
catene lineare alchilice, manifest un efect toxic spre nociv asupra organismelor acvatice, ceea ce indic
faptul c toxicitatea asupra organismelor acvatice a fost influenat de structura chimic a compusului
cationic fapt indicat i in literatura de specialitate [Abel, 1974; Masayuki i colab., 2008].
Se remarc efectul toxic pronunat al clorurii de benzentoniu datorit proprietilor sale de biocid asupra
bacteriilor, algelor i daphniilor, ceea ce indic un risc sever asupra mediului lund n calcul cazul cel mai
defavorabil. n comparaie cu acesta, dialchil hidroxietil amoniu metasulfatul fiind un surfactant cationic de
tip esterquat prezint efecte mai puin toxice asupra claselor de organisme testate.
Surfactantul amfoteric (cocamidopropil betaina) datorit proprietilor sale de spumare intens, determin
blocarea schimbului de gaze la nivelul branhiilor i membranelor celulare ceea ce se finalizeaz cu
mortalitate / imobilizare i inhibiia creterii la peti, daphnii i alge, ns asupra bacteriilor nu prezint efect
toxic.
Conform tabelului nr. 5 i a Sistemului de clasificare global a substanelor chimice GHS 2011 (capitolul
3.10), putem aprecia c surfactantul cationic - clorura de benzentoniu, se ncadrez n categoria 1 de
toxicitate acutdeoarece prezint efecte puternic toxice pentru crustacee i alge la concentraii < 1 mg/l.
Surfactanii - cationic (dialchil hidroxietil amoniu metasulfat) i amfoteric (cocamidopropil betain) se
ncadrez n categoria 2 de toxicitate acutdeoarece prezint efecte toxice la concentraii cuprinse n
intervalul 1- 10 mg/l pentru majoritatea organismelor.
Valorile de toxicitate acut dar i valorile NOEC obinute experimental pentru cele trei substane testate se
ncadreaz n intervalele de valori rezultate n urma analizei literaturii de specialitate pe clase de surfactanii,
drept pentru care apreciem c sunt relevante din punct de vedere tiinific i pot constitui baza de date
necesar caracterizrii riscului asupra mediului acvatic.
Caracterul inovativ al experimentelor de toxicitatea acvatic const n selectarea celor doi compui utilizai
n testare (clorura de benzentoniu i cocamipropil betaina) pentru care nu sunt disponibile date de toxicitate
acut specifice asupra speciei de pete Cyprinus scarpio, specific apelor dulci din Romnia.
Rezultate experimentale pentru toxicitatea complementar
n cadrul acestui subcapitol s-a ncercat s se rspund cerinei de evaluarea a efectului toxic acvatic a
efluenilor de biodegradare, Conform Ghidului Tehnic pentru abordarea stratificat a implementarii
Regulamentului (CE) nr. 648/2004 emis de Parlamentul i Consiliului European n anul 2005, prin efectuare
de bioteste de toxicitate acut pentru doi eflueni rezultai n urma testelor de biodegradare a clorurii de
benzentoniu (Hyamina 1622) i dialchil hidroxietil amoniu metasulfat (Tetranyl AT 7590).
Efluenii de biodegradare testai au manifestat efecte toxice asupra organismelor testate, gradul de toxicitate
variind n funcie de organismul testat, astfel nct algele i bacteriile au fost organismele cele mai sensibile,
aspect care poate fi corelat cu efectul determinat de compuii originali asupra acestor specii.
ncadrarea n clasele de toxicitate a efluenilor
Exist n literatur recomandri privind sistemul de clasificare a toxicitii efluenilor evacuai n mediu
acvatic [Persoone, 2003].Principiul presupune determinarea i cuantificarea toxicitii acute a efluenilor
utiliznd o baterie de microbioteste.Evaluarea toxicitii efluenilor este bazat pe dou categorii de valori: o
valoare de toxicitate acut care poate ncadra efluentul respectiv ntr-una din cele 5 clase de toxicitate i o
valoare a scorului de greutate pentru fiecare clas de toxicitate.
16
Clasele de toxicitate acut
Efectul rezultat obinut pentru fiecare microbiotest este transformat n uniti de toxicitate (TU) cu ajutorul
formulei: TU= [1/L(E)C50]x100
Clasificarea probelor testate n una din clasele de toxicitate de mai jos, se efectueaz pe baza celei mai mari
valori TU nregistrate pentru unul din testele aplicate:
Clasa I: fr toxicitate acut pentru nici unul din testele aplicate nu s-au nregistrat efecte toxice;
Clasa II: toxicitate acut uoar procentajul efectului observat ntr-unul din testele de toxicitate aplicate
este semnificativ mai mare dect martorul, dar mai mic de 50% (<1TU);
Clasa III: toxicitate acut - valoarea CL(E)50 reiese din cel puin un test din cele aplicate, dar proba
diuat n raport 1:10 are efect mai mic de 50% (1-10 TU);
Clasa IV: toxicitate acut mare - valoarea CL(E)50 reiese din diluia 1:10 a probei, din cel puin un test
din cele aplicate, dar nu i la diluia de 1:100 (10- 100 TU);
Clasa V: toxicitate acut foarte mare - valoarea CL(E)50 reiese din diluia 1:100 pentru cel puin un test
din cele aplicate (>100 TU).
Greutatea scorului - reprezint importana cantitativ a toxicitii n aceea clas i se apreciaz dup cum
urmeaz:
efect toxic nesemnificativ = scor 0
efect toxic semnificativ dar <1 TU = scor 1
1-10 TU = scor 2
10-100 TU = scor 3
>100 TU = scor 4
Calculul scorului de greutate a clasei se efectueaz dup cum urmeaz:
Scorul de greutate a clasei = ( toate scorulile testelor)/n (n=numrul de teste aplicate)
n tabelul nr. 6 este prezentat ncadrarea efluenilor rezultai n urma biodegradrii n clasele de toxicitate
acut dup sistemul de clasificare Persoone, 2003. Conform acestei clasificri efluentul de biodegradare a
clorurii de benzentoniu prezint toxicitate acut valabil pentru toate tipurile de organime testate, n timp ce
efluentul de biodegradare a dialchil hidroxietil amoniu metasulfatului determin un efect toxic slab valabil
pentru bateria de teste efectuate, cu o influen mai mare asupra algelor i bacteriilor pentru ambele substane
testate.
Tabelul nr. 6 Clasificarea gradelor de toxicitate pentru efluenii de biodegradabiliate testai
Test de toxicitate
acuta efectuat /
Unitate de toxicitate (TU) calculat pentru fiecare tip de
test pe baza valorii LC(E)50 Sistem de clasificare a
efluenilor deversai n
mediul acvatic
Efluent biodegradare clorur
de benzentoniu (0,9mg/l)
Efluent biodegradare
dialchil hidroxietil amoniu
metasulfat (0,25mg/l)
Cyprinus carpio
0 *
scor 0
0
scor 0
TU < 0,4
Clasa I nu exist toxicitate
acut
0,4<TU<1
Clasa II toxicitate acut
slab
1<TU<10
Clasa III toxicitate acut
10<TU<100
Clasa IV toxicitate acut
ridicat
TU>100
Clasa V toxicitate acut
foarte ridicat
Daphnia magna
2
scor greutate 2
0
scor 0
Selenastrum
capricornutum
3,32
scor greutate 2
1,2
scor greutate 2
Vibrio fischeri
4,98
scor greutate 2
2,24
scor greutate 2
TU calculat pentru
bateria de teste
/
Clasificare toxicitate
2,57
/
Clasa III toxicitate acut
scor greutate 2
0,86
/
Clasa II toxicitate acut
slab
scor greutate 1
* Se atribuie 0 uniti de toxicitate, doarececonform testului de toxicitate acut pe peti realizat pentru clorura de benzentoniu, soluia sintetic de 1
mg/ l nu a prezentat toxicitate n 96h de testare, prin urmare apreciem c efluentul de biodegradare (conc. 0,98 mg/l surfactant) nu prezint efect toxic
asupra petilor.
17
n tabelul nr. 7 sunt prezentate succint efectele de toxicitate determinate de efluenii de biodegradare
comparativ cu substanele originale conform normelor internaionale. Din analiza datelor experimentale
reiese faptul c clorura de benzentoniu (Hyamina 1622) determin un impact toxic pronunat n comparaie
cu dialchil hidroxietil amoniu metasulfatul (Tetranyl AT 7590). Faptul c s-au evideniat efecte toxice ne
conduce la urmtoarele ipoteze:
- posibilitatea persistrii n soluie a unei concentraii de surfactant nebiodegradat, ceea ce se poate
corela cu rezultatele obinute in cadrul testrilor de biodegradabilitate ultim a surfactanilor
cationici (n special a clorurii de benzentoniu) pentru care am obinut cea mai mic valoare de
biodegradare ultim (67%) i de asemenea cu literatura de specialitate care indic valori de
biodegradare sczute pentru aceast clasa de surfactani;
- apariia n urma biodegradrii de intermediari / metabolii posibil recalcitrani care pentru moment
tehnica analitic disponibil nu permite detectarealor;
Prin extrapolare in situ (n apele de suprafa), valorile de toxicitate prezentate obinute n condiii de
laborator se vor diminua considerabil avnd n vedere debitele rurilor care efectueaz diluia (de 100 de ori
pn la 1000 de ori). Comportarea in situ a substanelor studiate din punct de vedere toxicologic depinde de o
serie de factori fizico chimici (pH, temperatur, oxigen, concentraie, ncarcare microbian, schimbri
climatice, prezena altori compui chimici, etc.) care pot modifica biodisponibilitatea acestor compui la
organismele acvatice.
Tabelul nr. 7 Clasificarea gradelor de toxicitate pentru efluenii de biodegradabilitate testai
Organism
acvatic
Toxicitate conform normelor internaionale (EPA, OECD, Persoone G. 2003)
Compus original
clorur de
benzentoniu
Efluent
biodegradare clorur
de benzentoniu
Compus original
dialchil hidroxietil
amoniu metasulfat
Efluent biodegradare
dialchil hidroxietil
amoniu metasulfat
Cyprinuscarpio
TOXIC:
1 mg/l < LC
50

10 mg/l
Clasa I nu exist
toxicitate acut
TU < 0,4
NOCIV / PERICULOS
PENTRU MEDIUL
ACVATIC
10mg/l<LC
50
100mg/l
Clasa I nu exist
toxicitate acut
TU < 0,4
Daphnia magna
PUTERNIC
TOXIC
LC
50
< 1mg/l
Clasa III toxicitate
acuta
1<TU<10
TOXIC:
1 mg/l < LC
50
10 mg/l
Clasa I nu exist
toxicitate acut
TU < 0,4
Selenastrum
capricornutum
PUTERNIC
TOXIC
LC
50
< 1mg/l
Clasa III toxicitate
acuta
1<TU<10
TOXIC:
1 mg/l < LC
50
10 mg/l
Clasa III toxicitate
acut
1<TU<10
Vibrio fischeri
TOXIC:
1 mg/l < LC
50

10 mg/l
Clasa III toxicitate
acuta
1<TU<10
TOXIC:
1 mg/l < LC
50
10 mg/l
Clasa III toxicitate
acut
1<TU<10
Toxicitate
microbian
TOXIC TOXIC
TOXICITATE
SCAZUT
TOXICITATE
SCAZUT
.......zona marcat indic pstrarea gradului de toxicitate al compusului original i dup biodegradare;
.......zona marcat indic scderea efectului de toxicitate;
.......zona marcat indic scderea efectului de toxicitate pn la nepericulos pentru mediul acvatic.
Rezultate experimentale toxicitate n produse
In acest subcapitol s-a urmrit evidenierea efectelor toxice ale substanelor active (surfactani cationici) din
compoziia produselor comerciale tip biocid (algicid) n vederea estimrii comportamentului toxicologic n
amestec cu alte ingrediente.
Pentru a evalua toxicitatea unui produs cationic comercial (clasat ca biocid algicid) au fost efectuate
teste de laborator pentru determinarea toxicitii acute a acestuia asupra creterii algelor verzipe baz de
clorur alchilbenzildimetil amoniu C12-C16 (50%) CAS 68424-85-1.
18
Experimentul efectuat a evideniat c surfactanii cationici utilizai n produse biocide i menin gradul de
toxicitate n amestec cu alte ingrediente, n funcie de proporia utilizat (ex. n cazul de mai sus proporia de
surfactant cationic a fost de 50% , 2% etilenglicol i 48% ap, doza recomandat fiind de 2 mg/l) i de scopul
n care este utilizat produsul.
Conform reglementrilor internaionale n vigoare putem afirma cprodusul algicid, este puternic toxic /
foarte toxic pentru algele de ap dulce din specia Selenastrum capricornutum, valoarea CE
r
50 estimat
experimental fiind <1mg/l.
CAPITOTUL VII - Evaluarea stresului oxidativ indus de expunerea la surfactanii cationici i
amfoterici
Un alt obiectiv important al lucrrii l constitue identificarea i evaluarea efectelor toxice ale surfactanilor
cationici i amfoterici la nivelul sistemului antioxidant de aprare al petilor.
Pentru ndeplinirea acestui obiectiv s-a selectat specia de pete Cyprinus carpio, reprezentativ pentru apele
de suprafa din Romania i au fost selectai pentru testare: clorura de benzentoniu (cationic, CAS 121-54-0,
Hyamina 1622) i cocamidopropil betaina (amfoteric, CAS 4292-10-8, CAPB).
Caracterizarea testului de toxicitate acut efectuat n vederea prelevrii de organe
A fost efectuat un test de toxicitate acut, 96 h, semistatic (cu schimbarea soluiilor de testat n proporie de
75% la 48h pentru meninerea constant a concentraiilor de surfactant), n vase de testare de 100 litri,
utiliznd 40 de exemplare de pete / substan testat i martor, respectndu-se condiiile de testare ale
metodei de referin - OECD 201. Materialul biologic utilizat a fost puiet de crap (sp. Cyprinus carpio) n
vrst de 1 an, specie autohton, specific apelor dulci din Romnia, aclimatizat n laborator.
S-au testat clorura de benzentoniu i cocamidopropil betaina n concentraii individuale de 1mg/l.
Concentraii analitice determinate n soluiile de testare pe parcursul testului (monitorizare la fiecare 24h) au
fost: clorura de benzentoniu 0,54 0,87 mg/l (DIN 38409/20-1989); cocamidopropil betaina 0,55-0,89 mg/l -
Metoda Orange II (Boiteux, 1984).
n timpul testului s-au monitorizat i ali parametrii fizico-chimici precum: CCOCr [pentru clorura de
benzentoniu, n medie - 14,4 mgO
2
/l (24 h), 28,8 mgO
2
/l (48 i 72h) i 105,6 mgO
2
/l (96h); pentru
cocamidopropil betain, n medie - 28,8 mgO
2
/l (24 h), 86,6 115,2 mgO
2
/l (48 i 72h) i 259,2 mgO
2
/l
(96h)], pH (6,94 7,86 uniti de pH), oxigen dizolvat (3-4mgO
2
/l), materii n suspensie (5,2 12,4 mg/l) i
temperatur (20-21
o
C).
Dup 96h de testare s-au nregistrat urmtoarele mortaliti: clorura de benzentoniu (1 mg/l): 4 peti 10%;
cocamidopropil betaina (1mg/l): 0 peti 0%; martor: 0 peti 0%.
Prelevarea probelors-a efectuatla 24h, 48h i 96h s-au sacrificat cte 5 exemplare intoxicate i martor pentru
fiecare substan testat n vederea prelevri organelor de interes: ficat, intestine, branhie, muchi rou,
muchi alb, gonadapentru analiza biochimic (probe conservate prin nghe la -80
o
C i histologic (probe
fixate n formol tamponat).
Omogenitatea loturilor de organisme luate n testarea a fost asigurat prin cntrirea (58 10g) i msurarea
(152cm) fecrui individ i calculul indicilor hepatosomatici i gonadosomatici care nu au evideniat
modificri semnificative din punct de vedere statistic fa de lotul martor.
Extractele proteice s-au obinut din fiecare prob de organe intoxicate i martor (ficat, rinichi, intestin i
branhie prelevate la 24h, 48h, 96h), utiliznd tampon 0,1M TRIS-HCl 5mMEDTA, pH 7,4. Omogenatele
au fost incubate 60 min la 4
o
C, centrifugate 30 min la 8000-10000 rpm la 4
o
C, dup care s-a preluat
supernatantul limpede, utilizat ulterior n analiza biochimic.
19
Testele biochimice au presupus urmrirea urmtorilor biomarkeri:
activitile enzimatice specifice a enzimelor antioxidante implicate n procesul de stres oxidativ:
Superoxid dismutaza (SOD) metoda Paoletti (1986), Catalaza (CAT)- metoda Aebi (1974),
Glutation peroxidaza (Gpx)metoda Beutler (1984), Glutation S transferaza (GST)-metoda Habig
(1974), Glutation 6 fosfat dehidrogenaza (G6PDH) metoda Lohr i Waller (1974), Lactat
dehidrogenaza (LDH) [Bergmeyer H. U. i Bernt E., 1974]., Glutation reductaza (Gred)
metoda Goldberg i Spooner (1983);
peroxidare lipidic prin determinarea indirect a malondialdehidei (MDA) metoda Draper and
Hadley (1990);
grupri carbonil (metodaLevine R.L., 1990), tiol (metoda Jocelyn P.C., 1987; Riener C. i colab.,
2002) i glutation (Kit Chemicon);
profil proteic din muschi alb i rou [S.A.M. Martin i colab, 2001, Anderson N.L si cola., 1991].
evideniere zimografic metaleproteinaze matriceale MMP2 i MMP9 din muchi rou i alb
[Chadzinska M., 2008]
Rezultate experimentale
Dozare enzimelor antioxidante
Experimentele de dozare a activitaii enzimatice a enzimelor antioxidante au fost conduse pe lizate celurare
ale organelor (ficat, branhii, rinichi, intestine) prelevate de la petii (crap Cyprinus carpio) supui aciunii
toxice a surfactanilor. Analizele biochimice au fost efectuate pe un lot de cte 5 indivizi per substan testat
i interval de intoxicare (24h, 48h, 96h), procedurile biochimice fiind aplicate n triplicat pentru obinerea de
date relevante i reproductibile. Pentru fiecare interval s-a calculat deviaia standard i s-a evaluat statistic
cota nivelului efectului toxic comparativ cu martorul utiliznd programul XCEL, funcia TTEST.
Activitatea enzimatic SOD i CAT
n figurile 3 i 4 se evideniaz scderea activitii catalazei, n cazul surfactantului amfoteric, mult mai
pronunat fa de tratamentul realizat cu Hyamin n cazul ficatului, precum i creterile importante
observate la branhii, rinichi i intestin, ceea ce a scos n eviden toxicitatea CAPB prin generare de radicali
liberi ai oxigenului precum anion superoxid.
Figura nr. 3 Nivelul activitaii
enzimatice SOD i CAT n ficat,
branhie, rinichi i intestin
intoxicate cu 1 mg/l Hyamin n
intervalul de testare 24h, 48h i
96h.*P<0,05 efect semnificativ
fa de martor; **P<0,01 efect
distinct semnificativ fa de
martor; ***P<0,001 efect foarte
semnificativ fa de martor.
20
Figura nr. 4 Nivelul activitaii
enzimatice SOD i CAT n ficat,
branhie, rinichi i intestin
intoxicatecu 1 mg/l CAPB n
intervalul de testare 24h, 48h i
96h. *P<0,05 efect semnificativ
fa de martor;
Dozarea acestor enzime antioxidante din organele analizate intoxicate cu Hyamin au evideniat amplificarea
activitii CAT ceea ce indic prezena unui nivel ridicat de peroxid de hidrogen care inactiveaz SOD, fapt
confirmat de ali cercettori [Bray i colab, 1974]. Se poate aprecia c expunerea la CAPB, genereaz un
rspuns adaptativ la nivelul rinichiului, branhiei i intestinului.
Zimografie SOD
n figura nr. 5 se poate observa c n intoxicaia cu Hyamin la nivelul ficatului, izoforma de Mn- SOD are
o activitate mai redus n comparaie cu martorii de interval. Forma Cu-SOD prezint o arie a peak-ului
relativ mai mare n primele 24h de intoxicaie cu Hyamin, dup care efectul scade gradual comparativ cu
martorul pn la 96h. Aceast diferen de activitate ntre cele doua izoforme sugereaza faptul ca prima int
a toxicitaii Hyaminei este mitocondria, fiind probabil cea mai afectat. Efectul cel mai pronunat se observ
la 96h dup intoxicaie n cazul ambelor izoforme de SOD. De asemenea se poate observa variabilitatea ntre
indivizi n ceea ce privete numrul izoformelor existente la nivelul citosolului i mitocondriei.
Analiznd comparativ valorile activitaii superoxid dismutazei totale determinate prin metoda
spectrofotometric i cele evideniate zimografic se poate concluziona c scderea activitaii SOD la nivel
celular se datoreaz n egal masur ambelor izoenzime.
Figura nr. 5 Zimografie SOD (Hyamin)
Activitatea enzimatic a GPX, GST i GRED
Figurile nr. 7 i 8 evideniaz, activitatea GRED sczut evideniat la toate intervalele de intoxicare cu
Hyamin i CAPB, ceea ce indic ntr-o mare msur nivelul sczut de GSH (tioli liberi) existent la nivelul
ficatului, rinichiului i intestinului. Deci, se poate sugera implicarea glutationului n reaciile de detoxifiere a
organismului de compusul poluant i metaboliii si. O biodisponibilitate sczut a glutationului mpiedic
exercitarea funciei la valori normale a enzimei antioxidante GPX.
Figura nr. 7 Nivelul activitaii
21
enzimatice GPX, GST i GRED n
ficat, branhie, rinichi i intestin
intoxicate cu 1 mg/l Hyamina n
intervalul de testare 24h, 48h i 96h.
*P<0,05 efect semnificativ fa de
martor; **P<0,01 efect distinct
semnificativ fa de martor;
***P<0,001 efect foarte
semnificativ fa de martor.
Figura nr. 8 Nivelul activitaii
enzimatice GPX, GST i GRED n
ficat, branhie, rinichi i intestin
intoxicate cu 1 mg/l CAPB n
intervalul de testare 24h, 48h i 96h.
*P<0,05 efect semnificativ fa de
martor; **P<0,01 efect distinct
semnificativ fa de martor;
***P<0,001 efect foarte
semnificativ fa de martor.
Modularea activitii specifice a LDH i G6PDH
Intoxicaia cu surfactanii studiai, au condus n ambele cazuri, la modificri de activitate enzimatic ale
enzimelor LDH i G6PDH, toate organele fiind afectate. S-a observat, c n general activitile LDH i
G6PDH scad, excepie la nivelul rinichiului n cazul ambelor substane testate, activitatea LDH crete
semnificativ dup 96h. Avnd n vedere faptul c LDH catalizeaz transformarea piruvatului n lactat,
creterea activitii observat la nivelul rinichiului sugereaz intensificarea metabolismului anaerob pentru
perioada de timp n care se acumuleaz excesiv compui la nivel tisular. Este posibil ca n prezena acestor
surfactani s se modifice structura membranelor mitocondriale deranjnd probabil fosforilarea oxidativ. n
acest context, este posibil ca glicoliza sa fie activat pentru sintez rapid de ATP.
Figura nr. 9 Nivelul activitaii
enzimatice LDH i G6PDH n ficat,
branhie, rinichi i intestin intoxicate
cu 1 mg/l Hyamina n intervalul de
testare 24h, 48h i 96h. *P<0,05
efect semnificativ fa de martor;
**P<0,01 efect distinct semnificativ
fa de martor; ***P<0,001 efect
foarte semnificativ fa de martor.
22
Figura nr. 10 Nivelul activitaii
enzimatice LDH i G6PDH n ficat,
branhie, rinichi i intestin intoxicate
cu 1 mg/l CAPB n intervalul de
testare 24h, 48h i 96h. *P<0,05
efect semnificativ fa de martor;
**P<0,01 efect distinct semnificativ
fa de martor; ***P<0,001 efect
foarte semnificativ fa de martor.
Peroxidare lipidic
Nivelul peroxidrii lipidice exprimate sub form de malondialdehid n organele analizate de la petii expui
la cele dou tipuri de surfactani sunt prezentate n figurile nr. 11 i 12.
Analiznd rezultatele s-a apreciat ca intoxicaia cu Hyamin afecteaz organele n urmtoarea ordine:
branhie, ficat, rinichi, intestin; iar intoxicaia cu CAPB prezint specificitate n primul rnd pentru rinichi i
branhii, urmate de ficat i intestin.
Peroxidarea lipidic nregistrat dup intoxicaia acut cu CAPB este net superioar Hyaminei, fapt ce
puncteaz n mod cert o deteriorare a membranelor celulare, pierderea homeostaziei celulare i formarea
aducilor dintre MDA i proteine sau ADN, care explic toxicitatea compusului i conduc n cele din urm la
carcinogenez.
Figura nr. 11 Variaia MDA n ficat, branhii i
rinichi intoxicate cu 1mg/l Hyamin
Figura nr. 12 Variaia MDA n ficat, branhii i
rinichi intoxicate cu 1mg/l CAPB
*P<0,05 efect semnificativ fa de martor; **P<0,01 efect distinct semnificativ fa de martor; ***P<0,001 efect foarte
semnificativ fa de martor.
Evaluarea nivelului de Glutation redus (GSH)
Concentraia de GSH la nivelul ficatului, rinichiului i branhiei, a sczut n raport cu martorii la toate
intervalele de expunere la ambele substane testate (figurile nr. 13 i 14). Aceste rezultate ne conduc la
concluzia inducerii unei stri de stres oxidativ la nivelul acestor organe ca urmare a unei concentraii
23
crescute de radicali liberi determinai de prezena acut a toxicului. Rezultatele pot fi corelate de asemenea
cu nivelele sczute ale activitii enzimelor GRED i GST care utilizeaz moleculele de GSH n procesul de
detoxifiere a organismului.
Figura nr. 13 Variaia GSH n ficat, branhii i
rinichi intoxicate cu 1mg/l Hyamin,
***P<0,001 efect foarte semnificativ fa de martor
Figura nr. 14 Variaia GSH n ficat, branhii i rinichi
intoxicate cu 1mg/l CAPB
Dozare grupri tiol (SH)
n cazul nivelului de SH proteice, la nivelul ficatului, modificrile sunt foarte semnificative, ncepnd cu
scdere la 24h i 48h i continund cu o cretere foarte semnificativ la 96h. n cazul branhiei intoxicate cu
Hyamin s-a putut observa cretere la 24h i 48h, ns dup 96h s-a constat revenirea n limitele martorului,
ceea ce ar putea specula c branhiile reuesc s treac cu bine peste ocul intoxicaiei acute cu Hyamin, dei
acest lucru nu e confirmat de celelalte determinri.
n intoxicaia cu CAPB a branhiei s-a observat ncadrarea n limitele martorului la 24h i 48h, ns dup 96h
nivelul SH proteice crete foarte semnificativ.
n preparatele obinute din muchiul alb s-au observat creteri distinct semnificative n cazul ambelor
substane testate. n muchiul rou creterile distinct semnificative de la 24h i 48h sunt compensate de
scderea brusc la 96h, efect ce se poate pune pe seama micorrii stocului existent de GSH i ali
antioxidani neproteici cu mas molecular mic.
Figura nr. 15 Variaia SH proteice n muchiul
alb
Figura nr. 64 Variaia SH proteice n muchiul rou
*P<0,05 efect semnificativ fa de martor; **P<0,01 efect distinct semnificativ fa de martor; ***P<0,001 efect foarte semnificativ fa de martor.
24
Dozarea gruprilor carbonil
n muchiul alb i rou (figurile nr. 17 i 18) s-a evideniat creterea semnificativ a concentraiei de
carbonili la toate intervalele de intoxicare n cazul ambelor substane studiate. Semnificativ este creterea
gradual nregistrat la nivelul muchiului rou care se datoreaz n special metabolismului aerob al acestui
esut, expunerea la surfactani determinnd oxidarea proteinelor i formarea gruprilor carbonil.
Figura nr. 17 Variaia gruparilor carbonil n
muchiul alb
Figura nr. 18 Variaia gruparilor carbonil n
muchiul rou
*P<0,05 efect semnificativ fa de martor; **P<0,01 efect distinct semnificativ fa de martor.
Profil proteic muchi
Intoxicaia acut cu Hyamin a determinat n muchiul alb, la 96 h, o cretere a densitilor optice a formelor
moleculare cu masele de: 327, 142, 64, 51, 29, 22 kDa, cea mai mare cretere evideniindu-se pentru forma
molecular cu masa de 64kDa (figura nr. 19).
La nivelul muchiului rou, Hyamina a provocat o cretere a densitii optice a formei moleculare cu masa de
42 kDa. Dup 48 h nu s-au nregistrat modificri semnificative n raport cu martorul de interval, iar dup 96h
de expunere la poluant s-a observat scderea valorilor densitii optice a formelor moleculare cu masele de
176, 118, 42 i 3 kDa (figura nr. 20).
Figura nr. 19 Profil proteic
muscular muchi alb,
intoxicaie cu 1mg/l
Hyamin
Figura nr. 20 Profil proteic
muscular muchi rou,
intoxicaie cu 1mg/l
Hyamin
Figura nr. 21 Profil
proteic muscular muchi
alb, intoxicaie cu 1mg/l
CAPB
Figura nr. 22 Profil
proteic muscular muchi
rou, intoxicaie cu 1mg/l
CAPB
25
S-a constatat c CAPB determin creterea densitaii optice a formei moleculare cu masa de 42 kDa. Dup
96h de expunere la poluant s-a nregistrat cretere ariei peak- ului b-actinei cu 31% fa de martor (figurile
nr. 21 i 22)
Metaloproteinaze matriceale n muchi
Nivelul activitii metaloproteinazelor matriceale MMP2 (cu mas molecular de 72 kDa) din extractul de
muchi alb intoxicat cu Hyamin, nregistreaz o scdere n raport cu martorul la nceputul intervalului de
expunere, crete semnificativ dup 48 h i pstreaz valori crescute i dup 96 h. Activitatea MMP9, cu mas
molecular de 92 kDa a crescut n toate intervalele de expunere la poluant fa de martorul de interval
(figura nr. 21).
Figura nr. 21 Activitatea metaloproteinazelor MMP2 i MMP9 din
muchiul alb, intoxicaie cu 1mg/l Hyamin
Figura nr. 22 Activitatea
metaloproteinazelor MMP2, MMP9
din muchiul rou, 1mg/l Hyamin
Nivelul activitii metaloproteinazelor matriceale MMP2 din extractul de muchi rou intoxicat cu Hyamin,
nregistreaz o cretere n raport cu martorul la toate intervalele de intoxicare. Activitatea MMP9, este
inhibat la nceputul intervalului de expunere i crete dup 48 si 96 h de expunere (figura nr. 22).
Figura nr. 23Activitatea metaloproteinazelor MMP2 i MMP9 din muchiul alb, intoxicaie cu 1mg/l CAPB
26
Nivelul activitii metaloproteinazelor matriceale MMP2 din extractul de muchi alb intoxicat cu CAPB,
nregistreaz o scdere n raport cu martorul la nceputul intervalului de expunere, dup care nregistreaz
creteri uoare la 48h i 96h. Activitatea MMP9 a crescut n toate intervalele de expunere la poluant fa de
martorul de interval (figura nr. 23)
Figura nr. 24 Activitatea metaloproteinazelor MMP2 i MMP9 din muchiul rou, intoxicaie cu 1 mg/l
CAPB
Nivelul activitii metaloproteinazelor matriceale MMP2 in extractul de muchi rou intoxicat cu CAPB
(figura nr. 24), nregistreaz o cretere n raport cu martorul n toate intervalele de timp testate. Activitatea
MMP9 se ncadreaz n limita martorului la nceputul intervalului de expunere, dar crete dup 48 i 96 h de
expunere.
Interesant este faptul c n cazul intoxicaiei acute cu Hyamin se activeaz MMP-2, iar n cazul intoxicaiei
cu CAPB se activeaz MMP-9. Aceast diferen evideniaz enzime i mecanisme diferite implicate n
refacerea matrixului extracelular i regenerarea tisular la nivelul celor dou tipuri de muchi. Creterea
nivelului de activare a metaloproteinazelor MMP2 i MMP9 determin refacerea tisular i vindecarea
leziunilor survenite din cauza aciunii toxice a poluantului la nivelul muchiului rou.
CAPITOLUL VIII - EVALUAREA MODIFICRILOR HISTOLOGICE
Scopul prezentului capitol a fost evidenierea modificrilor histologice la nivel tisular provocate de
intoxicaia petilor cu clorur de benzentoniu (Hyamin 1622) i cocamidopropil betain. Pentru evidenierea
efectelor acute ale surfactanilor testai s-a ales metoda de colorare hematoxilin-eozin, permind decelarea
efectelor structurale la nivelul mai multor organe vitale (ficat, branhie, rinichi, intestine, muchi alb i rou,
etc.). Petii supravieuitori (specia Cyprinus carpio, crap) intoxicai timp de 96h cu cte 1mg/l surfactant
cationic i amfoteric, au fost sacrificai la intervalele de 24h, 48h i 96h pentru prelevarea organelor de
interes n vederea investigaiilor histopatologice.
S-a constatat c surfactantul cationic (clorura de benzentoniu) determin urmtoarele modificri: ficat
vacuolizarea hepatocitelului i hipertrofierea unor nuclei ai celulelor hepatice; branhie congestie vascular,
lamele branhiale clavate i fuziune; rinichi vacuolizarea epiteliului tubulilor uriniferi, formare de agregate
de macrofage i dilatarea spaiului capsulei Bowman; intestine vacuolizarea citoplasmei celulelor
epitelialei tendin de fuziune a vilozitilor (figurile nr. 26, 27, 28, 29).
27
n cazul surfactantului amfoteric (cocamidopropil betain) s-au observat urmtoarele efecte: ficat apariia
zonelor necrotice, fomare de agregatelor de macrofage i capilare dilatate; branhii - congestie vascular,
lamele branhiale clavate i fuziune; rinichi- hipertrofierea nucleilor, necreoze la nivelul epiteliului tubulilor
uriniferi; intestine - vacuolizarea citoplasmei celulelor epiteliale i tendin de fuziune a vilozitilor (figurile
nr. 25 i 30).
Figura nr. 25 Seciune prin ficat dup intoxicaie acut
cu CAPB dupa 96 h; H-E, x 40; Agregate de
macrofage; Capilare sinusoide dilatate
Figura nr. 26 Seciune prin ficat dup intoxicaie
acut cu Hyamin 96 h; H-E, x 40; Vacuolizarea
hepatocitelor
Figura nr. 27 Seciune prin ficat dup intoxicaie acut
cu Hyamin 48 h H-E, x 20; Lamel clavat sau
anevrism lamelar
Figura nr. 28 Seciune prin ficat dup intoxicaie
acut cu Hyamin 48 h H-E, x 240; Fuziunea
lamelelor branhiale
Figura nr. 29 Seciune prin rinichi dup intoxicaie
acut cu Hyamin 96 h, H-E, x 40;Sgeata-Vacuolizarea
epiteliului tubulilor uriniferi; Stelu-Agregat de
macrofage
Figura nr. 30 Seciune prin rinichi dup intoxicaie
acut cu CAPB 96 h, H-E, x 40;
Necrozarea epiteliului tubulilor uriniferi
Analiza histologic a organelor analizate a scos in eviden urmtoarele:
Modificrile structurale provocate de cei doi ageni de suprafa nu sunt specifice i au fost identificate
i n cazul expunerii la alte categorii de xenobiotice;
28
Modificrile structurale au afectat organe vitale implicate n detoxifierea organismului: ficat, rinichi,
branhie, debutnd dup intervale scurte de expunere acut la poluant (24 h);
Majoritatea modificrilor structurale sunt considerate compatibile cu funcionarea esuturilor i
supravieuire, ns au aprut i anomalii severe i foarte severe: anevrism, rupturi celulare, focare de
necroz care periclizeaz buna funcionare a esutului;
Analiza histologic a fragmentelor de organe poate constitui un biomarker n monitorizarea calitii apei
i al efectelor compuilor deversai n bazinele acvatice
CAPITOLUL IX - CARACTERIZAREA RISCULUI ACVATIC
Prezenta lucrare s-a finalizat prin elaborarea unei metodologii de evaluarea a riscului acvatic utilizat n
scopul evalurii efectelor adverse ale expunerii surfactanilor cationici i amfoterici asupra componentei
acvatice.
Scopul metodologiei a fost de a evalua i caracterizarea riscului acvatic generat de agenii de suprafa
cationici (Hyamina 1622 CAS 121-5400) i amfoterici (cocamidopropil betaina CAS 4292-10-8) i
estimarea unor concentraii maxim admise n apele de suprafa astfel nct s nu fie pus n pericol viaa
organismelor acvatice pe ntreg lanul trofic.
Evaluarea riscului acvatic a presupus colectarea de informii i obinerea de date in-house pentru a se estima
concentraia de surfactani cationici i amfoterici n componenta acvatic (predicted expousure
concentration, PEC acvatic) i concentraia la care nu sunt observate efecte adverse asupra organismelor
(no-effect concentration,PNEC acvatic). Compararea acestor informaii ne-a permis s stabilim dac
substanele studiate au sau nu efecte nocive asupra mediului acvatic prin raportul PEC/ PNEC n care
valoarea PEC trebuie s fie mai mic dect valoarea PNEC astfel nct subtanele s nu prezinte risc acvatic.
Pentru substanele individuale raportul PEC/PNEC trebuie s fie <1, ceea ce indic faptul c nu va fi nevoie
de noi cercetri pentru identificarea unui potenial risc.
Avnd n vedere metodologiile internaionale de evaluare a riscului ecologic [EPA 1997, CESIO 1996,
HERA 2008, HERA 2005, TDG 2003] i informaiile obinute n cadrul acestei lucrri, pentru evaluarea i
caracterizarea riscului acvatic al surfactantilor studiai, propunemurmtoarele etapeconformfigurii nr. 31:
29
Figura nr. 31 Plan de evaluare a riscului acvatic pentru surfactani
30
Metodologia aplicat a permis elaborarea a doua studii de caz privind evaluarea riscului acvatic, dup cum
urmeaz:
Surfactani cationici de tipul srurilor quaternare de amoniu (ex. Clorura de Benzentoniu /
Hyamina 1622 CAS: 121-54-0)
Tabel nr. 8 Estimarea coeficienilor de risc acvatic conform normelor OECD, EC i ECETOC
Valoare PEC
(ap de suprafa)
Valoare CE50/NOEC
Factor de aplicare la cea mai
mic valoare CE50 /NOEC
Valoare
PNEC acvatic
Coeficient de Risc
(PEC/PNEC)
PEC
max
= 0,2 mg/l
[NICNAS, 2003]
0,39 mg/l (alge)[*]
[in-house]
100 (OECD)
1000 (EU)
200 (ECETOC)
0,0039
0,00039
0,00195
51,28
512,20
102,56
0,004 mg/l (Daphnia) [**]
[NICNAS, 2003]
10 (conform OECD si EU) 0,0004 500
0,05 mg/l (alge) [***]
[in-house]
100 (OECD) 0,0005 400
PEC
min
=0,002 mg/l
[NICNAS, 2003]
0,39 mg/l (alge) [*]
[in-house]
100 (OECD)
1000 (EU)
200 (ECETOC)
0,0039
0,00039
0,00195
0,51
5,12
1,025
0,004 mg/l (Daphnia) [**]
[NICNAS, 2003]
10 (OECD si EU) 0,0004 5
0,05 mg/l(alge)[***]
[in-house]
100 (OECD) 0,0005 4
PEC
max
=0,01 mg/l
[in- house]
0,39 mg/l (alge) [*]
[in-house]
100 (OECD)
1000 (EU)
200 (ECETOC)
0,0039
0,00039
0,00195
2,56
25,64
5,12
0,004 mg/l (Daphnia) [**]
[NICNAS, 2003]
10 (OECD si EU) 0,0004 25
0,05 mg/l (alge) [***]
[in-house]
100 (OECD) 0,0005 20
Concluzia final Coeficient de risc >1 surfactaii cationici (srurile quaternare de amoniu /Hyamina 1622) prezint risc
asupra componentei acvatice la concentraii estimate de 0,01-0,2 mg/l. Conform datelor experimentale
obinute in- house i/sau publicate n literatur, exist posibilitatea ca la concetraii 0,002 mg/l n apa de
suprafa, s nu mai prezinte efecte toxice asupra organismelor acvatice.
Observaii: [*] Au fost efectuate trei teste de toxicitate acute (peti, alge i crustacee) i s-a selectat cea mai mica valoare CE50; [**] Au fost
identificate n literatur valorile de toxicitate cronic pentru crustacee i peti din care s-a selectat cea mai mica valoare NOEC; [***] S-a determinat
in-house NOEC pentru alge.
Surfactani amfoterici de tipul Coco alchil derivai (ex. Cocamidopropil betain/ laurilamidopropil
betaine / AMFODAC LB CAS: 4292-10-8)
Tabel nr. 9 Estimarea coeficienilor de risc acvatic conform normelor OECD, EC i ECETOC
Valoare PEC
acvatic
(ap de suprafa)
Valoare CE50/
NOEC
Factor de aplicare la cea mai
mic valoare CE50 /NOEC
Valoare
PNEC acvatic
Coeficient de Risc
(PEC/PNEC)
0,002 mg/l
[in- house]
5,55 mg/l (alge) [*]
[in-house]
100 (conform OECD)
1000 (conform EU)
200 (conform ECETOC)
0,055
0,0055
0,027
0,036
0,36
0,074
0,5 mg/l (alge) [***] [in-
house]
100 (OECD) 0,005 0,4
0,09 mg/l (alge) [**]
[IUCLID 2000]
10 (conform OECD / EU) 0,009 0,22
0,0019 mg/l
[Kazuaki M. et al,
2008].
5,55 mg/l (alge) [*]
[in-house]
100 (conform OECD)
1000 (conform EU)
200 (conform ECETOC)
0,055
0,0055
0,027
0,034
0,34
0,07
0,5 mg/l (alge) [***] [in-
house]
100 (OECD) 0,005 0,38
0,09 mg/l (alge) [**]
[IUCLID 2000]
10 (conform OECD / EU) 0,009 0,21
Concluzie final Coeficient de risc <1 substanta nu prezinta risc asupra componentei acvatice la concentratii estimate in
componenta acvatica pana la 0,01 mg/l
Observaii: [*] Au fost efectuate trei teste de toxicitate acute (peti, alge i crustacee) i s-a selectat cea mai mic valoare CE50; [**] Au fost
identificate n literatura valorile de toxicitate cronic pentru crustacee i peti din care s-a selectat cea mai mic valoare NOEC; [***] S-a determinat
in-house NOEC pentru alge.
31
CONCLUZII GENERALE
Prezenta tez de doctorat a avut ca principal obiectiv caracterizarea ecotoxicologic a agenilor de suprafa
cationici i amfoterici respectnd cerinele Regulamentului European CE nr. 648/2004 i evaluarea
riscului acvatic.
Pentru evidenierea aportului de noutate al prezentei teze de doctorat, n prima parte a tezei de doctorat s-a
realizat stadiul cunoterii, cu accent deosebit asupra surfactanilor cationici i amfoterici, privind
consideraiile generale ale detegenilor, respectiv tipuri i utilizri, aspecte ecotoxicologice
(biodegradabilitate, toxicitate, bioacumulare, metabolizare), efecte subletale evideniate la nivel fiziologic
(stres oxidativ, posibili biomarkeri ai contaminrii cu surfactani poteniale modificri histologice). De
asemnenea s-au studiat reglementrile naionale i internaionale privind normarea n diverse tipuri de ape i
produse de curat, criterii de comercializare i etichetare ecologic.
Analiza datelor de literatur expuse n capitolul I a condus la concluzia general c exist suficiente studii
de evaluare a ecotoxicitii surfactanilor anionici precum i pentru o mare parte dintre cei neionici, i de
aceea cercetarea viitoare ar trebui ndreptat n mod special pentru elucidarea efectelor toxice ale
surfactanilor cationici i amfoterici al cror profil ecotoxicologic este puin cunoscut, iar proprietile lor
fizico-chimice pot influena semnificativ rezultatele studiilor ecotoxicologice. De asemnea s-a constatat un
numr redus i neclar de informaii privind biodegradabilitatea i toxicitatea compuilor selectai pentru
cercetare (cationici clorura de benzentoniu i amfoterici cocamidopropil betaina).
n general pentru evaluarea ecotoxicitii se recomand metodologia standardizat OECD i ISO,
reglementat i recunoscut la nivel mondial. n ceea ce privete evaluarea gradului de biodegradare, cel mai
des se utilizeaz metodele de biodegradabilitatea ultim aerob reglementat de ctre Regulamentul
648/2004 privind detergenii, iar pentru evaluarea toxicitii se utilizeaz baterii de teste care s acopere
toate nivele trofice din mediul acvatic (pentru acestea se recomand teste acute i cronice n sistem clasic sau
alternativ).
S-a constatat c surfactanii cationici ntmpin probleme de biodegradare aerob, n timp ce surfactanii
amfoterici sunt uor biodegradabili, iar din punct de vedere al toxicitii att surfactanii cationici ct i cei
amfoterici determin efecte acute (fiind clasificai n clasele de toxicitate TOXIC sau MODERAT TOXIC)
asupra petilor, crustaceelor, algelor i bacteriilor.
n consecin, cercetarea experimental din prezenta lucrare a utilizat pentru metodologia OECD i ISO
pentru evaluarea ecotoxicitii i baterii de teste de toxicitate acute, cu timp de execuie i costuri reduse,
conduse pe organisme acvatice specifice apelor de suprafa din Romnia (crap, purici de balt, alge verzi i
bacterii).
Capitolul II a evideniat c n literatura de specialitate nu exist date privind efectele surfactantului cationic
- clorura de benzentoniu i amfoteric - cocamidopropil betain, asupra sistemelor enzimatice de aprare din
organismul petilor, drept pentru care rezultatele obinute n acest sens au constituit o noutate la nivel
internaional.
Capitolul III a scos n eviden importana alinierii la reglementrile internaionale privind detergenii,
respectiv Regulamentul 648/2004 privind detergeniii amendamentele ulterioare care impune reguli
stricte de comercializare a produselor de curat n vederea asigurrii proteciei sntii umane i a mediului.
De asemenea prezentul regulament prevede i ghiduri de evaluare a riscului complementar determinat de
surfactani n urma biodegradrii prin formare de metabolii potenial recalcitrani.
Acest capitol a subliniat un aspect foarte important pentru evidenierea noutii subiectului abordat, acela c
surfactanii cationici i amfoterici nu sunt normai n apele uzate i apele de suprafa de ctre legislaia
naional i internaional.
32
n a doua parte a tezei au fost prezentate experimentele de laborator i rezultatele (privind biodegradarea,
toxicitatea i efectele la nivelul sistemelor de aprare ale organimelor acvatice peti) care au condus n final
la caracterizarea ecotoxicologic a surfactanilor cationici i amfoterici i evaluarea riscului acvatic.
n acest scop, n vederea experimentrii au fost selectai surfactanii cationici (din clasa srurilor
quaternare de amoniu), utilizai frecvent n fabricarea detergenilor i balsamurilor de rufe i vase, dar i n
produse biocide,precum i surfactanii amfoterici (din clasa coco alchil derivailor)folosii la fabricarea
produselor de ngrijire personal (ampoane, balsam pentru pr, spun lichid i loiuni de curare pentru
fa) i n industria detergenilor de curare.
n capitolul IV au fost prezentate metodele analitice i parametrii lor de performan, aplicate pentru
determinarea catitativ a surfactanilor cationici i amfoterici (specificate n anexele Regulamentul European
nr. 648/2004/CE) sunt tehnici spectrofotomerice, de rutin care implic costuri sczute. Limitele de detecie
n soluii apoase sintetice / probe de mediu contaminate (ape uzate i ape de suprafa) oferite de aceste
metode sunt: 0,003 mg/l pentru surfactanii cationici i 0,002 mg/l pentru surfactanii amfoterici.
Interferenele metodelor sunt determinate de prezena altor categorii de surfactani (anionici, cationici,
substane organice) care reacioneaz fie cu surfactantul int fie cu reactivul de culoare formnd compui
stabili. Aceste probleme pot fi nlturate prin utilizare rinilor schimbtoare de ioni care separa surfactanii
int.
Selectivitate metodei pentru probele sinstetice a fost asigurat prin utilizarea curbelor etalon realizate pentru
principalele substane studiate (Hyamin, Tetranyl i cocamidopropil betain). Pentru detecia selectiv a
compuilor cationici i amfoterici din probele de mediu recomandm utilizarea de tehnici performate tip
HPLC.
Capitolul V a prezentat testele de biodegradabilitate (realizate conform anexelor Regulamentului European
nr. 648/2004/CE) care au demonstrat c surfactanii cationici de tipul srurilor quaternare de amoniu (ex.
dialchil hidroxietil amoniu metasulfat / Tetranyl AT 7590, clorura de benzentoniu/ Hyamina 1622, bromura
de cetilpiridiniu i TEA esterquaii) i amfoterici tip coco alchil derivai (ex. cocamidopropil betaina /
ANFODAC LB) prezint o biodegradabilitate primar 80% i o biodegradabilitate ultim>60%. Conform
criteriilor de conformare ale metodelor aplicate pentru evaluarea gradului de biodegradabilitate, surfactanii
studiai i amestecurile lor respect procentele de biodegradare impuse. Se remarc o biodegradabilitate mai
sczut a surfactanilor cationici comparativ cu surfactanii amfoterici. Rezultatele obinute au fost
comparabile cu datele specificate n literatura de specialitate pentru compui similari privind gradul de
biodegradabilitate a acestor compui.
Capitolul VI a prezentat experimentele de toxicitate acut care au evideniat c surfactanii cationici (clorura
de benzentoniu /Hyamina 1622 i dialchil hidroxietil amoniu metasulfat / Tetranyl AT 7590) a manifestat un
efect de la foarte toxic la nociv pentru toate organismele acvatice testate, cele mai afectate organisme fiind
crustaceele, algele i bacteriile. n ceea ce privete surfactanii amfoterici (cocamidopropil betaina/
ANFODAC LB), acetia au manifestat efect toxic asupra petilor, crustaceelor i algelor, iar asupra bacteriilor
a avut efect slab toxic/ practic netoxic.
Conform reglementrilor n vigoare i asistemelor de clasificare am apreciat c surfactantul cationic - clorura
de benzentoniu, se ncadrez n categoria 1 de toxicitate acutdeoarece prezint efecte puternic toxice pentru
crustacee i alge la concentraii < 1 mg/l. Surfactanii - cationic (dialchil hidroxietil amoniu metasulfat) i
amfoteric (cocamidopropil betain) se ncadrez n categoria 2 de toxicitate acutdeoarece prezint efecte
toxice la concentraii cuprinse n intervalul 1- 10 mg/l.
Caracterul inovativ al experimentelor de toxicitatea acvatic const n selectarea celor doi compui utilizai
n testare (clorura de benzentoniu i cocamipropil betaina) pentru care nu sunt disponibile date de toxicitate
acut asupra speciei de pete Cyprinus scarpio, specific apelor dulci din Romnia.
33
Tot n acest capitol s-a ncercat completarea bazei de informaii privind ecotoxicitatea surfactanilor cationici
i estimarea unui potenial risc complementar, prin studii de toxicitate efectuate pentru lichilele rezultate n
urma biodegradrii. Efluenii de biodegradare ai surfactanilor cationici testai au manifestat efecte toxice
asupra organismelor, gradul de toxicitate variind n funcie de tipul organismului, astfel nct algele i
bacteriile au fost organismele cele mai sensibile, aspect care poate fi corelat cu efectul determinat de
substanele chimice originale asupra acestor specii. Din analiza datelor experimentale s-a evideniat ca
Hyamina 1622 / clorura de benzenthoniu determin un impact toxic pronunat n comparaie Tetranyl AT
7590/ dialichil hidroxietil amoniu metasulfatul, iar faptul c s-au nregistrat efecte toxice ale soluiilor de
ageni de suprafa rezultate n urma proceselor de biodegradare, ne conduce la ipoteza apariiei unor
metabolii de biodegradare cu potenial recalcitrant sau persistena surfactantului n mediul de testare. Pentru
moment dotarea analitic nu permite determinare de metabolii ai surfactanilor fiind necesare echipamente
moderne.
Efectele surfactanilor selectai pentru testare (clorura de benzentoniu i cocamidopropil betaina) asupra
sistemului antioxidant de aprare i inducerea stresului oxidativ, au fost prezentate n capitolul VII.
Concluziile generale obinute n acest sens au fost urmtoarele:
- s-a constatat c ficatul i branhiile au fost organele cele mai afectate de aciunea toxic a surfactantului
cationic cu schimbri semnificative n metabolismul celular. Alturi de afectarea sistemului enzimatic
antioxidant, intensificarea peroxidrii lipidice i scderea GSH confirm faptul c Hyamina determin
toxicitate la nivelul ficatului i branhiilor din Cyprinus carpio prin instalarea stresului oxidativ. Aadar,
clorura de benzentoniu (Hyamina 1622) manifest un efect toxic sub-letal acut cu tendina de impact toxic
pe termen lung.
- intoxicaia cu surfactant amfoteric, a evidentiat o aciune toxic selectiv la ni velul organelor, ficatul i
branhia fiind cele mai afectate. Pe baza analizelor biochimice, care au evideniat instalarea stresului
oxidativ i a peroxidrii lipidice la nivelul organelor studiate, rezult c aceasta substan, care se
regsete la o puritate destul de mic (<50%) manifest un efect toxic sub-letal acut cu tendin de
impact toxic pe termen lung.
Capitolul VIII a evideniat modificrilor histologice la nivel tisular provocate de intoxicaia petilor cu
clorur de benzentoniu (Hyamin 1622) i cocamidopropil betain. S-au constatat modificri ale structurilor
tisulare n ambele cazuri de intoxicare, efectelor fiind evidentiate imediat dup 24 h de la intoxicare. Cele
mai drastice modificri n raport cu martorii s-au evideniat n intoxicaia cu clorura de benzentoniu care
determin vacuolizarea hepatocitelului la nivelul ficatului, congestie vasular la nivelul branhiilor,
vacuolizare i fomare de agregate de macrofage la nivelul epiteliului urinifer. Nici efectele surfactantulul
amfoteric (cocamidopropil betainei) nu sunt de neglijat acesta determinnd zone necrotice la nivelul ficatului
i fuziunea lamemelor branhiale.
Prezenta lucrare s-a finalizat cu elaborarea unei metodologii i cu dou studii de caz privind caracterizarea
riscului asupra componentei acvatice, prezentate n capitolul IX. Prin aplicarea metodologiei de evaluare
risc propus n ultimul capitol al lucrrii, s-a evaluat riscul acvatic generat de clorura de benzentoniu /
Hyamina 1622 (surfactant cationic din clasa srurilor quaternare de amoniu) i cocamidopropil betain/
ANFODAC LB (surfactant amfoteric din clasa coco alchil derivailor).
Evaluarea riscului acvatic a presupus colectarea de informaii privind expunerea la substanele testate
(caracterizare, proprieti, utilizare, ci de ptrundere n mediu, prezena n mediu, biodegradare, etc.) astfel
nct s se permit predicia concentraiei n apa de suprafa (Predicted Expousure Concentration, PEC).
Un al doilea set de informaii (toxicitate acvatic, efecte sub-letale, efecte complementare, etc.) a presupus
estimarea celei mai mari concentraii la care nu sunt observate efecte adverse asupra organismelor acvatice
34
(Predicted No-Effect Concentration, PNEC). Compararea acestor informaii a permis stabilirea riscului
generat de substanele testate asupra mediului acvatic. Utilizarea acestor substane n produse de curat este
permis atunci cnd PEC este mai mic dect PNEC.
Concluziile finale ale studiilor de caz au fost urmtoarele:
Surfactani cationici
Majoritatea valorilor coeficienilor de risc acvatic estimai pentru surfactanii cationici (sruri quaternare de
amoniu) din care face parte clorura de benzentoniu (Hyamina 1622) au fost >1, ceea ce atest faptul c
aceste substane i implicit cea studiat de ctre noi prezint risc asupra organismelor acvatice, apreciere
susinut i de efectele sub-letale evideniate la nivelul sistemelor de detoxifiere a organismelor, precum i de
efectele complementare pe care aceaste substane le poate determina n urma biodegradrii prin persisten
sau generare de metabolii recalcitrani.
Ca urmare a datelor obinute prin acest studiu de risc i avnd n vedere faptul c monitorizarea i normarea
concentraiilor de ageni de suprafa cationici nu sunt reglementate de legislaia naional i internaional
privind calitatea apelor de suprafa, recomandm ca valoarea de 0,002 mg/l s fie stabilit ca limita
maxim admis n apa de suprafa pentru agenii de suprafa cationici cu azot quaternar (implicit
clorura de benzentoniu, dialchil hidroxietil metasulfat, bromura de cetilpiridiniu), astfel nct s nu fie
afectat viaa ecosistemului acvatic.
Surfactani cationici
Coeficientul de risc determinat pentru surfactanii amfoterici (coco achil derivai, ex. cocamidopropil betain
/ laurilamidopropil betain / ANFODAC LB) este < 1 ceea ce conduce la concluzia c aceast clas de
substane nu prezint risc asupra componentei acvatice din Romnia, ns datorit efectelor sub letale
negative evideniate la nivelul organelor de pete mai sunt nc necesare studii n acest sens.
De asemenea, ca urmare a acestui studiu de risc i avnd n vedere faptul c agenii de suprafa amfoterici
nu sunt normai de legislaia naional i internaional, estimm c valoarea de 0,01 mg/l poate fi
considerat calimit maxim admis n apa de suprafa pentru compuii de tip coco alchil derivai (ex.
Cocamodopropil betaina / laurilamidopropil betain / ANFODAC LB), astfel nct s nu fie afectat viaa
ecosistemului acvatic.
Contribuii originale ale prezentei teze de doctorat au fost urmtoarele:
Informaii noi privind caracterizarea ecotoxicologic (biodegradare i toxicitate) a surfactanilor cationici i
amfoterici (n special clorura de benzentoniu i cocamidopropil betaina). Surfactanii studiai se
biodegradeaz primar (>80% eficien de ndeprtare) i ultim (>60% eficien de ndeprtare), cu
meniunea c surfactanii cationici au obinut cele mai mici valori. In ceea ce privete toxicitate acut acvatic
s-a constatat c surfactanii cationici sunt toxici pentru crustacee, alge i bacterii (toxicitate acut categoria
1), iar surfactanii amfoterici sunt toxici pentru peti, crustacee i alge (toxicitate acut categoria 2).
Iniierea evalurii riscului complementar a surfactanilor cationici prin efectuarea de teste de toxicitate a
lichidelor rezultate n urma biodegradrii. Efluenii rezultai n urma biodegradrii surfactanilor cationici i
menin toxicitatea i dup biodegradare asupra algelor i bacteriilor, n timp ce surfactanii amfoterici
determin o toxicitate mai slab comparativ cu substana original.
S-au obinut informaii importante privind efectele clorurii de benzentoniu i cocamidopropil betainei asupra
sistemelor enzimatice de aprare a petilor, respectiv detalii privind inducerea stresului oxidativ de ctre
surfactanii cationici i amfoterici. Ambele subtane induc modificri ale activitilor enzimatice specifice ale
enzimelor antioxidante din organele studiate (cele mai afectate organe fiind ficatul i branhiile) i deteriorri
35
oxidative ale proteinelor ceea ce indic toxicitatea acut (la 0,5mg/l surfactant) cu tendin de impact pe
termen lung.
S-au evideniat efectele acute ale surfactanilor cationici i amfoterici la nivel tisular, cele mai drastice
modificrii fiind identificate la nivelul ficatului, branhiilor i rinichiului. Majoritatea modificrilor
structurale sunt considerate compatibile cu funcionarea esuturilor i supravieuire, ns au aprut
i anomalii severe i foarte severe: anevrism, rupturi celulare, focare de necroz care periclizeaz
buna funcionare a esutului;
Metodologie de evaluare risc acvatic a surfactanilor cationici i amfoterici asupra componentei acvatice i
dou studii de caz specifice claselor de surfactani studiate. Aplicarea metodologiei a condus la obinerea
urmtorilor coeficieni de risc acvatici: surfactanii cationici (clorura de benzentoniu PEC/PNEC >1
prezint risc asupra organismelor acvatice; surfactanii amfoterici (cocamidopropil betaina - PEC/PNEC <1 -
nu prezint risc asupra organismelor acvatice);
S-au stabilit concentraiile maxime admise de surfactani cationici (0,002mg/l) i amfoterici (0,01mg/l) n
apele de suprafa astfel nct s nu fie afectat viaa ecosistemului acvatic pe ntreg lanul trofic;
Aplicabilitate
S-au dezvoltat / implementat metode pentru evaluarea biodegradabilitii ultime i toxicitii acvatice
(conduse pe alge i bacterii) n vederea aplicrii n cercetare i la beneficiari direci. Metodele aplicate au
fost propuse n 2011 pentru implementarea n practic curent de laborator i acreditare RENAR. De
asemenea unele din metodele experimentate au fost utilizate n testarea produselor de curat / biocide ale
beneficiarilor pentru obinerea de rezultate necesare completrii fielor tehnice de securitate i
conformare la legislaia n vigoare.
n ceea ce privete aplicabilitatea legislativ, rezultatele obinute (coeficienii de risc i limitele maxime
admise n apa de suprafa) pot completa / modifica actele normative existente pentru normarea calitii
apei de suprafa (ex. Ordinul 161/2006) i pot influena factorii de decizie pentru elaborarea de programe
de monitorizare a surfactanilor indiferent de tipul lor, n apa de suprafa i apele uzate municipale. De
asemenea pot influena factorii de decizie responsabili pentru implementarea Regulamentului 648/2004
privind detergenii pentru efectuarea unui control mai riguros al produselor din aceast clas pentru
stabilirea caracteristicilor de ecotoxicitate i evaluarea riscurilor.
Recomandri pentru consumatori
- Respectarea dozajelor i utilizarea corect a produselor conform etichetei sau prospectului;
- Folosirea detergenilor compacii sau a celor lichizi, pentru evitarea fosfailor;
- Folosirea detergenilor ecologici identificai pe pia cu un simbol grafic specific n form de floare;
- Depozitarea ie evacuarea adecvat a deeurilor;
- Evitarea splrilor inutile;
- Alegerea corect a produselor, respectiv utilizarea unui produs universal adecvat pentru mai multe
aplicaii.
Ca urmare a cercetrilor efectuate pn n prezent i a informaiilor / datelor prezentate n acest studiu, am
identificat cteva perspective de cercetare privind subiectul agenilor de suprafa cationici i
amfoterici:
36
Dezvoltarea de noi metode analitice de control a agenilor de suprafa cationici i amfoterici, care
datorit complexitii structurale i a matricelor de mediu n care acetia se regsesc, pot produce
interferene, iar utilizarea metodelor clasice spectrofotometrice ridic probleme de sensibilitate i
selectivitate. De asemenea dezvoltarea de metode noi pentru detecia metaboliilor pentru toate clasele de
surfactani.
Caracterizarea i evaluarea riscului determinat de agenii de suprafa cationici i amfoterici asupra
microorganismelor din nmolul activ i organismelor din sediment i sol, deoarece aceste substane active
prezint o mare capacitate de adsorbie pe diverse materii.
Exista nc foarte multe substane cu proprieti surfactante cationice i amfoterice pentru care nu exist
date de literatur privind ecotoxicitatea i riscul asupra componentelor de mediu.
La nivelul Romniei, dar i la nivel internaional, studiile de monitorizare a concentraiilor de ageni de
suprafa n apele de suprafa sunt foarte rare, aceste substane datorit proprietilor lor fizico-chimice
ridicnd probleme de calitate a ecosistemelor acvatice.
Datele privind aciunea surfactanilor asupra sistemelor de detoxifiere a organismelor active evaluarea
impactului pe termen lung i gradul de bioacumulare n diverse esuturi ale organismelor acvatice, sunt
foarte limitate.
37
LISTA PUBLICAIILOR
Lista lucrrilor publicate n reviste I SI
Nr.
crt
Autori Titlul Lucrrii, numele revistei, Vol , Nr, Anul apariiei
1 Gheorghe tefania, Irina
Lucaciu, Rozalia Grumaz
Detergents legislative framework and ecotoxicological testing
methodology, Journal of Environmental Protection and Ecology,
book 3A, vol.12 (2011), 1525-1532, ISSN 1311-5065
2 Gheorghe tefania, Lucaciu
Irina, Pascu Luoana
Biodegradability assessment of cationic and amphoteric raw
materials, Journal of Environmental Protection and Ecology, vol.13,
no.1 (2012), 155-164, ISSN 1311-5065
3. Gheorghe tefania, Irina
Lucaciu, Grumaz Rozalia,
Stoica Ctlina
Acute toxicity assessment of several cationic and amphoteric
surfactants on aquatic organisms, Journal of Environmental
Protection and Ecology, nr vol.13, no.2 (2012), 541-553, ISSN 1311-
5065
4. St. Gheorghe, I. Lucaciu,
E.Stanescu, C. Stoica
Romanian aquatic toxicity testing strategy under REACH, Journal of
Environmental Protection and Ecology, transmis spre publicare
38
Lucrri comunicate i publicate n cadrul conferinelor i simpozioanelor
Nr.
crt
Autori Titlul Lucrrii, denumire manifestare tiinific, perioada
1 Gheorghe tefania, Irina
Lucaciu, Rozalia Grumaz
Detergents legislative framework and ecotoxicological testing
methodology - Conferina Internaional UAB-BENA 2009
Management and Suitainable Protection of Environment Alba Iulia,
POSTER, ISNB 978-973-1890-30-2;
2 Gheorghe tefania, Irina
Lucaciu, Pascu Luana
Removal of surfactants from household cleaning products and/or
cosmetic detergents during the ready biodegradability tests
performed n conformity with the new european regulations,
Internaional Symposium The environment and industry (SIMI)
28-30 octombrie, 2009, Vol. II, pp. 332-342, PREZENTARE
ORAL, ISSN 1843-5831;
3 Gheorghe tefania, Lucaciu
Irina, Pascu Luoana
Ultimate biodegradability assessment of cationic and amphoteric
surfactants Internaional conference on fishery and aquaculture - a
view point upon the sustainable management of the water resources
n the Balkan area, 26-28.05.2010 Galai, Romnia,
PREZENTARE ORAL, publicare CD conferin.
4 Gheorghe tefania, Irina
Lucaciu, Grumaz Rozalia,
Stoica Ctlina
Assessment of cationic and amphoteric surfactants acute toxicity on
several aquatic organisms, WORKSHOP Internaional B.EN.A.
GLOREP 2010, 26-28.11.2010, Timioara, PREZENTARE
ORAL, publicare volum II, pp. 70-73; ISBN: 978-606-554-210-5;
ISBN 978-606-554-212-9
5 Gheorghe tefania, Irina
Lucaciu, Grumaz Rozalia,
Stoica Ctlina
Efectele polurii antropice cu surfactani (cationici i amfoterici)
asupra organismelor acvatice, NEWSLETTER NR. 10 aprilie 2011,
al Proiectului POSDRU/79/1.4/S/53587 Dezvoltarea capacitaii
Comitetului Sectorial pentru formare profesional n Domeniul
Proteciei Mediului n sprijinul imbunatiri calitii formarii
profesionale continue din Romnia SOMEDIU, www.unimed.ro.
6. Gheorghe tefania, Irina
Lucaciu, Anca Dinischiotu,
Stoica Ctlina, Pun Iuliana
Aquatic safety assessment for cationic and amphoteric surfactants,
SIMI 16 18.11.2011 (Simpozion Internaional Mediu i Industria
organizat de INCD ECOIND Bucureti), vol. II, pp. 232-246,
PREZENTARE ORAL, ISSN 1843-5831;
7. Gheorghe tefania, Irina
Lucaciu, Elena Stnescu,
Ctlina Stoic
Romanian aquatic toxicity testing strategy under REACH,
Internaional BENA Conference, Sustainable Landscape Planning
And Safe Environment, 21 -23 06.2012, Istanbul, Turcia, pp. 667-
624, PREZENTARE ORAL, ISBN 978-975-561-421-2; 3
rd
SETAC CEE Annual Meeting, 17-19 September 2012, Cracovia,
Polonia POSTER, pp.138, ISBN 978-83-935990-0-4.
8. Gheorghe tefania, Stan
Miruna, Damache
Georgiana, Stoica Ctlina,
Stnescu Elena, Irina
Lucaciu, Anca Dinischiotu
Effects of cocamidopropil betaine on oxidative stress biomarkers of
the Cyprinus carpio sp., 3
rd
SETAC CEE Annual Meeting, 17-19
September 2012, Cracovia, Polonia, PREZENTARE ORAL,
publicat n Proceedings Ecotoxicology revisited, pp.33-35, ISBN
978-83-935990-0-4.
39
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. Abel P. D., Toxicity of synthetic detergents to fish and aquatic invertebrates. Journal of Fish Biology,
6: 279298 (1974);
2. Aebi H, Catalase in vitro. In: Packer L (eds) Methods in enzymology, vol.105. Academic, New York,
pp.673-684, 1984;
3. AISE/CESIO, Environmental Risk Assessment of Detergent Chemicals, Proceedings of the AISE/CESIO
Limelette III Workshop, 2829 November 1995, Brussels (1996);
4. Berger H., Environmentally compatible surfactants for the cosmetic industry, presented at the SCS
Symposium Bristol 78 April 1997 International Journal of Cosmetic Science 19, 227237 (1997);
5. Beutler E, Glutathione peroxidase. In: Beutler E (ed) Red cell metabolism: a manual of biochemical
methods. Grune & Syratton, New York, pp.74-76, 1984;
6. CESIO, Environmental Risk Assessment of Detergent Chemicals, Proceedings of the AISE/CESIO
Limelette III Workshop, 2829 November 1995, Brussels (1996);
7. Comber S.D.W., Painter H. and Reynolds P., Cationic & Amphoteric Surfactant Primary Biodegradability
Ring Test, European Union, ETD/98/502063, WRc Ref: CO 4909, (2000);
8. Detergent ProductsEnvironmental Project, Environmental and Health Assessment of Substances in
Household Detergents and Cosmetic, 615, 2001;
9. Domsch Andreas and Klaus Jenni., Biodegradability of amphoteric surfactants, in D.R. Karsa and M.R.
Porter (eds.), Biodegradability of surfactants. Blackie Academic & Professional, Glasgow, United Kingdom,
231-254 (1995);
10. Draper HH, Hadley M, Malondialdehyde determination as index of lipid peroxidation. In: Packer L, Glazer
AN (eds) Methods in enzymology, vol.186. Academic, San Diego, pp. 421 -431, 1990;
11. ECETOC, Technical Report No. 89, (Q)SARs: Evaluation of the commercially available software for
human health and environmental endpoints with repect to chemical management applications.ISSN-0773-
8072-89 Brussels (2003);
12. Ecological Risk Assessment Guidance for Superfund: Process for Designing and Conducting Ecological
Risk Assessment EPA 540-R-97-006, JUNE 1997;
13. EPA (US Environmental Protection Agency), Alkyl dimethyl benzyl ammonium chloride (ADBAC),
Preliminary risk assessment, Office of Pesticide Programs, April 2006;
14. GHS (Globally Harmonized System for Classification and Labelling of Chemicals), revizia 4,
www.unece.org, United Nations, New York and Geneva, 2011;
15. Goldberg DM, Spooner RJ, Glutathione reductase. In: Bergmayer HU (ed) Methods of enzymatic analysis,
3
rd
edn. Verlag Chemie, Dearfield Beach, pp.258-265, 1983.
16. H.G. nr. 658/27.06.2007 privind stabilirea unor masuri pentru asigurarea aplicarii Regulamentului (CE)
nr.648/2004 al Parlamentului European si Consiliului Uniunii Europene privind detergentii;
17. Habig WH, Pabst MJ, Jakoby W, Glutathione S transpherase, The first enzymatic step in mercapturic acid
formation. J. Biol. Chem 249: 7130-7139, 1974;
18. HERA, Esterquats Environmental Risk Assessement Report Editia 1 (2008);
19. Irina Lucaciu, Iuliana Ciurcanu, Elena Voinea, INCD ECOIND Bucharest, Romania, Techniques and
methods of controlling and evaluating the characteristics of biodegradation of anionic and non-ionic
surfactants, poster, 1
st
International Conference on Environmental Research and Assessment ICERA
2003, Bucharest, March 23 27, 2003;
20. IUCLID Dataset pentru CAS 6178-40-0 (Cocoamido propel betaine) (2000);
21. IUCLID Dataset pentru CAS 911995-81-2 (Fatty acids, C10-20 and C16-18 unsatd., reaction products
with triethanolamine, di-Me sulfate-quaternized) (2000);
22. Iuliana Ciurcanu, Irina Lucaciu, Elena Mihaila,INCD ECOIND Bucharest, Romania, Experimental
research to elaborate and verify a spectrophotometer method for the determination of cationic surfactants
concentration in aqueous solution, Environment and Industry Symposium, organized by INCD-ECOIND
Bucharest, October 29 31, 2003, symposium volume -pag.102;
23. Jocelyn P. C., Spectrophotometric assay of thiols Methods Enzymol.143, 44-67 (1987);
40
24. Kazuaki Miura, Naohiro Nishiyama and Akiko Yamamoto, Aquatic environmental monitoring of
detergent surfactants, Jurnal of Oleo Science 57, (3) 161-170 (2008);
25. Kees van Leeuwen, Carla Roghair, Ton de Nijs and Jodi de Greef, Ecotoxicological risk evaluation of
the cationic fabric softener DTDMAC. III. Risk assessment, Chemosphere, vol. 24, issue 5, 629-639 (1992);
26. Levine R.L., Garland D., Oliver C.N. et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified
proteins. Methods in Enzimology, 186:464-478 (1990);
27. Lohr, G. W., and H. D. Waller. Glucose-6-phosphate dehydrogenase, p. 636-643. In H.-U. Bergmeyer (ed.),
Methods of enzymatic analysis, vol. 2. Academic Press, Ltd., London, 1974.
28. Longman G.F., The analysis of Detergents and Detergents Products, Wiley, N.Y. (1975);
29. Luminita Bratucu, Iuliana Ciurcanu, Irina Lucaciu, Elena Mihaila, Laboratory assimilation and
implementation of analytical methods used for cationic and amphoteric surfactants concentrations
assessment from aqueous solutions, The XXIX National Conference of Chemistry, Oltchim, Oct. 04-06,
2006, Calimanesti-Caciulata, Valcea;
30. Masayuki Yamane, Takamasa Toyo, et al, Aquatic toxicity and biodegradability of advanced cationic
surfactant APA 22 compatible with the aquatic environment, Jurnal of Oleo Science 57, (10) 529-538
(2008);
31. NICNAS (National Industrial Chemicals Notification and Assessment Scheme), Full public report, Stepantex
Esterquat, 28 ianuarie 2003;
32. OECD Guidance Document for Aquatic Effects Assessment;
33. OECD Guidelines for the thesting of chemicals, 2006;
34. Paoletti F., Aldinucci D., Mocali A., Caparrini A., A sensitive spectrophotometric method for the
determination of superoxide dismutase activity in tissue extracts. Analyt Biochem, 154: 538541, 1986;
35. Persoone Guido, Marsalek Blahoslav, Blinova Irina, Trkne Andrea, Zarina Dzidra, Manusadzianas
LevonasNalecz-Jawecki Grzegorz, Tofan Lucica, Stepanova Nadejda, Tothova Livia, Kolar Boris, A
practical and user-friendly toxicity classification system with microbiotests for natural waters and
wastewaters, Environmental Toxicology, Volume 18, issue 6, pp. 395 - 402(2003);
36. Radru Avram, Ioan Calinescu, Surfactants. Syntheses, Industrial Chemical Faculty, Bucharest 2004;
37. Regulamentul (CE) NR. 1907/2006 al Paramentului European i al Consiliului din 18 decembrie 2006
privind nregistrarea, evaluarea, autorizarea i restricionarea substanelor chimice (REACH);
38. Regulamentul Comisiei Europene (CE) nr. 907/20.06.2006 primul Amendament al Regulamentului nr.
648/2004;
39. Regulation (EC) no. 2004/648 of European Parliament and European Council, Official Journal of European
Union, L104/1, April 2004;
40. Romo M., Bennani N., Gnassia-Barelli M., Lafaurie M. and Girard J. P., Cadmium and copper dispaly
different responses towards oxidative stress in the kidney of the sea bass Dicentrarchus labrax. Aquatic
Toxicology. 48, 185-194(2000);
41. Technical Guidance Document on Risk Assessment, European Chemicals Institute for Health and
Consumer Protection Bureau, Part II, 2003;
42. Tehnical Guidance Document on Risk Assessemnt, TDG Part IV, Comisia Europeana ER20418EN, 2003;
43. Tomislav Ivankovic and Jasna Hrenovic, Surfactants in the Environment, Arh. Hig. Rada Toksicol: 61:
95-110 (2010);
44. Ute Merrettig-Bruns and Erich Jelen, Anaerobic Biodegradation of Detergent Surfactants,Materials, 2,
181-206 (2009);
45. Ying Guang-Guo, Fate, behaviour and effects of surfactants and their degradation products in the
environment, Environ. Int.32(3):417-31(2006);