Rezumat Teza - Negru Jean - Romana

Universitatea de Medicin i Farmacie
Gr.T.Popa Iai
Facultatea de Farmacie
Disciplina de Chimie analitic

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Contribuii la identificarea unor substane
medicamentoase prin separare cromatografic i
confirmare spectral, folosind o librrie de
spectre pentru o anumit faz mobil

CONDUCTOR TIINIFIC,
Prof. univ. dr. Vasile DORNEANU

DOCTORAND,
Ing. chim. Jean NEGRU

IAI
2011

Universitatea de Medicin i Farmacie
Gr.T.Popa Iai
Facultatea de Farmacie
Disciplina de Chimie analitic

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Contribuii la identificarea unor substane
medicamentoase prin separare cromatografic i
confirmare spectral, folosind o librrie de
spectre pentru o anumit faz mobil

CONDUCTOR TIINIFIC,
Prof. univ. dr. Vasile DORNEANU

DOCTORAND,
Ing. chim. Jean NEGRU

IAI
2011

i
CUPRINS TEZ
CUPRINS 2

INTRODUCERE 8
Scopul i obiectivele tezei de doctorat 9

CAPITOLUL 1. GENERALITI. STRUCTUR CHIMIC. PROPRIETI
CHIMICE I FARMACOLOGICE. 10
1.1. Generaliti 10
1.2. Mecanismele inflamaiei 10
1.3. Tratamentul inflamaiei 11
1.4. Clasificarea AINS 12
1.4.1. Reprezentani 12
1.5. Relaia structur activitate biologic 14
1.6. Aspecte farmacologice generale 15
1.6.1. Farmacocinetic 15
1.6.2. Farmacodinamie 16
1.6.3. Farmacotoxicologie 16
1.6.4. Farmacoterapie 17
1.7. Reprezentani 17
1.7.1. Nimesulid 17
1.7.1.1. Nomenclatur i structur 17
1.7.1.2. Proprieti fizico chimice 18
1.7.2. Meloxicam 19
1.7.3. Piroxicam 19
1.7.3.2. Proprieti fizico - chimice 19
1.7.4. Tenoxicam 20
1.7.5. Ibuprofen 21
1.7.6. Indometacin 22
1.7.7. Diclofenac sodic 22
1.7.8. Ketoprofen 23

ii
1.7.9. Ketorolac 23
1.7.10. Fenilbutazon 23

CAPITOLUL 2. ABSORBIA LUMINII DE CTRE COMPUII ORGANICI25
2.1. Originea spectrului UV-VIS 25
2.2. Principiile spectrometriei de absorbie 27
2.2.1. Legea Lambert - Beer 27
2.2.2. Deviaii de la legea absorbiei 28
2.2.3. Sumarea absorbanelor 28
2.2.4. Spectre derivate 29
2.2.5. Acurateea fotometric 31
2.2.6. Absorbia selectiv a luminii 33
2.2.7. Modificri induse de substitueni n spectrele UV ale substanelor
organice 34
2.2.8. Efectul conjugrii asupra spectrelor UV-VIS ale substanelor
organice 34
2.2.9. Deplasri spectrale cauzate de solvent 35
2.3. Aplicaii ale spectrelor UV-VIS n analiza calitativ 37
2.3.1. Confirmarea identitii 37
2.3.2. Detecia n UVVIS cuplat cu HPLC 38
2.3.2.1. Determinarea lungimii de und optime de detecie 39
2.3.2.2. Biblioteci de spectre 42
2.3.3. Identificarea compuilor separai prin tehnica HPLC 42
2.3.3.1. Identificarea prin cutarea n biblioteca de spectre 42
2.3.3.2. Analiza compusului int utiliznd un tabel de calibrare 43
2.3.3.3. Analiza compuilor int utiliznd o bibliotec spectral 43
2.3.4. Puritatea picului cromatografic 44
2.3.4.1. Tehnici de determinare a puritii picului 45
2.3.4.2. Curba factorului de prag 46
2.3.4.3. Clasificarea unui pic din cromatogram ca fiind pur sau
impur 47

CAPITOLUL 3. ANALIZA AINS PRIN CROMATOGRAFIA DE LICHIDE
DE NALT PERFORMAN (HPLC) 49
3.1. Generaliti n cromatografia de lichide 49
3.2. Coloanele cromatografice pentru RP-LC 50
3.3. Aplicaii ale metodelor HPLC n analiza medicamentelor 51
3.4. Studiu bibliografic 51

iii
CAPITOLUL 4. EVALUAREA REZULTATELOR VALIDAREA
METODELOR DE ANALIZ 57
4.1. Generaliti 57
4.2. Specificitatea / Selectivitatea 58
4.3. Stabilirea lungimii de und de detecie 58
4.4. Identificarea picului corespunztor analitului 58
4.5. Verificarea puritii picului 60
4.6. Liniaritatea 61
4.6.1. Liniaritatea funciei de rspuns 61
4.6.2. Calibrarea rspunsului detectorului 62
4.6.3. Liniaritatea rezultatelor 63
4.7. Limita de detecie i limita de cuantificare 63
4.7.1. Limita de detecie 63
4.7.2. Limita de cuantificare 64
4.8. Intervalul (domeniul) de lucru 65
4.9. Precizia i exactitatea 65
4.9.1. Precizia 65
4.9.1.1. Repetabilitatea 67
4.9.1.2. Precizia intermediar 67
4.9.1.3. Reproductibilitatea 68
4.9.2. Acurateea (Exactitatea) 68
4.10. Robusteea i stabilitatea metodei 69

CAPITOLUL 5. ALEGEREA PARAMETRILOR METODEI DE SEPARARE
A AMESTECULUI DE AINS 70
5.1. Studiu bibliografic 70
5.1.1. Metode HPLC pentru analiza Meloxicamului (MEL) 70
5.1.2. Metode HPLC pentru analiza Nimesulidului (NIM) 71
5.1.3. Metode HPLC pentru analiza Diclofenacului sodic (DIC) 72
5.1.4. Metode HPLC pentru analiza Ibuprofenului (IBP) 73
5.1.5. Metode HPLC pentru analiza Ketorolacului (KET) 74
5.2. Material i metod 74
5.3. Studiul caracteristicilor fizico-chimice 75
5.4. Optimizarea lungimilor de und pentru detecia AINS 76
5.5. Selecia lungimii de und adecvate deteciei n UV-VIS 81
5.6. Construcia bibliotecii de spectre individuale 85
5.7. Influena debitului fazei mobile asupra separrii AINS 88
5.8. Influena compoziiei fazei mobile 90
5.9. Influena pH-lui fazei mobile apoase asupra separrii 92
5.10. Condiii finale de separare a amestecului de AINS prin HPLC 93
5.11. Alegerea lungimilor de und pentru detecia AINS n UV-VIS 94
5.12. Condiii finale de determinare a AINS prin HPLC 102

iv
CAPITOLUL 6. VALIDAREA ANALITIC A METODELOR
CANTITATIVE PENTRU DETERMINAREA AINS 103
6.1. Caracteristici comune 103
6.2. Validarea metodei HPLC pentru determinarea MEL 103
6.2.1. Stabilirea lungimii de und de detecie 104
6.2.2. Identificarea picului corespunztor MEL 104
6.2.3. Linearitatea 106
6.2.4. Date statistice 108
6.2.5. LOD i LOQ 110
6.2.6. Precizia 110
6.2.6.3. Exactitatea (acurateea) 114
6.2.7. Concluzii referitoare la determinarea MEL prin HPLC 115
6.3. Validarea metodei HPLC pentru determinarea PIR 115
6.3.2. Identificarea picului corespunztor PIR 116
6.3.5. LOD i LOQ 121
6.3.6. Precizia 122
6.3.7. Concluzii referitoare la determinarea MEL prin HPLC 126
6.4. Validarea metodei HPLC pentru determinarea TEN 127
6.4.2. Identificarea picului corespunztor TEN 128
6.4.5. LOD i LOQ 133
6.4.6. Precizia 133
6.4.7. Concluzii referitoare la determinarea TEN prin HPLC 138
6.5. Validarea metodei HPLC pentru determinarea NIM 139
6.5.2. Identificarea picului corespunztor NIM 139
6.5.5. LOD i LOQ 145
6.5.6. Precizia 145

v
6.5.7. Concluzii referitoare la determinarea NIM prin HPLC 150
6.6. Validarea metodei HPLC pentru determinarea IBP 151
6.6.2. Identificarea picului corespunztor IBP 151
6.6.5. LOD i LOQ 157
6.6.6. Precizia 157
6.6.7. Concluzii referitoare la determinarea IBP prin HPLC 162
6.7. Validarea metodei HPLC pentru determinarea IND 162
6.7.2. Identificarea picului corespunztor IND 163
6.7.5. LOD i LOQ 168
6.7.6. Precizia 169
6.7.7. Concluzii referitoare la determinarea IND prin HPLC 173
6.8. Validarea metodei HPLC pentru determinarea DIC 174
6.8.2. Identificarea picului corespunztor DIC 174
6.8.5. LOD i LOQ 180
6.8.6. Precizia 180
6.8.7. Concluzii referitoare la determinarea DIC prin HPLC 185
6.9. Validarea metodei HPLC pentru determinarea KTP 186
6.9.2. Identificarea picului corespunztor KTP 186
6.9.5. LOD i LOQ 192
6.9.6. Precizia 192
6.9.7. Concluzii referitoare la determinarea KTP prin HPLC 197
6.10. Validarea metodei HPLC pentru determinarea KET 198

vi
6.10.2. Identificarea picului corespunztor KET 198
6.10.5. LOD i LOQ 204
6.10.6. Precizia 204
6.10.7. Concluzii referitoare la determinarea KET prin HPLC 208
6.11. Validarea metodei HPLC pentru determinarea FB 210
6.11.2. Identificarea picului corespunztor FB 210
6.11.5. LOD i LOQ 215
6.11.6. Precizia 216
6.11.7. Concluzii referitoare la determinarea FB prin HPLC 221

CAPITOLUL 7. DETERMINAREA AINS DIN FORME FARMACEUTICE 222
7.1. Determinarea MEL din comprimate prin HPLC 222
7.1.1. Determinarea uniformitii masei 222
7.1.2. Prepararea soluiei de lucru 222
7.2. Determinarea PIR din comprimate prin HPLC 223
7.3. Determinarea TEN din comprimate prin HPLC 225
7.4. Determinarea NIM din comprimate prin HPLC 226
7.5. Determinarea IBP din capsule prin HPLC 228
7.6. Determinarea IND prin HPLC din capsule 230
7.7. Determinarea DIC din comprimate prin HPLC 232
7.7.1.Determinarea uniformitii masei 232
7.8. Determinarea KTP prin HPLC din capsule 233

vii
7.9. Determinarea KET trometamin din comprimate prin HPLC 235

CAPITOLUL 8. METOD HPLC RAPID PENTRU DOZAREA
KETOPROFENULUI DIN PLASMA UMAN 237
8.1. Introducere i obiective 237
8.2. Material i metod 237
8.2.1. Soluiile etalon 237
8.2.2. Echipamentul 238
8.2.3 Soluii stoc, soluii de lucru, soluii de control 238
8.2.4. Pregtirea probei 238
8.2.5. Validarea metodei 238
8.3. Rezultate i discuii 239
8.3.1. Studiu bibliografic 239
8.3.2. Metoda HPLC de testare 239
8.3.3. Validarea metodei 240
8.4. Concluzii 242

CAPITOLUL 9. BIBLIOGRAFIE 243

CONCLUZII GENERALE 252

ANEXE 255

viii

1
INTRODUCERE
Antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS) reprezint o clas de
medicamente care cuprinde numeroase substane active cu structur
chimic variat, dar care au efecte comune: analgezic, antipiretic,
antiinflamator.
Mecanismul de aciune principal al AINS este reprezentat de
blocarea ciclooxigenazei (COX), cu inhibarea sintezei de mediatori
proinflamatori (leucotriene - LT, tromboxan - TX, prostaglandine -
PG). Formarea mediatorilor proinflamatori pornete de la hidrolizarea
glicerofosfolipidelor membranare, sub aciunea fosfolipazei A2
PLA2 (dar i a PLC), care duce la formarea de acid arahidonic.
Acidul arahidonic este ulterior metabolizat pe 2 ci: cea a
ciclooxigenazei (COX) i cea a lipooxigenazei (LOX). COX
catalizeaz ciclizarea oxidativ a acidului arahidonic, cu formarea
precursori ai prostaglandinelor i tromboxanilor. Aciunea LOX
asupra acidului arahidonic determin formare de hidroperoxizi
(HPETE), din care se vor sintetiza ulterior LT. Toi aceti mediatori
proinflamatori PG, LT, TX sunt grupate sub denumirea de
eicosanoide.
Prin blocarea COX, AINS blocheaz formarea de PG, ceea ce
explic efectul lor antiinflamator, analgezic i antipiretic (inflamaia,
durerea i febra fiind mediate de PG la nivelul esuturilor
inflamatorii, nociceptorilor i respectiv hipotalamusului).
Majoritatea AINS sunt inhibitori neselectivi ai COX, ceea ce
reprezint un dezavantaj deoarece inhibarea COX-1 duce la apariia
de efecte adverse. n ultimele decenii au fost sintetizai i inhibitori
selectivi de COX-2 (coxibi), care prezint mai puine reacii adverse
digestive, dar nu au efecte antiagregante plachetare.
Pentru separarea, identificarea i determinarea cantitativ a
medicamentelor AINS exist numeroase metode de analiz, dar
marea majoritate se refer la determinarea unuia singur sau a unui
numr restrns de componeni.

2
Scopul i obiectivele tezei de doctorat
Scopul acestei lucrri este de a realiza, valida i aplica n
practic o metod unic de determinare cantitativ pentru unele AINS
(meloxicam, piroxicam, tenoxicam, nimesulid, ibuprofen,
indometacin, diclofenac, ketoprofen, ketorolac, fenilbutazon) prin
cromatografie de lichide de nalt performan.

Obiectivele propuse n cadrul acestui studiu sunt:

1) Efectuarea unui studiu a literaturii de specialitate referitoare la
metodele de determinare cantitativ a AINS luate n studiu;

2) Elaborarea metodei de analiz cantitativ prin cromatografie de
lichide de nalt performan pentru determinarea AINS studiate
astfel nct performanele metodei analitice s fie maxime
(selectivitate, sensibilitate, precizie, exactitate etc.), dar n acelai
timp metoda s fie ct mai rapid;

3) Validarea metodelor de analiz a medicamentelor, n
conformitate cu reglementrile naionale i europene; n acest sens
vor fi verificai o serie de parametri precum: liniaritatea,
selectivitatea, precizia, exactitatea, limita de detecie i limita de
cuantificare. Pentru fiecare metod validat va fi realizat un raport de
validare, n care vor fi consemnate toate caracteristicile i
performanele metodei analitice

4) Aplicarea metodelor analitice n controlul medicamentelor.
Adaptarea metodologiei pentru determinarea substanelor
medicamentoase din formele farmaceutice introduse n terapie.

Precizm c numerotarea tabelelor i figurilor este identic cu
cea din tez de doctorat integral, cu excepia tabelelor de date
comparative ale rezultatelor validrii metodei pentru toate AINS-urile
studiate i ale determinrii acestora din forme farmaceutice, care sunt
prezentate doar n rezumatul lucrrii de doctorat (i care prezint
litera R alturi de numrul de ordine)

3
CAPITOLUL 1. GENERALITI.
STRUCTUR CHIMIC. PROPRIETI
CHIMICE I FARMACOLOGICE
Capitolul cuprinde generaliti privind antiinflamatoarele
nesteroidiene (AINS), mecanismele inflamaiei i tratamentul
acesteia, clasificarea AINS, relaia structur activitate biologic,
aspecte farmacologice generale, reprezentani (descriere general
structur i unele proprieti fizico - chimice).

CAPITOLUL 2. ABSORBIA LUMINII DE
CTRE COMPUII ORGANICI
Capitolul 2 prezint aspecte privind originea spectrelor UV
VIS, principiile spectrometriei de absorbie (legea Lambert Beer,
deviaii de la legea absorbiei, sumarea absorbanelor, spectre
derivate, acurateea fotometric, absorbia selectiv a luminii,
modificri induse de substitueni n spectrele UV VIS ale
substanelor organice, efectul conjugrii asupra spectrelor UV VIS
ale substanelor organice, deplasri spectrale cauzate de solvent),
aplicaiile spectrelor UV VIS n analiza calitativ (confirmarea
identitii, detecia n UV VIS cuplat cu HPLC determinarea
lungimii de und optime de detecie biblioteci de spectre;
identificarea compuilor separai prin tehnica HPLC identificarea
prin cutri n biblioteci de spectre, analiza compusului int utiliznd
un tabel de calibrare, analizarea compuilor int utiliznd o
bibliotec spectral, puritatea picului cromatografic tehnici de
determinare a puritii picului, curba factorului de prag, clasificarea
unui pic din cromatogram ca fiind impur).

4
CAPITOLUL 3. ANALIZA AINS PRIN
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE
NALT PERFORMAN (HPLC)
Cromatografia de lichide (LC) sau cromatografia de lichide de
nalt performan (HPLC) este una dintre tehnicile cele mai folosite
n prezent la separarea constituenilor unui amestec de substane.
n teza de doctorat sunt prezentate sumar unele dintre cele mai
importante metode de analiz prin cromatografie de lichide de nalt
performan (HPLC). Se constat faptul c marea majoritate a
metodelor de determinare a AINS prin HPLC folosesc ca faz
staionar coloane de tipul C18 (n diverse variante constructive
lungime, diametru intern, mrimea particulelor). Ca faz mobil se
folosesc amestecuri de solveni formate n principal din MeOH, ACN
sau ambele mpreun ap sau cu soluii apoase a unor sruri (acetat
de sodiu, acetat de amoniu, fosfat monosodic, fosfat monopotasic
etc.) aduse la valori diverse ale pH-ului cu acizi cum sunt acidul
formic, acidul acetic, acidul fosforic. Metodele prezentate lucreaz n
modul izocrat sau n gradient, n funcie de numrul i tipul de
componeni separai. n ceea ce privete sistemele de detecie, marea
majoritate a metodelor folosesc spectrofotometria n UV, la valori ale
lungimii de und corespunztoare maximelor de absorbie, sau la
valori intermediare corespunztor maximelor de absorbie a
componentelor separate. n alte metode se folosete ca sistem de
detecie spectrometria de mas, fluorescena sau detecia
electrochimic.
Metodele prezentate sunt utilizate pentru determinarea AINS
din diverse matrici (forme farmaceutice sau medii biologice). n cazul
determinrilor din medii biologice (urin, ser, plasm, esut) se
folosesc diferite variante de purificare a probei (extracie n faz
solid, extracie n faz lichid folosind ca sisteme de extracie
diveri solveni cum sunt eterul, cloroformul, diclormetanul etc. sau
deproteinizarea simpl cu ACN, MeOH sau acizi acid percloric,
acid tricloracetic etc.).

5
CAPITOLUL 4. EVALUAREA
REZULTATELOR VALIDAREA
METODELOR DE ANALIZ
Validarea metodelor analitice este o problem important n
analiza medicamentelor, ce trebuie rezolvat n conformitate cu
reglementrile organismelor internaionale de reglementare, cum ar fi
Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Agency
(EMEA) i International Conference of Harmonization (ICH).
Procesul de validare confirm c procedura de analiz utilizat este
adecvat pentru scopurile prestabilite i demonstreaz fiabilitatea
rezultatelor obinute. Prin urmare, validarea metodei este esenial n
analiza medicamentelor.
n laboratoarele de analiz, validarea are la baz standarde,
cum ar fi: Bunele practici de producie (Good Manufacturing
Practices - cGMP), Bunele practici de laborator (Good Laboratory
Practices - GLP), Bunele practici clinice (Good Clinical Practices -
GCP) etc. Exist i alte condiii necesare privind calitatea i
acreditarea standardelor prevzute de Organizaia Internaional a
Standardelor (International Standards Organization - ISO) seriile
9000 i 17025, Normele Europene (European Norm - EN 45001),
Agenia de Protecie a Mediului (Environmental Protection Agency
EPA), FDA etc.
Pentru instituirea unei metode de analiz se au n vedere, de
regul, urmtorii parametri:
(a) Specificitatea / Selectivitatea;
(b) Linearitatea;
(c) Limita de detecie (LOD);
(d) Limita de cuantificare (LOQ);
(e) Intervalul (domeniul de lucru);
(f) Precizia (repetabilitatea i precizia intermediar);
(g) Acurateea
(h) Stabilitatea i robusteea.

6
CONTRIBUIE ORIGINAL
CAPITOLUL 5. ALEGEREA
PARAMETRILOR METODEI DE SEPARARE
A AMESTECULUI DE AINS
n literatura de specialitate nu exist o singur metod
cromatografic de separare i determinare cantitativ pentru AINS.
Unele dintre metodele publicate descriu separri de amestecuri de
AINS sau AINS mpreun cu substane medicamentoase din alte
clase terapeutice, ns majoritatea separrilor publicate sunt
optimizate pentru fiecare compus n parte. Aplicaiile descrise se pot
mpri n cteva categorii, i anume: dozarea AINS din materii prime
farmaceutice, dozarea AINS din forme farmaceutice, dozarea AINS
din probe biologice (n special snge, plasm, urin).
n acest capitol, vom prezenta modalitatea de elaborare a
metodei pentru separarea unui amestec de AINS prin HPLC. Ne vom
axa n principal pe variaiile spectrale i ale ariilor picurilor obinute
ce apar n urma modificrii unor parametri de lucru, cum sunt debitul
i compoziia fazei mobile. Un numr de 10 AINS din diverse clase
chimice fac obiectul prezentei cercetri, avnd drept scop crearea
unei metode simple de separare cromatografic din amestec (metoda
de screening), precum i a validrii acestei metode sau a unor
alternative optimizate pentru determinri cantitative individuale ale
acestora. S-a urmrit crearea unei metode capabile s ruleze pe un
sistem cromatografic uzual, avnd un detector economic (de tip UV-
VIS) i implicnd o coloan de separare dintre cele mai rspndite,
cum este coloana cu faz staionar C18.

Cele 10 AINS luate n studiu sunt:
1. Nimesulid abreviat NIM, obinut ca donaie prin amabilitatea
S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. 07000047, produs n 03.2007,
valabil pn n 03.2010.

7
2. Meloxicam abreviat MEL, obinut ca donaie prin amabilitatea
S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. ROMXE/80606, produs n
08.2008, valabil pn n 05.2012.
3. Piroxicam abreviat PIR, obinut ca donaie prin amabilitatea
S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. PRX2009115, produs n
10.2009, valabil pn n 10.2012.
4. Tenoxicam abreviat TEN, obinut ca donaie prin amabilitatea
S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. 920060508, produs n 06.2008,
5. Ibuprofen abreviat IBU, obinut ca donaie prin amabilitatea
S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. IBU0708801, produs n 08.2007,
6. Indometacin abreviat IND, obinut ca donaie prin amabilitatea
S.C. Fiterman Pharma S.A., lot nr. T09-104, produs n 08.2009,
7. Diclofenac Sodiu abreviat DIC, obinut ca donaie prin
amabilitatea S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. 100806-2, produs n
08.2010, valabil pn n 08.2014.
8. Ketoprofen abreviat KTP, obinut ca donaie prin amabilitatea
S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. 149.530, produs n 01.2009,
9. Ketorolac abreviat KET, obinut ca donaie prin amabilitatea
S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. ABDH006236, produs n 11.2010,
10. Fenilbutazon abreviat FB, obinut ca donaie prin
amabilitatea S.C. Fiterman Pharma S.A., lot nr. BTZ 2008351,
produs n 07.2008, valabil pn n 07.2011.

Pentru a putea concepe metoda de separare dorit, se vor
folosi informaiile despre parametrii fizico-chimici disponibile n
literatura de specialitate, precum i experiena proprie acumulat n
cadrul Laboratorului de Cromatografie, Facultatea de Farmacie,
Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai.
Urmrind informaiile relevante pentru separarea
cromatografic, i anume: solubilitatea, caracterul lipofil/hidrofil
(nepolar sau polar), caracterul acid, bazic sau neutru, ale moleculelor
luate n studiu, i bazndu-ne pe datele din literatura de specialitate,
am considerat adecvat s alegem ca modalitate de lucru separarea
cromatografic pe faz staionar invers (coloan C18), folosind

8
drept faz mobil un amestec de MeOH, ACN i ap sau soluie
tampon acetat, cu detecie n UV.
Dup valorile coeficientului de partiie octanol/ap (logP)
citate n literatura de specialitate i determinate experimental pentru
mediu neutru (pH = 7,4) se poate observa cum aceste substane se
grupeaz n jurul a dou valori: 1 (TEN, KTP, KET) i 3,7 (FB,
IBP, IND, DIC). Celelalte trei AINS, respectiv NIM, MEL i PIR au
valori diferite i mprtiate ntre cele dou grupuri. Apropierile
remarcate conduc la predicia c analiii fiecruia din cele dou
grupuri, dac se gsesc mpreun n amestec, vor fi foarte greu de
separat n condiii de eluie izocrat.
Solubilitatea AINS luate n studiu este mai mare n solveni
polari (metanol, etanol) dect n ap. Avnd n vedere faptul c
spectrul de absorbie al unei substane poate suferi diverse modificri
(deplasare batocrom sau hipsocrom, efect hipercromic sau
hipocromic), am considerat necesar ca, n ceea ce privete alegerea
compoziiei finale a fazei mobile, primul pas s l constituie studiul
spectrelor de absorbie a antiinflamatoarelor n diveri solveni.
Pentru aceasta, au fost preparate soluii de concentraie
aproximativ de 0,01mg/mL, n cteva variante de solvent: ap,
MeOH, ACN i soluie apoas tamponat (tampon acetat) de pH = 5.
Concentraia de 0,01mg/mL este astfel aleas nct s permit
dizolvarea tuturor AINS i n ap. Dup prepararea soluiilor de
lucru, s-a trecut la msurarea extinciei n UV-VIS folosind un
Spectrofotometru UV-VIS Agilent Technologies, model 8453,
Germania. Msurtorile spectrale i de absorban (extincie) au fost
efectuate pe domeniul 190 500nm, deoarece unele dintre AINS
luate n lucru absorb radiaie luminoas i n zona spectral VIS.
Pentru exemplificare, prezentm spectrul pentru TEN msurat
n cei 4 solveni (figura 5.6).
Se constat mai multe aspecte. n primul rnd, pentru toi
compuii studiai se obin mai multe maxime de absorbie, cel mai
puternic (maximul principal) la lungimi de und de pn la 210nm.
Acestea sunt succedate de maxime secundare sau teriare la lungimi
de und mai mari. Deoarece n domeniul de lungimi de und 190
210nm, specifice maximelor principale, absorb puternic majoritatea
solvenilor organici utilizai n HPLC (MeOH, ACN etc.), utilitatea
acestora pentru detectarea concentraiilor mici de analii este
ndoielnic. Din acest motiv, se vor avea n vedere maximele de

9
absorbie ce se obin la valori mai mari ale lungimii de und
(maximele secundare) la stabilirea parametrilor de detecie.

Fig. 5.6. Spectrele msurate pentru TEN n diferii solveni

n al doilea rnd, se poate observa c efectele de deplasare ale
maximelor spectrale (i ne referim acum strict la maximul secundar)
nu au efect semnificativ ntre ap i solventul apos tampon (ap +
sare + acid) la pH = 5, ceea ce nseamn c prin corecia de pH nu s-a
alterat maximul secundar de absorbie. Aceast constatare permite s
tratm tamponul apos din punct de vedere al influenei spectrale,
similar cu apa. Totui, o alt influen este notabil: efectul
hipocromic (reducerea intensitii de absorbie) este semnificativ la
anumite AINS (KET, PIR), nesemnificativ la alte AINS (DIC, MEL,
TEN) iar, n cazul IBP, apare efectul invers, de hipercromie
(intensificarea intensitii de absorbie).
Un alt aspect interesant este specific spectrului oxicamilor.
Acetia prezint dou maxime secundare, unul de intensitate mai
mic, n intervalul 240 260nm, i unul de intensitate mai mare, n
domeniul 350 400nm. Dintre AINS-urile studiate, oxicamii sunt
singurii care au aceast particularitate i poate fi util n situaiile n
care anumite AINS au tendina s coelueze (din cauza valorii logP
foarte apropiate). O soluie simpl de decelare este selecia spectral:
presupunnd c KTP sau/i KET vor coelua cu TEN (toate au logP
foarte apropiate de 1), alegerea unei lungimi de und de detecie de
350 360nm va permite detecia i chiar cuantificarea exclusiv a

10
TEN, deoarece KTP i KET nu absorb deloc n aceast zon
spectral.
Nu n ultimul rnd, n cazul folosirii MeOH sau ACN ca
solvent, lungimile de und rmn la aceleai valori (pentru IBP) sau
se deplaseaz spre valori mai mari deplasare batocrom (pentru
DIC) sau mai mici deplasare hipsocrom (pentru KTP, PIR, MEL
i TEN). Aceste deviaii vor fi investigate ulterior, pentru a vedea
influena amestecurilor ap sau tampon apos/solvent organic (MeOH
sau ACN) n diverse proporii, asupra poziiilor maximelor spectrale.
n tabelul 5.3 sunt prezentate sinoptic lungimile de und
(poziiile) ale maximelor spectrale secundare cu utilitate n detecia
cromatografic.

Tabelul 5.3. Lungimile de und corespunztoare maximelor
spectrale secundare pentru DIC, IBP, KTP, PIR, MEL i TEN,
n ap, MeOH, ACN i tampon acetat pH = 5

Solvent
Compus studiat
Ap Metanol Acetonitril Tampon pH 5
DIC 276 282 284 276
IBP 221 219 219 221
KTP 260 254 252 260
PIR 359 326 324 331
MEL 364 357 346 364
TEN 374 358 355 373

Urmrind abaterile maximelor spectrale secundare pentru
AINS studiate la dizolvarea n solveni organici (MeOH i ACN), n
tabelul 5.3, se poate observa c valorile acestora sunt foarte apropiate
(cel mult 3nm diferen), cu excepia MEL (maximul secundar n
MeOH s-a nregistrat la 357nm, fa de cel n ACN nregistrat la
346nm). Pentru a putea anticipa lungimile de und optime pentru
detecia HPLC n domeniul spectral UV-VIS, AINS luate n studiu au
fost testate spectrofotometric dup dizolvarea n amestecuri tampon
apos/MeOH cu procent de modificator organic variabil (0, 30, 50, 70,
100%). n figura 5.12 este reprezentat, pentru exemplificare,
modificrile spectrale suferite de TEN n funcie de compoziia
amestecului de solvatare, ce simuleaz posibile compoziii ale fazei
mobile HPLC.

11

Fig. 5.12. Spectrele msurate pentru TEN n amestec
tampon apos/MeOH

Examinnd spectrele analizate, se poate concluziona faptul c
aceti compui prezint modificri semnificative ale absorbanei n
funcie de raportul n care se afl solvenii (tampon apos/MeOH) i
anume valori mai mari ale absorbanei pentru KTP i PIR la dizolvare
n MeOH 100%, mai mici pentru DIC (50%) i TEN (30%) i,
respectiv, pentru IBP (0%).
Compuii menionai au fost studiai i la dizolvare n soluie
tampon acetat 0,1M (pH = 3,6) observndu-se o uoar cretere a
absorbanei fa de soluii tampon acetat pH = 5. n acest studiu au
fost incluse i celelalte AINS: NIM, IND, KET i FB. Urmrind
evoluia modificrilor spectrale n amestecuri similare fazelor mobile
HPLC, se recomand pentru detecia n UV alegerea urmtoarelor
semnale (canale) de achiziie: 255nm, 275nm, 360nm i, cu totul
special, 220nm pentru IBP.
Pentru urmtoarele teste s-a utilizat un cromatograf de lichide
model HP 1090, echipat cu detector cu ir de diode. Analizele au fost
efectuate pe o coloan de separare cu faz staionar invers model
Zorbax StableBond SB-C18 4,6 x 150mm, 5m la un debit de
0,7mL/min i cu o faz mobil format din ACN/tampon acetat 0,1
M (pH = 3,6)/MeOH n raport 35/40/25. Aceast faz mobil a fost
iniial aleas a avea pH = 3,6 pentru a asigura trecerea DIC (forma
sodic) n forma acid. DIC (forma sodic) are un pK
a
= 4. Ulterior,
pH-ul va fi crescut la 5,6, valoare similar studiilor preliminare.

12
Pentru nregistrarea spectrelor celor 10 AINS n vederea
construirii bibliotecii de spectre care va fi stocat de software-ul
HPLC-ului pe computerul sistemului cromatografic, s-a procedat la
cromatografierea individual a fiecrui AINS. Soluia aleas
(construcia bibliotecii de spectre n condiii dinamice) are drept scop
final apropierea ct mai puternic posibil de forma real a spectrelor
n timpul separrii. Stocarea unor spectre obinute n condiii statice
ar fi putut avea consecine nedorite asupra confirmrii identitii
compuilor separai sau asupra puritii spectrale.
n plus, cromatografierea individual a AINS n condiiile
metodei ce nu se modific permite determinarea timpilor de retenie
corespunztori fiecrui component n parte i stabilirea ordinii de
eluie n timpul separrii. Deasemeni, prin compararea timpilor de
retenie se pot anticipa suprapunerile (coeluiile) nedorite. Aceast
etap a fost finalizat cu ajutorul unei serii de soluii etalon de
concentraii cunoscute: TEN (49g/ml); PIR (49,25g/ml); MEL
(49g/ml); DIC (49g/ml); KET (49g/ml); KTP (53,5g/ml); IBP
(500g/ml); NIM (50g/ml); FB (50,75g/ml); IND (46,75g/ml).
n figura 5.14 sunt prezentate cromatograma i spectrul de
absorbie nregistrate pentru DIC. Conform timpilor de retenie
determinai, se poate stabili ordinea de eluie a acestor AINS n
condiiile metodei utilizate.

Fig. 5.14. Cromatograma i spectrul DIC (49g/mL)

Pentru studiul influenei debitului asupra separrii
cromatografice a amestecului ce conine apte AINS (DIC, PIR, KTP,
NIM, FB, IND i IBP), s-au efectuat analize n aceleai condiii:
min 5 10 15 20 25
mAU
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
DAD1 A, Sig=255,4 Ref =450,80 (AINFLAJ\A_INF_04. D)

1
.
1
2
6

2
.
1
0
5

2
.
5
6
2

5
.
0
6
0

7
.
9
8
1

1
3
.
8
1
4

2
6
.
2
2
2
nm 220 240 260 280 300 320 340 360 380
mAU
0
20
40
60
80
100
120
140
160
DAD1, 2.188 (174 mAU,Bln) of A_INF_04.D

13
coloan cromatografic de tipul Zorbax StableBond SB-C18 (4,6 x
150mm), 5m, cu o faz mobil format din amestec de
ACN/Ap/MeOH (35/40/25, v/v/v) i s-a variat doar debitul fazei
mobile. n urma separrii cromatografice la valori diferite ale
debitului se obin urmtoarele cromatograme (figura 5.22).

Fig. 5.22. Separarea unui amestec de apte AINS la debit de
0,7mL/min i 0,5mL/min

Spectrele de absorbie ale PIR i IND obinute n aceast faz
mobil, la cele dou debite, sunt reprezentate n figura 5.23. Se
observ c, la reducerea debitului, are loc o micorare a abundenei
semnalului (efect hipocromic), vizibil i n reprezentrile spectrale
exemplificate n figura 5.23.
De asemenea, se mai observ faptul c la scderea debitului
fazei mobile nu apar deplasri batocrome sau hipsocrome, ns
fenomenul de aplatizare (scderea nlimii picului cromatografic)
conduce implicit la o scdere a sensibilitii metodei. Principalul
efect negativ se va resimi la calculul parametrilor de performan
LOD i LOQ, dependeni n mod particular de nlimea semnalului
cromatografic. Un alt efect nedorit este lirea la baz a picului
cromatografic ce conduce inevitabil la scderea rezoluiei separrii.
Este, de aceea, necesar continuarea optimizrii metodei de separare
prin alte modificri, nu prin reducerea debitului de faz mobil.

14

Fig. 5.23. Spectrele de absorbie pentru PIR i IND, la dou debite
diferite (n rou - 0,7mL/min, n albastru 0,5mL/min)

n tabelul 5.4 sunt centralizate modificrile pe care le produce
asupra picurilor cromatografice de IND i PIR scderea debitului
fazei mobile de la 0,7mL/min la 0,5mL/min.

Tabelul 5.4. Influena modificrii debitului de faz mobil asupra
picurilor cromatografice ale PIR i IND

Compus Debit (ml/min) Timp de retenie (min) Lime
0,7 4,286 0,2236
PIR
0,5 6,039 0,3054
0,7 12,438 0,4047
IND
0,5 17,298 0,557

n urma interpretrii acestor date, se desprind urmtoarele
concluzii:
(1) alura spectrelor i poziia maximelor de absorbie nu se modific,
n schimb absorbana scade odat cu scderea debitului fazei mobile;
(2) odat cu scderea debitului fazei mobile crete limea picului la
baza cromatogramei.
Pentru a studia influena compoziiei fazei organice din faza
mobil asupra separrii cromatografice a amestecului celor apte
AINS exemplificate (DIC, PIR, KTP, NIM, FB, IND i IBP), s-a ales
ca faz mobil un amestec format din ACN, MeOH i ap. n
analizele efectuate, debitul a fost meninut constant, la o valoare de

15
0,7mL/min, la fel i proporia de ap din compoziia fazei mobile, la
40%. Au fost modificate doar proporiile de MeOH i ACN, astfel
nct coninutul n metanol s creasc n pai de cte 10%, de la 0 la
30%. Cromatogramele obinute sunt reprezentate n figura 5.24.

Fig. 5.24. Influena proporiei ntre cei doi modificatori organici din
faza mobil (ACN/MeOH) asupra separrii AINS exemplificate
(DIC, PIR, KTP, NIM, FB, IND i IBP)

Studiind variaiile spectrale se desprind urmtoarele concluzii:
(-) indiferent de raportul dintre ACN i MeOH, poziia maximului de
absorbie situat n jurul valorii de 320nm este constant;
(-) cu ct coninutul n MeOH crete, poziia maximului de absorbie
situat n intervalul 260 270nm se deplaseaz treptat spre valori mai
mici ale lungimii de und;
(-) indiferent de proporia dintre cei doi solveni organici, n spectrul
de absorbie al IND exist un platou relativ constant n intervalul
240260nm.
O dat cu creterea coninutului de MeOH n faza mobil se
constat:
1. creterea timpilor de retenie, fapt ce poate fi explicat printr-o
solubilitate mai mic a acestor componente n MeOH dect n ACN;

16
2. pentru primii trei compui aria picurilor este relativ constant n
timp ce nlimea picurilor scade iar limea crete;
3. pentru cel de al patrulea compus aria i nlimea picului scade,
n timp ce limea crete.
4. pentru ultimii doi compui separai apare o anomalie, i anume:
aria, nlimea i limea picurilor nu prezint o modificare uniform.
Avnd n vedere faptul c n aceast prob exist un numr de
7 componeni i avnd n vedere observaiile (3) i (4) se poate afirma
faptul c din ultimii patru compui care elueaz, unul sufer o
deplasare mai rapid prin coloan dect ceilali trei, n fiecare situaie
n parte obinndu-se picuri suprapuse, deci impure. n consecin,
metoda n cauz nu poate fi aplicat n situaia n care n proba de
analizat se gsesc toi aceti patru compui.

Pentru studierea influenei pH-ului fazei mobile apoase asupra
separrii cromatografice, n compoziia fazei mobile a fost meninut
constant raportul ntre componenii acesteia, modificndu-se numai
pH-ul fazei apoase. Astfel, s-a nlocuit apa din compoziia fazei
mobile cu o soluie tampon acetat cu o valoare a pH-ului de 4,6. S-a
utilizat soluie de tampon acetat, volatil, ce ar permite utilizarea fazei
mobile i n determinri lichid cromatografice cu detecie prin
spectrometrie de mas.
n exemplul ce urmeaz, compoziia fazei mobile utilizate
este ACN/tampon acetat (pH = 4,6)/MeOH n raport 30/40/30,
debitul fazei mobile fiind de 0,7mL/min. n figura 5.26 sunt
reprezentate cele dou cromatograme (faz mobil cu ap vs. faza
mobil cu tampon de pH = 4,6).
Dac se utilizeaz soluie tampon de pH = 4,6 n loc de ap se
pot concluziona urmtoarele:
(-) timpii de retenie scad, ceea ce nseamn un timp de analiz total
mai mic;
(-) pentru primii trei compui calitatea separrii scade, picurile
obinndu-se suprapuse, din acest motiv un studiu al modificrilor
ariei, nlimii sau limii picurilor nu este util;
(-) pentru compusul 4 apare o scdere semnificativ a ariei, nlimii
i limii picului;
(-) pentru ultimii doi compui separai aria este relativ constant, n
timp ce se observ o cretere a nlimii picurilor compensat de
scderea limii acestora.

17

Fig. 5.26. Separarea cromatografic a unui amestec de apte AINS
(a) faza mobil: ACN/Ap/MeOH, i (b) faza mobil ACN/tampon
acetat (pH = 4,6)/MeOH raport 30/40/30 (v/v/v), debitul fazei
mobile: 0,7mL/min

Conform datelor experimentale prezentate n cadrul acestui
capitol, se pot desprinde unele concluzii, cum ar fi:
A. n compoziia fazei mobile este indicat s se foloseasc un
tampon de pH n loc de ap, obinndu-se o scdere a timpului total
de analiz i simetrie mai bun a unor picuri;
B. n compoziia fazei mobile este indicat s se foloseasc drept
modificator organic un amestec de MeOH i ACN, nu doar un singur
solvent, deoarece astfel crete rezoluia separrii;
C. Debitul fazei mobile trebuie s fie de 0,7 0,8mL/min; la
valori mai mici crete timpul total de analiz, iar la valori mai mari
scade rezoluia, aprnd coeluii.
D. Analizele se vor efectua la mai multe lungimi de und
(corespunztoare maximelor de absorbie); n acest mod se vor obine
sensibiliti maxime pentru fiecare component separat, creterea
rezoluiei i a simetriei picurilor.
Urmtoarele teste s-au realizat pe o coloan Eclipse XDB C18
(150 x 4,6mm, 5m). Faza mobil (debit 0,8mL/min) este constituit
din amestec ACN/MeOH/tampon acetat pH = 5 (30/30/40, v/v/v).
Din cromatogramele nregistrate s-a determinat timpul de
retenie pentru fiecare compus n parte i s-a nregistrat spectrul de
absorbie n UV-VIS. Prin analiza spectral s-a determinat lungimea
de und corespunztoare maximului de absorbie pentru fiecare
component n parte. Spectrul de absorbie nregistrat pentru fiecare

18
component a fost inclus ntr-o bibliotec de spectre, ce va servi la
identificarea acestora din amestecuri sau din probe reale. n 5.36 se
exemplific cromatograma i spectrul pentru FB.

Fig. 5.36. Cromatograma i spectrul de absorbie pentru FB n
condiiile metodei

Analiznd datele experimentale astfel obinute, se aleg
lungimile de und la care se va face detecia (tabelul 5.7).

Tabelul 5.7. Lungimile de und corespunztoare maximelor de
absorbie i lungimile de und alese pentru detecia n HPLC

Nr.crt. Component analizat
max
(nm) detecie (nm)
1 IBP 230 230
2 KTP 259 270
3 FB 268 270
4 IND 270 270
5 DIC 280 280
6 NIM 300 300
7 KET 320 320
8 PIR 360 370
9 MEL 364 360
10 TEN 372 370

n continuare, au fost analizate amestecuri de mai muli
componeni, la lungimi de und corespunztoare, pentru a evidenia
mai bine ordinea de eluie a componenilor separai.
n figura 5.37 au fost nregistrate cromatograme la lungimile
de und de detecie pentru TEN (370nm), MEL (360nm), KTP
(270nm), DIC (280nm), IND (270nm) i IBP (230nm).

19

Fig. 5.37. Ordinea de eluie: TEN (1), MEL (2), KTP (3),
DIC (4), IND (5) i IBP (6).

n vederea obinerii de informaii asupra performanei
separrii, au fost analizate soluii ce conin un amestec al celor 6
componeni la aceeai valoare a concentraiei (10g/mL), obinndu-
se informaii asupra performanei separrii (tabelele 5.8 5.13).

Tabelul 5.8. Performana separrii la 230nm

Compus
Tr
(min)
Arie pic
nlime
pic
Lime
pic
Rezoluie Simetrie Selectivitate
TEN 2,125 15,8 3,1 0,0811 - 0,466 -
MEL 2,587 33,1 4,6 0,1089 2,92 0,585 1,22
KTP 3,345 60,6 6,8 0,1296 3,67 0,58 1,29
DIC 6,027 53,9 3,3 0,1979 8,44 0,591 1,80
IND 7,241 135,5 7,3 0,2574 2,76 0,622 1,20
IBP 9,28 39,9 2 0,2531 3,98 0,558 1,28

20


Compus
Tr
(min)
Arie pic
nlime
pic
Lime
pic
TEN 2,126 52,1 7,8 0,1032 0,586
MEL 2,587 34,3 4,9 0,1077 2,59 0,603 1,22
KTP 3,345 88 10,3 0,1287 3,73 0,614 1,29
DIC 6,026 39,6 2,6 0,1963 8,61 0,59 1,80
IND 7,241 108,5 6 0,27 2,79 0,619 1,20


Compus
Tr
(min)
Arie pic
nlime
pic
Lime
pic
TEN 2,126 50,2 7,3 0,1087 0,577 -
MEL 2,586 30,4 4,2 0,1125 2,55 0,591 1,22
KTP 3,346 50,3 5,8 0,1297 3,71 0,62 1,29
DIC 6,027 50,5 3,3 0,2134 8,62 0,584 1,80
IND 7,24 90,1 4,9 0,2542 2,80 0,619 1,20


Compus
Tr
(min)
Arie
pic
nlime
pic
Lime
pic
TEN 2,126 40,5 6 0,1081 - 0,569 -
MEL 2,588 24,5 3,4 0,1119 2,56 0,617 1,22
KTP 3,347 13,4 1,6 0,118 3,74 0,657 1,29
DIC 6,024 28,1 1,8 0,1945 8,64 0,583 1,80
IND 7,246 39,8 2,1 0,2513 2,82 0,658 1,20


Compus
Tr
(min)
Arie
pic
nlime
pic
Lime
pic
TEN 2,126 58,3 8,6 0,1012 - 0,589 -
MEL 2,587 64,5 9 0,1093 2,56 0,59 1,22
IND 7,242 17,7 0,94 0,2392 12,98 0,617 2,80

21

Compus
Tr
(min)
Arie
pic
nlime
pic
Lime
pic
TEN 2,126 63,9 9,5 0,1107 - 0,571 -
MEL 2,587 63,9 8,9 0,1064 2,55 0,588 1,22
IND 7,22 12,4 0,64 0,2372 14,55 0,454 2,79

Analiznd datele experimentale prezentate n tabelele 5.8
5.13 se constat rezoluia dintre picurile separate este mai mare ca
2,5. Aceasta nseamn c metoda propus conduce la o separare
bun, cel puin n ceea ce privete aceti 6 compui (figura 5.38).

Fig. 5.38. Cromatogramele nregistrate la lungimile de und folosite
la detecie, pentru TEN (1), MEL (2), KTP (3),
DIC (4), IND (5) i IBP (6)

Pentru a obine sensibilitatea maxim pentru fiecare compus
n parte, se impune o comparaie ntre datele experimentale la diverse

22
lungimi de und. Astfel, n tabelul 5.14 se prezint variaia ariilor
picurilor pentru fiecare component n parte la valori diferite ale
lungimii de und.

Tabelul 5.14. Variaiile ariilor picurilor pentru TEN, MEL, KET,
DIC, IND i IBP la valori diferite ale lungimii de und

Lungime de und (nm)
Compus
Tr
(min) 230 270 280 300 360 370
TEN 2,1 15,8 52,1 50,2 40,5 58,3 63,9
MEL 2,5 33,1 34,3 30,4 24,5 64,5 63,9
KTP 3,3 60,6 88,0 50,3 13,4 9,1 3,4
DIC 6,0 53,9 39,6 50,5 28,1 N.A. N.A.
IND 7,2 135,5 108,5 90,1 39,8 17,7 12,4
IBP 9,2 39,9 16,0 N.A. N.A. N.A. N.A.

Analiznd datele experimentale prezentate n tabelul 5.14 se
constat c cele mai mari valori ale ariilor picurilor nregistrate se
regsesc la urmtoarele lungimi de und: TEN (370nm), MEL
(360nm), KET (270nm), DIC (280nm), IND (270nm) i IBP
(230nm). Aceste valori ale lungimii de und vor fi folosite ulterior
pentru validarea metodei i pentru determinrile cantitative din probe.
Un studiu similar a fost efectuat i pentru celelalte AINS luate
n studiu (PIR, KET, NIM, FB) (tabelul 5.15).

Tabelul 5.15. Variaiile ariilor picurilor pentru PIR, KET, NIM i FB
la valori diferite ale lungimii de und

Lungime de und (nm)
Compus
Tr
(min) 230 270 280 300 360 370
PIR 2,4 605,1 546,1 521,2 N.A. 893,2 810
KET 2,3 117,9 140 410 753,7 109,4 43,4
NIM 6,9 267,2 320,3 415,7 N.A. 250,9 190,3
FB 4,2 7770 6350 878,4 11,8 6,1 5,2

Din datele prezentate n tabelul 5.15 se observ c valorile
maxime ale ariilor picurilor se regsesc la urmtoarele lungimi de
und: PIR (360nm), KET (320nm), NIM (300nm) i FB (270nm).
Acestea vor fi folosite ulterior pentru validarea metodei i pentru
determinrile cantitative din probe.

23
Avnd n vedere testele prezentate anterior, condiiile finale
propuse pentru determinarea prin HPLC a celor zece AINS luate n
studiu sunt:
(1) coloan cromatografic Eclipse XDB C18 (150 x 4,6mm, 5m);
(2) faza mobil (debit 0,8mL/min) constituit din amestec
ACN/MeOH/tampon acetat pH = 5 n raport volumic de 30/30/40;
(3) detecia se realizeaz n UV-VIS, concomitent, la urmtoarele
valori ale lungimii de und:
230nm IBP
270nm KTP, IND i FB
280nm DIC
300nm NIM
320nm KET
360nm PIR i MEL
370nm TEN

24
CAPITOLUL 6. VALIDAREA ANALITIC A
METODELOR CANTITATIVE PENTRU
DETERMINAREA AINS
Pentru determinarea AINS am dezvoltat o metod de analiz
prin RP-HPLC utiliznd un cromatograf de lichide model Agilent
Technologies Seria 1100 echipat cu detector spectrofotometric (UV-
VIS) cu ir de diode. Dup stabilirea condiiilor optime de analiz
(faz staionar, caracteristicile fazei mobile, debit, lungime de und
de detecie), s-a procedat la validarea metodei, calculnd urmtorii
parametri: identificarea AINS, linearitatea funciei de rspuns,
linearitatea rezultatelor, LOD, LOQ, precizia (precizia sistemului,
precizia metodei, precizia intermediar) i exactitatea.

Aparatur:
cromatograf de lichide tip Agilent Technologies 1100 prevzut cu
detector cu ir de diode
coloan cromatografic tip Eclipse XDB C18 (150 x 4,6mm, 5m)
balan analitic tip Kern 770
baie de ultrasonare
agitator magnetic
sticlrie de laborator (pipete, baloane cotate etc.).

Reactivi:
ACN de puritate cromatografic (Merck);
MeOH de puritate cromatografic (Merck);
acetat de sodiu anhidru;
acid acetic glacial;
AINS etaloane de referin (a se vedea n Capitolul 5).
ap bidistilat.

Metod
Soluiile standard s-au obinut prin dizolvarea unei cantiti de
25mg AINS (substan de referin) n 25mL MeOH (1mg/mL) i
diluare cu faz mobil, dup dizolvare complet (aproximativ 5min.

25
n baie de ultrasonare). Orice diluie ce survine n cadrul pregtirii
soluiilor standard se realizeaz cu faz mobil.
Temperatura coloanei este meninut constant la 25C.
Faza mobil: amestec de tampon acetat 0,1M (pH =
5)/ACN/MeOH n raport de 40/30/30. Pentru prepararea unui volum
de 1L faz mobil se procedeaz astfel: se amestec 300mL ACN cu
300mL MeOH i cu 400mL soluie tampon acetat 0,1M (pH = 5).
Debitul fazei mobile este de 0,8mL/min.
Volumul de prob / soluie etalon injectat n HPLC este de 20L.
Detecia se realizeaz la lungimea de und specific AINS
cromatografiat.
Deoarece validrile tuturor celor 10 antiinflamatoare luate n
studiu au fost efectuate urmnd aceeai procedur, n rezumatul tezei
prezentm modul de efectuare a validrii metodei pentru unul singur
urmnd ca pentru ceilali s prezentm doar rezultatele obinute, sub
form de tabele de date.

Validarea metodei HPLC pentru determinarea MEL

Sistemul cromatografic a fost pregtit conform descrierii din
subcapitolul 6.1. Reactivii, faza mobil, etaloanele i probele au fost
pregtite conform metodei de lucru exprimate general n subcapitolul
6.1 i particularizate n continuare. Detecia se realizeaz la lungimea
de und 360nm specific MEL.
Dup cum s-a menionat n Capitolul 5, referitor la
identificarea picurilor cromatografice, o anumit substan se
comport identic la analiza prin HPLC dac toate condiiile de lucru
sunt identice. Astfel, pentru identificarea MEL din diferite probe, se
compar timpul de retenie al picului din cromatograma probei cu cel
obinut n cromatograma substanei de referin (valori ce trebuie s
fie apropiate se accept o diferen, adesea, de 5%). Astfel, n
cromatograma soluiei de referin s-a obinut un timp de retenie de
2,544min.; cum se accept o abatere de 5% (0,127min.) valorile
timpului de retenie trebuie s fie n intervalul 2,417 2,671min.
n figura 6.1 se prezint comparativ cromatogramele pentru
soluia de referin i respectiv pentru o prob. Aa cum se observ
pentru soluia prob, timpul de retenie este de 2,564min., valoare ce
se ncadreaz n limita de abatere impus ( 5%).

26

Fig. 6.1. Cromatograma MEL: soluie standard (sus) vs. prob (jos)

Pentru a crete precizia identificrii, n afara comparrii
timpilor de retenie din cromatograma probei i, respectiv, a soluiei
de referin, se compar i spectrul de absorbie al picului din
cromatograma probei cu cel al soluiei de referin (care este salvat n
biblioteca de spectre). Pentru aceasta, este foarte important ca soluia
prob i soluia de referin s fie analizate n aceleai condiii (faz
staionar, compoziia fazei mobile, debit, temperatur, lungime de
und de detecie, lungime de und de referin etc.).
n figura 6.3 se prezint comparativ spectrul de absorbie al
MEL din soluia prob fa de cel din soluia de referin.
Pentru prepararea soluiei stoc de MEL se procedeaz astfel: o
cantitate de 25mg MEL a fost dizolvat n 20mL MeOH pe baie de
ultrasonare i, dup dizolvare complet, soluia a fost diluat la 25mL
cu MeOH. Din soluia astfel preparat s-a mai realizat o diluie de
1/10, obinndu-se n final o soluie de concentraie 100g/mL.
Calcularea concentraiei soluiei finale se face dup formula de calcul
descris prin ecuaia 6.1.

27

Fig. 6.3. Compararea spectrelor de absorbie a MEL
(prob vs. soluie de referin)

( )
( )
( )
( )
mL g
mL
mL
x
mL
mg
/ 100
50
5
25
25
=
(6.1)

Pornind din aceeai soluie stoc, s-au preparat (prin diluare cu
faza mobil) un numr de 3 seturi de soluii de lucru pentru studiul
linearitii pe intervalul de concentraie 0,5 100g/mL. Fiecare
dintre aceste probe a fost analizat n condiiile menionate i, din
cromatogramele obinute, s-a determinat aria picurilor
corespunztoare MEL.
Se reprezint grafic variaia ariei medii n funcie de
concentraie i se determin intervalul de concentraie pentru care
aceast variaie este linear. Se traseaz dreapta de regresie pentru
acest interval i se determin coeficientul de corelaie (r), deviaia
standard a pantei dreptei de regresie (s) i ecuaia dreptei Arie pic =
f(c) (ecuaiile 6.2, 6.3).

Arie pic = a x Concentraia + b (6.2)

Arie pic = 6,3558 x Concentraia 0,8216; r
2
= 0,9996 (6.3)

Aa cum se observ, pe domeniul de concentraie considerat
metoda este liniar (r
2
= 0,9996).

28
Aadar, domeniul de linearitate al metodei este 0,5
100g/mL.
Pe de alt parte, avnd n vedere faptul c exist posibilitatea
ca metoda dezvoltat s fie aplicat i pentru determinarea MEL din
probe biologice (unde concentraia acestuia este mult mai mic), ne-
am propus s ngustm domeniul de lucru. Astfel, am considerat ca
domeniu de lucru intervalul 0,5 30g/mL. Pentru acest interval de
concentraie am validat metoda.
n figura 6.4 este prezentat dreapta de calibrare obinut
pentru MEL, pe domeniul de lucru.

Fig. 6.4. Dreapta de calibrare la determinarea MEL prin HPLC

Calculul statistic al dreptei de regresie (ecuaia 6.2) este redat
sumar n tabelul 6.3.

Tabelul 6.3. Calculul statistic al dreptei de regresie

Calculul statistic al regresiei
Coeficient de corelaie (r) 0,9999
Coeficient de regresie (r
2
) 0,9998
Eroare standard a dreptei de regresie (SE) 1,1860
Intercept 0,6774
Pant 6,2136

Ecuaia dreptei de calibrare este redat mai jos (6.4):
Arie pic = 6,2136 x Concentraia + 0,6774
R
2
= 0,9998
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
140.00
160.00
180.00
200.00
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentraie (ug/mL)
A
r
i
e

p
i
c

29

Arie pic = 6,2136 x Concentraia (g/mL) + 0,6774 (6.4)

sau, ecuaia 6.5:
Concentraia (g/mL) =
Arie 0,6774
6, 2136
(6.5)

Pentru evaluarea linearitii rezultatelor, se reprezint grafic
variaia concentraiei calculate (utiliznd ecuaia dreptei de calibrare)
n funcie de concentraia teoretic.
Dup cum se observ din figura 6.5, ntre concentraia
introdus teoretic i cea calculat folosind ecuaia dreptei de calibrare
exist o corelaie liniar, panta acestei drepte fiind egal cu unitatea
iar interceptul avnd valoarea 0,0002. Coeficientul de regresie al
acestei drepte are valoarea r
2
= 0,9998.

Fig. 6.5. Liniaritatea rezultatelor la determinarea MEL prin HPLC

Avnd n vedere faptul c interceptul are o valoare extrem de
mic, se poate afirma c aceast dreapt trece prin origine. Pe de alt
parte, dreapta ce trece prin origine i are panta egal cu unitatea este
prima bisectoare. Aceasta nseamn c ntre concentraia introdus
(teoretic) i cea calculat utiliznd ecuaia dreptei de calibrare
corelaia este foarte bun.
Concent raie calculat = Concent raie t eoret ic + 0,0002
R
2
= 0,9998
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35
Concent raie t eoret ic
C
o
n
c
e
n
t
r
a
i
e

c
a
l
c
u
l
a
t

30
n ceea ce privete linearitatea metodei de determinare prin
HPLC a MEL, n urma prelucrrii statistice a datelor experimentale,
se obin urmtoarele rezultate:
metoda este liniar n domeniul de concentraie ales (0,5
100g/mL);
domeniul de lucru ales este 0,5 30g/mL;
pe domeniul de lucru ales, ecuaia dreptei de regresie este dat
de relaia 6.4:

Arie pic = 6,2136 x Concentraia + 0,6774

pe acest interval, coeficientul de regresie (r
2
) are valoarea
0,9998 iar eroarea standard a curbei de regresie (SE) are valoarea
1,1860.
LOD reprezint cantitatea minim de MEL ce se poate pune
n eviden. Pentru determinarea LOD exist mai multe variante, n
cazul de fa am folosit metoda de calcul a acesteia utiliznd deviaia
standard i panta dreptei de regresie (LOD = 0,63g/mL).
LOQ reprezint cantitatea minim de MEL ce se poate
cuantifica cu certitudine. Pentru determinarea LOQ exist mai multe
variante, n cazul de fa am folosit metoda de calcul a acesteia
utiliznd deviaia standard i panta dreptei de regresie (LOQ =
1,91g/mL).

Precizia. Repetabilitatea
Repetabilitatea injeciei (Precizia sistemului)
Pentru a examina precizia sistemului, aceeai soluie
coninnd MEL n concentraia de interes (20g/mL) s-a injectat de
10 ori obinndu-se tot attea cromatograme. Din cromatogramele
rezultate s-au extras ariile picurilor, calculndu-se valoarea medie,
deviaia standard i deviaia standard relativ. Rezultatele numerice
ale analizelor repetitive se regsesc n tabelul 6.6.
Concluzie: avnd n vedere valoarea deviaiei standard
relative obinute (RSD = 1,0999%) comparativ cu limita admis de
2%, se poate afirma c la determinarea prin HPLC a MEL, sistemul
este precis.

31
Tabelul 6.6. Repetabilitatea injeciei (Precizia sistemului) pentru o
concentraie de 20g/mL

Nr. determinrii Arie pic
1 123,61
2 127,37
3 125,65
4 127,96
5 125,53
6 127,01
7 126,63
8 125,22
9 127,95
10 127,24
Media 126,42
SD 1,3905
RSD 1,0999%

Repetabilitatea analizei (precizia metodei)
Pentru stabilirea preciziei metodei de determinare a MEL s-a
ales varianta de lucru cu un minim de 9 determinri acoperind
domeniul specific de concentraie (de exemplu 3 determinri la 3
valori ale concentraiei). Soluiile standard de validare sunt preparate
ca mai jos, prin diluii din soluia stoc. Soluia stoc este preparat ca
n subcapitolul 6.2.3. Din soluia stoc se prepar soluiile de lucru
prin diluare cu faz mobil:
Pentru fiecare nivel de concentraie se prepar i se analizeaz
un numr de trei probe, msurndu-se experimental aria picurilor.
Utiliznd ecuaia dreptei de calibrare i valorile ariilor
corespunztoare picurilor MEL, se calculeaz concentraia (n
g/mL) pentru fiecare prob n parte. Se determin concentraia
calculat ca procent din valoarea concentraiei teoretice. Valorile
obinute sunt prelucrate statistic. Astfel, sunt calculate: valoarea
medie, deviaia standard, RSD i intervalul de ncredere pentru
fiecare valoare individual ca i pentru valoarea medie. RSD trebuie
s aib o valoare mai mic de 5%. Valorile experimentale obinute la
studiul preciziei metodei de determinare a MEL prin HPLC sunt
prezentate n tabelul 6.7.

32
Tabelul 6.7. Precizia metodei de determinare a MEL prin HPLC

Nr. det.
Concentraie teoretic
(g/mL)
Arie pic
Concentraie calculat
(g/mL)
%
1 96,32 15,39 102,6
2 93,01 14,86 99,1
3
15
95,44 15,25 101,7
4 125,47 20,08 100,4
5 127,48 20,41 102,0
6
20
123,00 19,69 98,4
7 152,78 24,48 97,9
8 154,83 24,81 99,2
9
25
153,20 24,55 98,2
Media 99,94%
SD 1,7833 Date statistice
RSD 1,7843%

Concluzie: conform datelor experimentale, dup prelucrarea
statistic a acestora se observ c pe un interval de 25% fa de
valoarea de interes, metoda este precis, RSD fiind sub limita impus
de 5%.

Precizia intermediar
Pentru calculul preciziei intermediare la determinarea MEL
prin HPLC, ntregul experiment s-a efectuat a doua zi, utiliznd
reactivi diferii, modul de lucru fiind identic ca i n cazul
determinrii preciziei metodei.
Pentru fiecare nivel de concentraie se prepar i se analizeaz
un numr de trei probe, msurndu-se experimental aria picurilor.
corespunztoare picurilor MEL se calculeaz concentraia (n g/mL)
pentru fiecare prob n parte. Se determin concentraia calculat ca
procent din valoarea concentraiei teoretice. Valorile obinute sunt
prelucrate statistic. Astfel, sunt calculate: valoarea medie, deviaia
standard, RSD i intervalul de ncredere pentru fiecare valoare
individual ca i pentru valoarea medie. RSD trebuie s aib o
valoare mai mic de 5%. Datele primare folosite la calculele detaliate
anterior se regsesc centralizate n tabelul 6.8.

33
Tabelul 6.8. Precizia intermediar la determinarea MEL prin HPLC
- date primare -

Nr.det.
(g /mL)
Arie pic
(g /mL)
%
1 92,36 14,76 98,4
2 91,28 14,58 97,2
3
15
94,50 15,10 100,7
4 127,15 20,35 101,8
5 127,47 20,41 102,0
6
20
126,12 20,19 100,9
7 152,14 24,38 97,5
8 153,10 24,53 98,1
9
25
156,84 25,13 100,5
Media 99,68%
SD 1,8747 Date statistice
RSD 1,8807%

Concluzie: conform datelor experimentale obinute, dup
prelucrarea statistic a acestora se observ c pe un interval de 25%
fa de valoarea de interes, metoda este precis, RSD fiind sub limita
impus de 5%.

Exactitatea (acurateea)
Exactitatea (acurateea) este o caracteristic ce reflect
apropierea rezultatelor analitice de valoarea adevrat. Exactitatea
este deci o msur a deviaiei valorii medii gsit prin analiz, fa de
valoarea adevrat.
Pentru determinarea acurateei metodei de determinare a MEL
se lucreaz prin metoda adaosului: ntr-o soluie ce conine o cantitate
cunoscut de standard, se introduc volume de soluie de MEL astfel
nct s se obin concentraii de 75%, 100% i 125% din
concentraia soluiei ce va fi testat (20g/mL). Procedeul s-a repetat
de trei ori utiliznd soluii etalon preparate separat.
S-a preparat mai nti o soluie stoc de MEL din care, prin
diluie s-au obinut soluiile de lucru. Soluia stoc se prepar ca n
subcapitolul 6.2.3 (ecuaia 6.1). Soluiile preparate pentru studiul
exactitii au fost injectate i analizate prin cromatografie de lichide
de nalt performan n condiiile metodei. Cromatogramele obinute
au fost integrate, determinndu-se astfel aria picurilor.

34
picurilor corespunztoare MEL s-a calculat concentraia (n g/mL)
pentru fiecare prob n parte. S-a determinat regsirea, calculat ca
procent din valoarea concentraiei teoretice, regsirea medie precum
i domeniul n care variaz regsirea (tabelul 6.10).

Tabelul 6.10. Exactitatea metodei de determinare a MEL prin HPLC

Nr.det.
(g/mL)
Arie pic
(g/mL)
Regsire %
1 93,25 14,90 99,3
2 95,75 15,30 102,0
3
15
96,38 15,40 102,7
4 123,56 19,78 98,9
5 122,93 19,68 98,4
6
20
122,37 19,58 97,9
7 159,73 25,60 102,4
8 155,95 24,99 100,0
9
25
154,56 24,77 99,1
Regsire medie 100,08%
Minim 97,90% Date statistice
Maxim 102,70%

Concluzie: regsirea medie n studiul exactitii metodei de
determinare a MEL prin HPLC are valoarea de 100,08% pe intervalul
97,90 102,70%.

n urma validrii metodei de analiz pentru toate cele 10
antiinflamatoare luate n studiu s-au obinut valorile prezentate n
urmtoarele tabele (R1 R6).
Dup cum se observ cu uurin din datele prezentate n
tabelul R1, durata analizei este de aproximativ 10 minute, timp n
care se pot separa toi cei 10 componeni.
Pe de alt parte, deoarece este puin probabil ca toi cei 10
compui s se afle simultan ntr-o prob, aceast metod unic poate
fi aplicat cu succes pentru separarea, identificarea i determinarea
cantitativ a oricrui compus dintre cei 10 studiai.

35
Tabelul R1. Timpi de retenie i lungimi de unde de detecie

AINS
Timp de retenie
(minute)
Lungime de und de detecie
(nm)
TEN 2,09 370
KET 2,27 320
PIR 2,35 360
MEL 2,54 360
KTP 3,21 270
FB 4,07 270
DIC 5,77 280
IND 6,97 270
NIM 7,29 300
IBP 8,94 230

Cercetri preliminare denot faptul c exist i alte
medicamente din aceast clas ce pot fi separate prin aceast metod.
Metoda de analiz este liniar pentru toate cele 10 AINS
studiate, coeficienii de regresie fiind n toate cazurile mai mari de
0,9990 (tabelul R2). Pentru KET, DIC, NIM i IBP, domeniul de
lucru pornete de la o concentraie mai mare dect n celelalte cazuri
deoarece pentru compuii menionai ariile picurilor la concentraii
mai mici de 1g/mL sunt mai mici dect limita de detecie, n unele
cazuri avnd valori comparative cu zgomotul de fond.

Tabelul R2. Liniaritatea metodei

Domeniu (g/mL)
AINS
liniaritate lucru
Coeficient de
regresie (r
2
)
Pant Intercept
TEN 0,5 100 0,5 30 0,9997 6,4225 -1,7089
KET 0,5 100 1 40 0,9995 6,8197 2,4048
PIR 0,5 100 0,5 30 0,9996 8,7939 -2,4259
MEL 0,5 100 0,5 30 0,9998 6,2136 0,6774
KTP 0,5 100 0,5 30 0,9995 8,871 -0,436
FB 0,5 100 0,5 30 0,9998 79,172 -5,551
DIC 1 100 1 40 0,9994 5,0394 -0,3782
IND 0,5 100 0,5 30 0,9993 10,494 0,8599
NIM 1 100 1 40 0,9993 4,0922 1,1131
IBP 1 100 1 40 0,9998 3,7781 0,1342

36
Conform datelor experimentale prezentate n tabelul R3,
rezultatele calculate sunt n bun corelaie cu valorile teoretice, la
reprezentarea grafic a acestei dependene se obin drepte cu pant
unitar sau foarte apropiat de unitate, cu intercept foarte mic i cu
valori ale coeficienilor de regresie foarte buni (mai mari de 0,9990).

Tabelul R3. Liniaritatea rezultatelor

AINS Pant Intercept Coeficient de regresie (r
2
)
TEN 0,9835 0,2166 0,9998
KET 1,0000 0,0002 0,9995
PIR 1,0000 0,00004 0,9996
MEL 1,0000 0,0002 0,9998
KTP 0,9683 0,102 0,9991
FB 1,0001 -0,0007 0,9998
DIC 1,0000 -0,0003 0,9994
IND 1,0000 -0,000005 0,9993
NIM 1,0000 -0,000005 0,9993
IBP 1,0000 -0,0002 0,9998

Analiznd datele prezentate n tabelul R4 se concluzioneaz
ca n toate cazurile se obin valori bune pentru limita de detecie (0,31
1,48g/mL) i limita de cuantificare (1,57 4,50g/mL).

Tabelul R4. Limita de detecie i limita de cuantificare

AINS
Limita de detecie
(g/mL)
Limita de cuantificare
(g/mL)
TEN 0,63 1,91
KET 1,19 3,61
PIR 0,63 2,47
MEL 0,63 1,91
KTP 0,89 2,71
FB 0,52 1,57
DIC 0,31 3,98
IND 1,10 3,33
NIM 1,48 4,50
IBP 0,75 2,26

Metoda de separare i determinare cantitativ a celor 10
antiinflamatoare prezint o bun precizie, valorile experimentale

37
obinute pentru precizia sistemului ncadrndu-se n intervalul RSD =
0,5400 1,0999%, pentru precizia metodei n intervalul RSD =
1,2329 2,9573% i pentru precizia intermediar n intervalul RSD =
1,1444 2,3410% (tabelul R5).

Tabelul R5. Precizia sistemului, metodei i precizia intermediar

Precizie (%)
Sistem Metod Intermediar
AINS
RSD RSD
Interval
ncredere
RSD
Interval
ncredere
TEN 1,2867 2,9573 96,54 101,32 2,3410 97,18 100,97
KET 0,5400 1,2329 99,03 100,93 1,1981 99,33 101,18
PIR 0,9328 1,4965 98,91 101,22 1,4337 98,76 100,97
MEL 1,0999 1,7843 98,49 101,40 1,8807 98,15 101,21
KTP 0,5668 2,0637 97,71 100,87 1,9085 98,06 101,0
FB 0,8287 1,1765 99,39 101,21 1,1444 98,77 100,52
DIC 0,8282 1,5080 98,49 100,80 1,5047 98,81 101,12
IND 0,6732 1,3233 98,37 100,39 1,3651 98,79 100,89
NIM 0,9876 1,3872 97,22 99,36 1,3148 98,25 100,27
IBP 0,8967 1,8375 97,83 100,64 1,7300 99,67 103,36

Metoda de separare i determinare cantitativ a celor 10
antiinflamatoare este exact, datele experimentale artnd o regsire
medie n intervalul 98,31 100,43% cu minime n intervalul 96,3
98,5% i maxime n intervalul 101,1 103,0% (tabelul R6).

Tabelul R6. Exactitatea metodei

Regsire (%)
AINS
Medie Minim Maxim
TEN 100,43 97,9 103,0
KET 98,89 98,2 101,8
PIR 100,41 97,7 101,7
MEL 100,08 97,9 102,7
KTP 100,52 98,1 101,9
FB 100,20 98,5 101,4
DIC 99,52 98,0 101,8
IND 99,80 98,3 101,5
NIM 98,31 96,3 101,1
IBP 99,61 97,4 101,4

38
CAPITOLUL 7. DETERMINAREA AINS DIN
FORME FARMACEUTICE
Avnd n vedere faptul c pentru determinarea compuilor
studiai din forme farmaceutice (comprimate sau capsule) se aplic
acelai tipic, n rezumatul tezei se prezint modalitatea de
determinare a coninutului n meloxicam / comprimat, iar pentru alte
9 antiinflamatoare (PIR, TEN, NIM, DIC, IND, IBP, KTP i KET) se
prezint doar rezultatele obinute.

Determinarea MEL din comprimate prin HPLC

Prepararea soluiei de lucru
Dup determinarea masei medii, un numr de 20 comprimate
au fost triturate. Din pulberea obinut s-a luat n lucru o cantitate de
aproximativ 0,7g (a grame corespunztor la 4 comprimate),
echivalent la 60mg MEL.
Pulberea de comprimate s-a dizolvat ntr-un volum de 90mL
MeOH timp de 30min pe baie de ultrasonare, amestecul fiind filtrat
prin hrtie cantitativ. Hrtia de filtru se spal cu aproximativ 5mL
MeOH. Soluia filtrat este adus cu MeOH la un volum de 100mL.
Din soluia astfel obinut, un volum de 2,5mL se aduc cantitativ la
50mL cu faz mobil. n continuare, se mai efectueaz o diluie de
2/3 cu faz mobil. Se obine astfel o soluie coninnd MEL n
concentraie de aproximativ 20g/mL (relaia 7.1):

( )
( )
( )
( )
( )
( )
60 2, 5 6
20 /
100 50 9
mg mL mL
x x g mL
mL mL mL
=
(7.1)

Din soluia astfel obinut, un volum de 20L se injecteaz n
condiiile descrise.
Au fost preparate un numr de trei soluii de prob, fiecare din
acestea fiind analizate prin HPLC. Utiliznd ecuaia dreptei de
regresie (6.4):

39
Arie pic = 6,2136 x Concentraia (g/mL) + 0,6774

s-a calculat concentraia MEL pe soluiile prob analizate
cromatografic (Cp n g/mL) (relaia 7.2).

p
Arie 0,6774
C
6, 2136
= (g/mL) (7.2)

innd cont de toate diluiile efectuate n cadrul pregtirii
probei pentru analiz, concentraia n MEL / comprimat va fi
(conform relaiei 7.3):

0, 6774 9 50 1
100
6, 2136 6 2, 5 1000
Arie M
C
a
= (mg/cp) (7.3)

unde: C mg MEL / comprimat;
A aria picului msurat;
M masa medie a comprimatelor;
a cantitatea de pulbere de comprimate luat n lucru.

Rezultatele obinute sunt reprezentate n tabelul 7.2.

Tabelul 7.2. Date experimentale obinute la analiza MEL din
comprimate de 15mg

Nr.
det.
Masa medie
cp (g)
a(g)
pulbere
Arie
pic
mg MEL/cp determinat
(masa medie)
Regsire
(%)
Acceptat
(%)
1 137,9 15,05 100,32
2 134,7 14,7 97,98
3
0,1807 0,7956
137,6 15,01 100,10

Medie 14,92 99,47 7,5%

Concluzie: din datele experimentale prezentate n tabelul 7.2
se constat c valoarea medie a coninutului n MEL / comprimat
(14,92mg/cp) se ncadreaz n limitele impuse de FR X (15mg 7,5
%, adic ntre 13,875 16,125mg).
Rezultatele obinute n cazul determinrii celorlalte AINS din
forme farmaceutice se prezint n tabelul R7.

40
Tabelul R7. Rezultate experimentale obinute la determinarea unor
antiinflamatoare nesteroidiene din forme farmaceutice prin HPLC

Cantitate (mg)
AINS
Denumire comercial /
Productor
Form
declarat determinat
TEN
Tenoxicam Neo-endusix,
Anfarm Hellas S.A.,
Pharmaceutical Industry
comprimat
filmat
20 20,70
KET
Ketorol, Dr. Reddys
Laboratoires
comprimat
filmat
10 9,83
PIR
Piroxicam LPH
LaborMed PHARMA
comprimat 20 20,76
MEL
Meloxicam LPH
LaborMed PHARMA
comprimat 15 14,92
KTP Ketoprofen SR, Terapia capsul 200 196,71
DIC Diclofenac, Terapia comprimat 50 49,17
IND
Indometacin, Arena
Group SA
capsul 50 49,42
NIM
Nimesulid LPH
LaborMed PHARMA
comprimat
filmat
100 102,50
IBP Paduden, Terapia capsul 200 198,72

Conform datelor experimentale obinute, toate formele
farmaceutice analizate se ncadreaz n limitele de abateri prevzute
de FR X, att n ceea ce privete uniformitatea masei ct i n ceea ce
privete coninutul de substan activ.

41
CAPITOLUL 8. METOD HPLC RAPID
PENTRU DOZAREA KETOPROFENULUI
DIN PLASMA UMAN
Scopul acestui studiu a fost de a dezvolta i valida o metod
HPLC nou, simpl i eficient pentru cuantificarea KTP n plasma
uman, pentru monitorizarea la nivel clinic.

Material i metod
Soluiile etalon
Substana etalon de referin de KTP a fost furnizat gratuit de
S.C. Terapia Ranbaxy SA (Cluj-Napoca, Romnia). Solvenii utilizai
(ACN grad HPLC, acid trifluoroacetic i MeOH grad analitic) au
fost produi de Merck KGaA (Darmstadt, Germania). Apa bidistilat,
deionizat pentru injecii au fost produse de Unitatea (laboratorul) de
perfuzii al Universitii de Medicin i Farmacie Cluj-Napoca
(Romnia). Plasm uman martor a fost furnizat de Centrul de
Transfuzie a Sngelui (Cluj-Napoca, Romnia), de la voluntari
sntoi, brbai i femei.
Echipamentele utilizate au fost urmtoarele: balane standard
de precizie analitic (Mettler-Toledo, Elveia), vortex (Scientific
Industries, New York, SUA), baie de ultrasonare Elma Transsonic
700 / H (Singen, Germania), sistem Sistemul HPLC serie 1100
Agilent Technologies (Darmstadt, Germania). Separarea
cromatografic a fost efectuat pe o coloan Zorbax
SB-C18 (100 x
4.6 mm id, faza staionar cu particule de 3,5m), n condiii izocrate,
folosind o faz mobil de 55:45 (v/v) amestec de ACN i 1% (v/v)
acid trifluoroacetic n ap la 45C, la un debit de 1,5mL/min.
Detecia KTP a fost efectuat la 257nm, utiliznd un detector UV.
Soluia stoc de KTP (1,27mg/mL) a fost preparat prin
dizolvarea unei cantiti corespunztoare de KTP n MeOH. Soluia
de lucru (15,32g/mL) a fost pregtit printr-o diluie
corespunztoare n plasma uman fr medicamente. Aceast soluie
a fost folosit pentru a pregti standardele de calibrare n plasm, cu
concentraii de 0,153; 0,306; 0,613; 1,226; 1,532; 2,299; 4,597; 7,662
i, respectiv, 19,155g/mL. Probele de control, cu concentraii de

42
0,460g/mL (mic), 1,839g/mL (medie) i 6,130g/mL (mare), au
fost preparate prin adugarea volumelor corespunztoare de soluie
de lucru la plasma uman fr medicamente. Etaloanele de calibrare
n plasm i soluiile de control rezultate au fost pipetate n tuburi din
polipropilen de 15mL i stocate -20C pn n momentul analizei.
Soluiile pentru validarea diluiilor (VAL-DILconc
38,310g/mL) au fost proaspt preparate n ziua analizei, prin
adugarea de 150L de soluie stoc la 4850L plasm martor.

Etaloanele i probele de plasm (0,2mL) au fost
deproteinizate cu MeOH (0,6mL). Dup amestecare n vortex (10s) i
centrifugare (6min la 6000rpm), supernatantul (0,15mL) a fost
transferat n flacoane de autoinjector i, din acestea, alicote de 20L
au fost apoi injectate n sistemul HPLC.

Specificitatea metodei a fost evaluat prin compararea
cromatogramelor obinute din probele de plasm cu coninut de KTP
fa de cele obinute din diferitele probele de plasm martor (n = 6).
Concentraia de KTP a fost determinat n mod automat de sistemul
de date al instrumentului HPLC utiliznd ariile picurilor i metoda de
calibrare cu standard extern. Curba de calibrare a fost determinat cu
ajutorul analizei de regresie liniar (ecuaia 8.1):

Arie pic = a x Concentraia + b (rspuns ponderat liniar) (8.1)

unde: Concentraia - concentraia de analit (g/mL)
Arie pic aria picului analitului
a - panta curbei de calibrare
b - interceptul.

Precizia intra-zi (exprimat ca i coeficient de variaie, CV%)
i acurateea (exprimat ca diferena relativ dintre concentraia
obinut i ce teoretic, eroare %) au fost determinate prin analiza a
cinci injecii diferite (n = 5) din fiecare prob de control (concentraie
mic, medie i mare), n aceeai zi. Precizia inter-zile i acurateea au
fost determinate prin analiza unei probe de control de la fiecare nivel
de concentraie (sczut, mediu si ridicat), n cinci zile diferite (n = 5).

Limita inferioar de cuantificare (LLOQ) a fost stabilit ca
fiind etalonul de calibrare cel mai mic care poate fi obinut cu o
acuratee i o precizie mai mici de 20%.

43
Recuperrile absolute au fost msurate prin compararea
rspunsului etalonului de plasm contaminat controlat cu KTP cu
rspunsul etalonului n solvent ce are aceeai concentraie de KTP ca
i plasma.

Pentru validarea diluiei probelor, o prob de VAL-DILconc a
fost diluat 1:10 (v/v) cu plasm martor i analizat n timpul testelor
inter-probe, n cinci zile diferite (n = 5). Cel puin ntr-o zi, cinci
probe de VAL-DILconc (n = 5) au fost ulterior diluate 1:10 (v/v) i
analizate n scopul de a evalua precizia i acurateea pe parcursul
aceleai zile.

Ulterior a fost studiat stabilitatea KTP n plasm la nivelele
inferioare i superioare (n = 5). Pentru testul de stabilitate pe termen
scurt la temperatura camerei (RTS), probele au fost pregtite i se
pstreaz la temperatura camerei timp de 4h, apoi prelucrate i
analizate prin HPLC. Pentru testul de stabilitate post-preparare (PPS),
probele au fost pregtite, prelucrate i termostatate la 25C n
suportul de probe ale autosampler-ului HPLC timp de 12-24 ore
nainte de a ncepe testarea cromatografic. Pentru studiul stabilitii
pe termen lung (LTS), probele au fost depozitate la o temperatur mai
mic de -20C i analizate pe parcursul a dou luni. Pentru studiul
stabilitii la nghe - dezghe (FTS), probele au fost supuse la trei
cicluri de operaii de nghe - dezghe n trei zile consecutive (n = 3).
Cerina pentru stabilitatea medicamentului este ca diferena dintre
concentraiile medii ale probelor analizate n diferite condiii i
concentraiile nominale s se ncadreze n intervalul 15%.

Rezultate i discuii
Prin prezentul studiu se propune o pre-tratare simpl i rapid
a probelor de plasm, care include precipitarea proteinelor (PP) cu
MeOH, centrifugare i injecie direct LC a unei poriuni (alicote) de
supernatant.
Deoarece nivelurile plasmatice terapeutice de KTP sunt foarte
mici (20g/mL), LLOQ stabilit n metoda noastr poate fi acceptat
n scopuri de rutin pentru monitorizarea KTP la concentraii
terapeutice, n plasma adulilor i copiilor.

Condiiile cromatografice, n special compoziia fazei mobile,
au fost optimizate prin mai multe ncercri pentru a obine un semnal
bun, timp de retenie scurt i, n consecin, o productivitate ridicat.
Cele mai bune rezultate au fost obinute cu amestec de ACN i acid

44
trifluoroacetic 1% n ap (55:45, v/v) n condiii izocrate. n condiiile
cromatografice alese, timpul de retenie al KTP a fost de 1,7 min i
durata analizei a fost de 2,1 min.

Validarea metodei
Metoda a fost validat n conformitate cu reglementrile
internaionale. Cromatogramele reprezentative pentru plasm fr
KTP i plasma contaminat controlat cu KTP la LLOQ sunt
prezentate n figura 8.2. Nu au existat compui (picuri) care s
interfereze dintre componentele endogene plasmatice, la i n jurul
timpului de retenie al KTP.

Fig. 8.2. Cromatogramele pentru plasm fr KTP (imaginea de sus),
plasma contaminat controlat cu KTP la limita inferioar de
cuantificare (0,153g/mL) (mijloc) i o prob de plasm obinut de
la un pacient la 2 ore dup administrarea a 50mg KTP
(concentraie gsite: 4,428g/mL) (imagine jos)

45
Curbele de calibrare au fost liniare n intervalul de
concentraie 0,153 - 19,155g/mL n plasm uman, cu un coeficient
de corelaie mai mare de 0,9997. LLOQ a fost 0,153g/mL. Valorile
obinute n timpul procesului de validare al probelor de plasm
(pentru precizie i acuratee intra- i inter-zi) sunt prezentate n
tabelele 8.2 i 8.3.

Tabelul 8.2. Precizia intra-zi (CV%), acurateea (eroare %) i
gradul de recuperare
- determinarea KTP n plasma uman (n = 5) -

Concentraia gsit
(medie)
Grad de recuperare
Concentraie
nominal
(g/mL)
g/mL SD
CV
(%)
Eroare
(%)
(%) SD
0,1532 0,1524 3,57 2,3 -0,5 101,1 2,1
0,4597 0,4416 17,47 4,0 -3,9 96,5 3,9
1,8389 1,7864 24,68 1,3 -2,9 100,3 1,3
6,1296 5,9327 28,72 0,5 -3,2 99,2 0,5

Tabelul 8.3. Precizia inter-zi (CV%), acurateea (eroare %) i
- determinarea KTP n plasma uman (n = 5) -

Concentraia gsit
(medie)
Grad de recuperare
Concentraie
nominal
(g/mL)
g/mL SD
CV
(%)
Eroare
(%)
(%) SD
0,1532 0,1606 9,61 6,0 4,8 103,6 3,5
0,4597 0,4448 5,13 1,2 -3,2 97,9 0,7
1,8389 1,7808 19,84 1,1 -3,2 99,6 1,5
6,1296 5,9578 88,27 1,5 -2,8 99,2 1,5

Toate valorile pentru acuratee i precizie au fost n limitele
recomandate. Valorile gradului de recuperare au fost cuprinse ntre
96,5 103,6%. Diluiile din plasm au putut fi fcute cu un CV% mai
mic de 1,8% i o acuratee mai mic de 2,6% pentru determinrile n
cadrul analizelor i printre analize (tabelul 8.4).

KTP a artat o bun stabilitate n probele de plasm la
temperatura camerei timp de 4h (CV -5,0% la nivelul inferior i -
3,5% la nivelul superior), precum i o bun stabilitate post-preparare
n autosampler pentru cel puin 17 ore la 25C nainte de testarea

46
cromatografic (CV de -3,2% la nivelul inferior i -2,9% la nivelul
superior).

Tabelul 8.4. Precizia (CV%), acurateea (eroare %) i
- validarea diluiei (n = 5) -

Concentraia gsit
(medie)
Concentraie
nominal
(g/mL) g/mL SD

CV (%)

Bias (%)
Intra-zi 3,831 3,889 69,3 1,8 1,5
Inter-zi 3,831 3,932 29,3 0,7 2,6

KTP are o bun stabilitate pe termen lung n plasma stocat
sub -20
C timp de 5 sptmni (CV de -2,1% la nivelul inferior i

0,1% la nivelul superior), precum i o bun stabilitate la succesiunea
nghe - dezghe n plasma trecut prin trei cicluri de nghe - dezghe
(CV de -7.5% la nivelul inferior i -2,2% la nivelul superior).

Metoda validat de analiz ce a fost dezvoltat s-a aplicat ntr-
un studiu de farmacocinetic a KTP la voluntari sntoi. O
cromatogram reprezentativ al unei probe de plasm obinut de la
un voluntar sntos la 2 ore dup administrarea KTP, este prezentat
n figura 8.2 (concentraia gsit: 4,428g/mL).

8.4. Concluzii
Metoda dezvoltat n prezentul studiu este simpl, rapid,
precis i nu implic un cost deosebit. Prin comparaie cu alte metode
de analiz HPLC publicate, pentru determinarea cantitativ a KTP n
plasma uman sau animal, metoda propus de doctorandul n
farmacie se comport mai bine n ceea ce privete viteza i costurile,
atribute eseniale pentru metodele utilizate n analize de rutin.
Aceast metod a fost validat n intervalul de concentraie 0,153-
19,155g/mL, care acoper concentraiile plasmatice terapeutice (<
20g/mL) de KTP. Aceast metod se preteaz pentru o
productivitate crescut i a fost aplicat cu succes ntr-un studiu
farmacocinetic, dar poate avea aplicaii pe scar larg n
monitorizarea KTP la concentraii de nivel terapeutic, a
interaciunilor medicamentoase i n studii toxicologice.

47
CONCLUZII GENERALE
Lucrarea de doctorat, n afara capitolului introductiv i a
scopului i obiectivelor tezei, este structurat n dou pari majore, o
parte teoretic ce conine un numr de 4 capitole i o parte personal
ce conine un numr de 4 capitole, concluziile generale, perspectivele
de cercetare i bibliografia utilizat.

Partea teoretic prezint:
n Capitolul 1 se prezint unele generaliti asupra
medicamentelor AINS, mecanismele inflamaiei, tratamentul
acesteia, clasificarea AINS, relaia structur activitate biologic,
unele aspecte farmacologice generale (farmacocinetic,
farmacodinamie, farmacoterapie) precum i unele aspecte privind
cele 10 medicamente antiinflamatoare studiate (MEL, PIR, TEN,
NIM, IBP, IND, DIC, KTP, KET i FB) cum sunt: structura chimic,
unele proprieti fizico chimice sau aspecte farmacologice
particulare.

Capitolul 2 este dedicat prezentrii modului de absorbie a
luminii de ctre compuii organici. Se discut aspecte privind
originea spectrului UV-VIS, principiile generale ale spectrometriei de
absorbie i unele aplicaii ale acesteia n analiz, ca de exemplu
confirmarea identitii substanelor, spectrofotometria n UV-VIS ca
modalitate de detecie n HPLC, identificarea compuilor separai
prin HPLC, puritatea picului cromatografic.

Capitolul 3 al tezei prezint aspecte asupra analizei
medicamentelor AINS prin HPLC (generaliti ale metodei HPLC,
coloane cromatografice utilizate n HPLC, aplicaii ale HPLC n
analiza medicamentelor i un studiu bibliografic asupra determinrii
substanelor studiate prin aceast tehnic).

Ultimul capitol al prii teoretice, capitolul 4 prezint modul
de evaluare a rezultatelor obinute, anume validarea metodei
analitice. Dup o prezentare general a noiunilor de validare, se
prezint informaii asupra specificitii / selectivitii metodei, modul

48
de stabilire a lungimii de und, identificarea picului corespunztor
analitului studiat, verificarea puritii picului, linearitatea metodei,
linearitatea rezultatelor, limita de detecie, limita de cuantificare,
intervalul de lucru, precizia i exactitatea, robustee i stabilitatea
metodei.

Partea personal a tezei este constituit din urmtoarele
capitole:
n Capitolul 5 se prezint modul n care a fost elaborat
metoda de separare prin HPLC. Se discut pentru nceput aspecte
privind solubilitatea AINS studiate n diveri solveni, optimizarea
prin spectrofotometrie n UV-VIS a lungimilor de und pentru
detecia n HPLC, nregistrndu-se spectrele de absorbie n diferii
solveni (MeOH, ACN, ap, soluii tampon, soluii apoase de metanol
de diferite concentraii). n continuare, se arat modalitatea prin care
se construiete o bibliotec spectral pentru a fi folosit la
determinri calitative n cadrul analizei prin HPLC. n ceea ce
privete separarea propriu-zis prin HPLC, se prezint influena pe
care o are debitul fazei mobile i compoziia acesteia asupra
performanelor separrii cromatografice. Odat stabilite condiiile de
separare se discut modul de alegere judicioas a lungimilor de und
de detecie pentru fiecare compus studiat n parte.

Capitolul 6 al tezei de doctorat este dedicat validrii metodei
unice de analiz elaborate pentru fiecare din cei 10 AINS studiai.
Pentru fiecare compus studiat se prezint modul prin care se
face identificarea acestuia din soluii de probe, studiul linearitii (att
linearitatea metodei ct i linearitatea rezultatelor), limitei de detecie,
limitei de cuantificare, preciziei (precizia sistemului, precizia
metodei, precizia intermediar) i exactitatea. La final, toate aceste
date sunt grupate ca i concluzii ale validrii, pentru a scoate mai
repede n eviden toi aceti parametri.
Dup cum s-a observat din datele experimentale obinute n
urma validrii metodei pentru cele 10 medicamente AINS, durata
analizei este de maxim 10 minute, timp n care se pot separa toi cei
10 componeni (dac se afl n concentraie mic, deoarece n acest
caz limea la baz a picurilor este mic avnd astfel valori suficient
de bune pentru rezoluie). Pe de alt parte, deoarece este puin
probabil ca toi cei 10 compui s se afle simultan ntr-o prob,

49
aceast metod unic poate fi aplicat cu succes pentru separarea,
identificarea i determinarea cantitativ a oricrui compus din cei 10
menionai. Cercetri preliminare denot faptul c exist i alte
medicamente din aceast clas ce pot fi separate prin aceast metod.
n ceea ce privete linearitatea metodei, conform datelor
experimentale obinute, pentru toate cele 10 medicamente
antiinflamatoare studiate, metoda este liniar, coeficienii de regresie
fiind n toate cazurile mai mari de 0,9990. Pentru KET, DIC, NIM i
IBP, domeniul de lucru pornete de la o concentraie mai mare dect
n celelalte cazuri deoarece pentru compuii menionai ariile
picurilor la concentraii mai mici de 1g/mL sunt mai mici dect
limita de detecie, n unele cazuri avnd valori comparative cu
zgomotul de fond.
n acelai timp, n toate situaiile rezultatele calculate sunt n
bun corelaie cu valorile teoretice, la reprezentarea grafic a acestei
dependene se obin drepte cu pant unitar sau foarte apropiat de
unitate, cu intercept foarte mic i cu valori ale coeficienilor de
regresie foarte buni (mai mari de 0,9990).
Metoda elaborat i validrile efectuate confirm faptul c n
toate cazurile se obin valori bune pentru limita de detecie (0,31
1,48g/mL) i limita de cuantificare (1,57 4,50g/mL).
De asemenea, metoda de separare i determinare cantitativ a
celor 10 AINS prezint o bun precizie, valorile experimentale
obinute pentru precizia sistemului ncadrndu-se n intervalul RSD =
0,5400 1,0999%, pentru precizia metodei n intervalul RSD =
1,2329 2,9573% i pentru precizia intermediar n intervalul RSD =
1,1444 2,3410%.
Metoda de separare i determinare cantitativ a celor 10 AINS
este exact, datele experimentale artnd o regsire medie a acestor
medicamente n intervalul 98,31 100,43% cu minime n intervalul
96,3 98,5% i maxime n intervalul 101,1 103,0%.

Capitolul 7 al tezei prezent o serie de aplicaii ale metodei de
determinare prin HPLC a medicamentelor antiinflamatoare studiate i
anume determinarea: MEL din comprimate (Meloxicam LPH
LaborMed PHARMA, 15 mg), PIR din comprimate (Piroxicam LPH
LaborMed PHARMA, 20 mg), TEN din comprimate filmate
(Tenoxicam Neo-endusix, Anfarm Hellas S.A., Pharmaceutical

50
Industry, 20 mg), NIM din comprimate (Nimesulid LPH LaborMed
PHARMA, 100 mg), IBP din capsule (Paduden, Terapia, 200 mg),
IND din capsule (Indometacin, Arena Group SA), DIC din
comprimate (Diclofenac, Terapia, 50 mg), KTP din capsule
(Ketoprofen SR, Terapia, 50 mg), KET din comprimate filmate
(Ketorol, Dr. Reddys Laboratoires, 10 mg).

Conform datelor experimentale obinute, toate formele
farmaceutice analizate se ncadreaz n limitele de abateri prevzute
de FR X, att n ceea ce privete uniformitatea masei ct i n ceea ce
privete coninutul de substan activ.

n Capitolul 8 este exemplificat o aplicaie practic n
domeniul clinic, respectiv o validare de metod analitic HPLC
rapid, de nalt productivitate (durata analizei foarte mic, de
ordinul minutelor) pentru dozarea KTP din plasma uman a unui lot
de voluntari sntoi. Metoda de separare este optimizat din punctul
de vedere al fazei mobile, dimensiunilor coloanei i pre-tratamentului
probelor din plasm.

Perspective de cercetare
Avnd n vedere faptul c metoda de determinare prin HPLC,
dezvoltat i validat, a fost conceput pentru un numr restrns de
medicamente AINS, un lucru ce merit continuat const n
modificarea parial a compoziiei fazei mobile astfel nct s se
rezolve coeluia parial sau total a unor componeni. n acest mod
se poate mri rezoluia determinrii, n special n situaiile n care
timpii de retenie ai compuilor separai sunt apropiai.
O alt perspectiv de cercetare const n introducerea i a
altor medicamente din grupa AINS n lista celor care pot fi separai,
identificai i determinai cantitativ prin aceast metod. n acest fel
se poate obine o metod unic care s furnizeze rezultate viabile
pentru un numr crescut de AINS.
De asemenea, faptul c n compoziia fazei mobile am
introdus tampon acetat, MeOH i ACN este un argument n plus n
cazul posibilitii de a folosi aceleai condiii de separare prin HPLC
dar cu modificare a sistemului de detecie i anume folosirea unui
detector spectrometru de mas (cuplaj LC MS). Acest lucru este

51
util, deoarece astfel s-ar putea mri sensibilitatea deteciei i astfel
metoda se preteaz i pentru determinarea AINS din matrici
complexe (de exemplu, medii biologice) unde concentraia acestora
este mult mai sczut. Investigarea apariiei metaboliilor, permis de
tehnica de detecie propus (MS), va conduce la evaluri ulterioare cu
privire la capacitatea metodei HPLC propuse de a rezolva separarea
acestora, precum i separarea acestora de impuritile din matrice.
Nu n ultimul rnd, o posibilitate modern de rezolvare a
coeluiilor, fr modificarea fazei mobile sau utilizarea unui program
de gradient complex, const n aplicarea cromatografiei ortogonale,
respectiv folosirea a dou (rareori, mai multe) coloane cu faze
staionare de selectiviti diferite, dar complementare fa de scopul
metodei. Prin aceast tehnic, compuii ce coelueaz din prima
coloan sunt rezolvai total pe a doua coloan, nseriat sau
intercalat n fluxul fazei mobile prin selecia controlat automat de
ctre sistemul HPLC.

52
BIBLIOGRAFIE
1. Pitea M, Ghiran D, Murean A. Medicamente antiinflamatoare nesteroidiene.
Cluj-Napoca: Editura Dacia; 1997. ISBN: 973-3506796.
2. Pavelescu M. Medicamente antiinflamatoare nesteroidiene (AINS) i
antireumatice specifice. n: Cristea AN. Tratat de farmacologie. Ediia 1. Ed.
Medical. Bucureti; 2000. p. 617-638. ISBN: 973-3905356.
3. Wagner W, Khanna P, Furst DE. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, disease-
modifying antirheumatic drugs, nonopioid anagesics, & drugs used in gout. n:
Katzung BG (editor). Basic and Clinical Pharmacology. 9th ed. New-York:
McGraw-Hill; 2004. p. 576-603. ISBN: 007-1440976.
4. Morrow JD, Roberts II LJ. Lipid derived autacoids. Eicosanoids and platelet
activating factor. n Hardman JG, Limbird LE, Goodman Gilman A, editors.
Goodman and Gilmans the pharmacological basis of therapeutics. 10th ed. New-
York: McGraw-Hill; 2001. p. 669-686. ISBN: 0071354697.
5. Roberts II LJ, Morrow JD. Analgesic antipyretic and antiinflammatory agents
and drugs employed in the treatment of gout. n Hardman JG, Limbird LE,
Goodman Gilman A, editors. Goodman and Gilmans the pharmacological basis of
therapeutics. 10th ed. New-York: McGraw-Hill; 2001. p. 687-732. ISBN:
0071354697.
6. Cuculici GP (editor). Lippincott farmacologie ilustrat. Ediia a 2-a. Ed.
medical Callisto; 2000. ISBN: 973-9861253. Traducere n limba romn: Mycek
MJ, Harvey RA, Champe PC, Fischer BD. Lippincotts illustrated review:
Pharmacology. 2nd ed. Baltimore: Lippincott Williams and Wilkins; 1997.
7. Mogoan C, Pop C. Mecanisme de aciune ale medicamentelor utilizate n
farmacoterapia durerii. n: Zaharia V. (coord.). Rolul farmacistului n terapia
durerii. Cluj-Napoca: Ed. Medical Universitar Iuliu Haieganu; 2010. p. 26-57.
ISBN: 978-9736933639.
8. Brittain HG (editor). Analytical profiles of drug substances and excipients.
Vol.28. Orlando: Academic Press; 2001. p.197. ISBN: 978-0122608285.
9. Council of Europe (editor). European pharmacopoeia. 6th edition; 2007. ISBN:
978-9287160546.
10. Florey K (editor). Analytical profiles of drug substances and excipients. Vol.15.
Orlando: Academic Press, Inc; 1986. p. 509-531. ISBN: 012-2608151.
11. Vane JR. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for the
aspirin-like drugs. Nature. 1971;231:232235.
12. Hanch C, Sammes PG, Taylor JB. Comprehensive Medicinal Chemistry. Vol.6.
Oxford: Pergamon; 1990. p.711.
13. Piel B, Pirotte B, Delneuville I, Neven P, Labres G, Delarge J et al. Study of the
influence of both cyclodextrins and L-lysine on the aqueous solubility of
nimesulide; isolation and characterization of nimesulide-L-lysine-cyclodextrin
complexes. J Pharma Sci. 1997;86(4):475-480.
14. Budavari S, ONeil M, Smith A, Heckelman P, Obenchain J. The Merck Index.
Twelfth Edition. CRC Press; 1996. ISBN: 978-0911910124.

53
15. Pirotte B, Piel G, Neven P, Delneuville I, Geczy J. PCT Int. Appl. WO 95, 34,
533; Chem.Abs. 124, 242309d; 1996.
16. Macnaughton SJ, Kikic I, Foster NR, Alessi P, Cortesi A, Colombo I. Solubility
of antiinflammatory drugs in supercritical carbon dioxide. J Chem Eng Data.
1996;41:1083-1086. ISSN: 0021-9568.
17. Fallavena PRB, Schapoval EES. pKa determination of nimesulide in methanol-
water mixtures by potentiometric titrations. Int J Pharm. 1997;158:109-112. ISSN:
1873-3476.
18. Magni E. Nimesulide an overview. Drug Invest. 1991;3(2):1-3.
19. Singh S, Sharda N, Mahajan L. Spectrophotometric determination of pKa of
nimesulide. Int J Pharm. 1999;176:261-264. ISSN: 1873-3476.
20. British Pharmacopoeia Commission. British Pharmacopoeea. Stationery Office
Books; 2001. ISBN: 978-0113224463.
21. Mihalic M, Hofman H, Kajfez K, Kuftimek J, Blazevic N, Zinic M.
Physicochemical and analytical characteristics of piroxicam. Acta Pharm.
1982;32:13. ISSN: 1846-9558.
22. Mesecar L. Principles of drug action and therapeutics VIII. Lecture 2-
Chemistry of non steroidal anti inflammatory drugs (NSAIDs). Pharmacy 408.
University of Illinois at Chicago.2001.
23. Altera I, Cajan N, Comoran S, Dncescu P. Manual de laborator clinic.
Editura Medical; 1962. p. 67-73.
24. Comisia Farmacopeei Romne. Farmacopeea Romn. Ediia a X-a. Bucureti:
Ed. Medical; 1993. ISBN: 973-3902268.
25. Padmakumar B. NSAID An overview with special reference to COX-2
inhibitors. Medical College. Alappuzha.
26. Mehanna A. NSAIDs: chemistry and pharmacological actions. Am J Pharm
Educ. 2003;2:67. ISSN: 1553-6467.
27. Thomas AT, Sibin AK, Vinu MJ. A drug utilization study to evaluate the
rationality in the use of NSAID and anti ulcer agents. Calicut Medical Journal.
2003;1(1):e9. ISSN: 0972-9518.
28. Brittain HG (editor). Analytical profiles of drug substances and excipients.
Vol.22. San Diego: Academic Press; 1993. p. 433-459.
29. Mederos A, Dominguez S, Orlandini A, Ghilardi CA, Cecconi F, Gonzlez-
Vergara E. Speciation study of the anti-inflammatory drug tenoxicam (Htenox)
with Cu(II): X-ray crystal structure of [Cu(tenox)2(py)2]EtOH, J Inorg Biochem.
2003;95(2-3):131-140. ISSN: 1873-3344.
30. Shingbal DM, Sarjyotishi S. Quantitative determination of piroxicam in a new
formulation. Indian Drugs. 1988;25(12):531-532. ISSN: 0019-462X.
31. Lednicer D, Mitscher L, George G. Organic chemistry of drug syntesis. Vol.4.
New York: John Willey and Sons, Inc; 1990. p.173.
32. Uverferth K, Laban G, Waltraud G, Lofamann D. On the preparation of 4-
hydroxy- 2-methyl- 3-N- (2-pyridyl)- 2H-1,2 -benzothiazinecarboxamide-1,1-
dioxide. Pharmazie. 1989;44(9):641-42. ISSN: 0031-7144.
33. Windholz M (editor). The Merck index. Ninth edition. New York: Merck
Co.1976.

54
34. Pavia DL, Lampman GM, Kriz GS Jr. Introduction to Spectroscopy.
Philadelphia: W.B. Saunders Company; 1979.
35. Owen T. Fundamentals of modern UV visible spectroscopy. Hewlett-Packard
Company; 1996.
36. Olsen ED. Modern optical methods of analysis. New York: McGrawHill;
1975. p. 1155.
37. Harris DC. Quantitative Chemical Analysis. Fourth Edition. New York: W.H.
Freeman and Company; 1995. p. 122154, 523556.
38. Tnase IG. Tehnici i metode spectrometrice de analiz. Ed. Ars Docendi,
Universitatea Bucureti; 2001. p. 1 232.
39. Boji M, Sndulescu R, Roman L, Oprean R. Analiza i controlul
medicamentelor. Vol.2. Metode instruemntale n analiza i controlul
medicamentelor. Deva: Ed. Intelcredo; 2003. p. 65-76. ISBN: 973-8197153.
40. Skoog DA, Leary JJ. Principles of Instrumental Analysis. Fourth Edition.
Tokyo: Saunders College Publishing; 1992. ISBN: 978-0030233432.
41. Skoog DA, West DM. Principles of Instrumental Analysis. 3rd revised edition.
Thomson Learning; 1985. ISBN: 978-0030012297.
42. Dorneanu V, Stan M, Mustea MF. Chimie analitic. Iai: Ed. Gr. T. Popa -
UMF Iai; 2003.
43. Ewing GW. Instrumental Methods of Chemical Analysis. Tokyo: McGraw-Hill
Koga Kusha Ltd; 1985.
44. Rothe M, Pragst F, Kohn A. Identifying Toxins Using an Extensive Fast and
Automated HPLC Spectral Library. Agilent Technologies. Disponibil la:
http://www.chem.agilent.com/temp/rad94E67/00033841.pdf, consultat: Ianuarie
2006.
45. Bogusz M, Wu M. Standardized HPLC/DAD system, based on retention
indices and spectral library, applicable for systematic toxicological screening. J
Anal Toxicol. 1991;15(4):188197.
46. Papadoyannis IN, Samanidou VF. Validation of HPLC, Encyclopedia of
Chromatography. Marcel Deckker, Inc; 2003. Disponibil online la:
www.dekker.com.
47. Wells M, Dantus M. Validation of chromatographic method. In Cazes J.
(editor). Ewings Analytical Instrumentation Hadbook. 3rd edition. Marcel Dekker;
2005. p. 10151033.
48. Papadoyannis IN, Gika HG. Peak purity determination with a diode array
detector, Encyclopedia of Chromatography. Marcel Deckker, Inc.2003.
Disponibil online la: www.dekker.com.
49. Center for Drug Evaluation and Research. Reviewer guidance. Validation of
chromatographic methods. CEDER.1994. Disponibil la:
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation
/Guidances/UCM134409.pdf
50. Brittain HG (editor). Profiles of drug substances, excipients and related
methodology. Vol.32. First edition. New Jersey: Elsevier; 2005. ISBN: 978-
0122608322.
51. Nemeth T, Haghedooren E, Noszal, Hoogmartens J, Adams E. Three methods
to characterize reversed phase liquid chromatographic columns applied to

55
pharmaceutical separations. J Chemometrics. 2008; 22:178-185. DOI:
10.1002/cem.1108.
52. Weston A, Brown PR. HPLC and CE. Principles and practice. San Diego:
Academic Press; 1997. p. 1-23. ISBN: 978-0121366405.
53. Wang Y, Lehmann R, Lu X, Zhao X, Xu G. Novel, fully automatic hydrophilic
interaction/reversed-phase column-switching high-performance liquid
chromatographic system for complementary analysis of polar and apolar
compounds in complex samples. J Chromatogr A. 2008;1204:28-34.
54. Hendriks MMWB. Chapter 1. Chromatographic introduction. n: Nonlinear
retention modeling in liquid chromatography. Teza de dizertaie. Universitatea din
Groningen.1996. Disponibil la:
http://dissertations.ub.rug.nl/FILES/faculties/science/1996/m.m.w.b.hendriks/c1.pd
f..
55. Ardrey RE. Liquid chromatgraphy mass spectrometry: an introduction.
Chichester: John Wiley and Sons Ltd; 2003. p. 7-31.
56. Niessen WMA. Liquid chromatography mass spectrometry. Third edition.
Boca Raton: CRC Press; 2006. p. 3-22. ISBN: 978-0824740825.
57. Starek M, Krzek J. A review of analytical techniques for determination of
exicams, nimesulide and nabumetone. Talanta. 2009;77:925-942. ISSN: 1873-
3573.
58. Louw S, Pereira AS, Lynen F, Hanna-Brown M, Sandra P. Serial coupling of
reverse-phase and hydrophilic interaction liquid chromatography to broaden the
elution window for the analysis of pharmaceutical compounds. J Chromatogr A.
2008;1208:90-94.
59. Gao LQ, Wu D, Tao XL, Gang YY. Study on the relative bioavailability of
tenoxicam capsules. Yaowu Fenxi Zazhi. 2006;26(5):589-591.
60. Nakamura A, Nakashima MN, Wada M, Nakashima K. Semi-micro column
HPLC of three oxicam non-steroidal anti-inflammatory drugs in human blood.
Bunseki Kagaku. 2005; 54(9):755-760.
61. Doliwa A, Santoyo S, Campanero MA, Ygartua P. Sensitive LC determination
of piroxicam after in vitro transdermal permeation studies. J Pharm Biomed Anal.
2001;26(4):531-537. ISSN: 1873-264X.
62. Brum Jr. L, Ceni DC, Fronza M, de Oliveira PR, Dalmora SL. Validation of an
LC-tandem MS/MS method for the determination of etoricoxib in human plasma
and pharmaceutical formulations. J Liq Chrom Relat Tech. 2006;29(1-4):123-135.
ISSN: 1520-572X.
63. Savaser A, Karatas A, Ozkan Y, Yuksel N, Ozkan SA, Baykara T. Validated
LC determination of the piroxicam -.beta.#NAME?. Chromatographia. 2004;59(9-
10):555-560. ISSN: 1612-1112.
64. Dasandi B, Shivaprakash, Saroj H, Bhat KM. LC determination and
pharmacokinetics of meloxicam. J Pharm Biomed Anal. 2002;28(5):999-1004.
ISSN: 1873-264X.
65. Malliou ET, Markopoulou CK, Koundourellis JE. Simultaneous determination
of clobutinol together with some anti-inflammatory drugs in urine by HPLC. J Liq
Chrom Relat Tech. 2004;27(10):1565-1577. ISSN: 1520-572X.

56
66. Huang Y, Liang MZ, Yu Q, Qin YP, Zou YG. RP-HPLC determination of
meloxicam in human plasma. Yaowu Fenxi Zazhi. 2002; 22(3):183-185.
67. Baeyens WRG, van der Weken G, D'haeninck E, Garcia-Campana AM,
Vankeirsbilck T, Vercauteren A et al. Application of an alkyl-diol silica precolumn
in a column-switching system for the determination of meloxicam in plasma. J
Pharm Biomed Anal. 2003;32(4-5):839-846. ISSN: 1873-264X.
68. Pavan Kumar VV, Vinu MCA, Ramani AV, Mullangi R, Srinivas NR.
Simultaneous quantitation of etoricoxib, salicylic acid, valdecoxib, ketoprofen,
nimesulide and celecoxib in plasma by high-performance liquid chromatography
with UV detection. Biomedical Chromatography. 2006;20(1):125-132. ISSN:
1099-0801.
69. Rao RN, Meena S, Nagaraju D, Rao ARR. Development and validation of a
reversed-phase liquid chromatographic method for separation and simultaneous
determination of COX-2 inhibitors in pharmaceuticals and its application to
biological fluids. Biomedical Chromatography. 2005;19(5):362-368. ISSN: 1099-
0801.
70. Maltese A, Maugeri F, Bucolo C. Rapid determination of nimesulide in rabbit
aqueous humor by liquid chromatography. J Chromatogr B: Analytical
Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2004;804(2):441-443.
71. Ganhimathi M, Ravi TK, Renu SK. Determination of repaglinide in
pharmaceutical formulations by HPLC with UV detection. Analytical Sciences.
2003;19(12):1675-1677.
72. Nagaralli BS, Seetharamappa J, Gowda BG, Melwanki MB. Liquid
chromatographic determination of cetirizine hydrochloride and paracetamol in
human plasma and pharmaceutical formulations. J Chromatogr B: Analytical
Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2003; 798(1):49-54.
73. Chmielewska A, Konieczna L, Plenis A, Bieniecki M, Lamparczyk H.
Determination of diclofenac in plasma by high-performance liquid chromatography
with electrochemical detection. Biomedical Chromatography. 2006;20(1):119-124.
ISSN: 1099-0801.
74. Wu AT, Massey IJ. Simultaneous determination of ketorolac and its
hydroxylated metabolite in plasma by high-performance liquid chromatography. J
Chromatogr Biomed Appl. 1990; 99:241-246.
75. Kumar TR, Shitut NR, Kumar PK, Vinu MCA, Kumar VVP, Mullangi R et al.
Determination of rosuvastatin in rat plasma by HPLC: validation and its application
to pharmacokinetic studies. Biomedical Chromatography. 2006;20(9):881-887.
ISSN: 1099-0801.
76. Kocyigit-Kaymakcoglu B, Unsalan S, Rollas S. Determination and validation
of ketoprofen, pantoprazole and valsartan together in human plasma by high
performance liquid chromatography. Pharmazie. 2006;61(7):586-589.
77. Chawla S, Ghosh S, Sihorkar V, Nellore R, Kumar TRS, Srinivas NR. High-
performance liquid chromatography method development and validation for
simultaneous determination of five model compounds, antipyrine, metoprolol,
ketoprofen, furosemide and phenol red, as a tool for the standardization of rat in
situ intestinal permeability studies using timed wavelength detection. Biomedical
Chromatography. 2006;20(4):349-357. ISSN: 1099-0801.

57
78. Gallo P, Fabbrocino S, Vinci F, Fiori M, DaneseV, Nasi A et al. Multi-residue
determination of non-steroidal anti-inflammatory drug residues in animal serum
and plasma by HPLC and photo-diode array detection. J Chromatogr Sci.
2006;44(10):585-590. ISSN: 0021-9665.
79. Espinosa-Mansilla A, Munoz de la Pena A, Gonzalez Gomez D, Canada-
Canada F. HPLC determination of ciprofloxacin, cloxacillin and ibuprofen drugs in
human urine samples. J Separ Sci. 2006;29(13):1969-1976. ISSN: 1615-9314.
80. Kim CK, Jae JP, Hwang HR, Ban E, Maeng JE, Kim MK et al. Simple and
sensitive HPLC method for determination of gemfibrozil in human plasma with
fluorescence detection. J Liq Chrom Relat Tech. 2006;29(1-4):403-414.
81. Charoo NA, Ali Shamsher AA, Kohli K, Pillai KK, Rahman Z. Simple and
sensitive high-performance liquid chromatographic method for determination of
transdermally applied flurbiprofen in rat plasma and excised skin samples.
Chromatographia. 2005;62(9-10):493-497.
82. Shen HR, Li ZD, Zhong MK. RP-HPLC determination of atorvastatin in beagle
dog plasma. Yaowu Fenxi Zazhi. 2006; 26(6):718-720.
83. Shen HR, Li ZD, Zhong MK. HPLC assay and pharmacokinetic study of
atorvastatin in beagle dogs after oral administration of atorvastatin self-
microemulsifying drug delivery system. Pharmazie. 2006;61(1):18-20.
84. Khuhawar MY, Rind FMA, Rajper AD. High-performance liquid
chromatographic determination of isoniazid, pyrazinamide, and indomethacin in
pharmaceutical preparations. Acta Chromatographica. 2005;15:269-275. ISSN:
1233-2356.
85. Lee HW, Won KJ, Cho SH, Ha YH, Park WS, Yim HT et al. Quantitation of
niflumic acid in human plasma by high performance liquid chromatography with
ultraviolet absorbance detection and its application to a bioequivalence study of
talniflumate tablets. J Chromatogr B: Analytical Technologies in the Biomedical
and Life Sciences. 2005;821(2):215-220.
86. Gonzalez Martin MI, Sanchez Gonzalez CI, Jimenez Hernandez A, Garcia
Cachan MD, Castro de Cabo MJ, Garzon Cuadrado AL. Determination by high-
performance liquid chromatography of phenylbutazone in samples of plasma from
fighting bulls. 2002;769(1):119-126.
87. Han CH, Nie XC. Determination of the concentrations of four components in
Trabit injection A by reversed-phase ion-pair HPLC. Yaowu Fenxi Zazhi.
2001;21(2):88-91.
88. Shaji J, Jain V. Reverse phase HPLC method development an validation for
determination of Meloxicam in bulk and pharmaceutical formulation. Int J Pharm
Sci Res. 2011;2(1):121-129. ISSN: 0975-8232.
89. Nemutlu E, Sayin F, Baci NE, Kir S. A validated HPLC method for the
determination of meloxicam in pharmaceutical preparations. Hacettepe University
Journal of the Faculty of Pharmacy. 2007;27(2):107-118. ISSN: 1300-0608.
90. Hoyo-Vadillo C, Escobar Y, Escobar-Islas E, Venturelli CR. Pharmacokinetics
of the commonly used NSAID: Nimesulide by oral administration to healthy
Mexican volunteers. Proc West Pharmacol Soc. 2003;46:168-196.

58
91. Zhao X, Chen D, Li K, Wang D. Sensitive liquid chromatographic assay for the
simultaneous determination of ibuprofen and its prodrug, ibuprofen eugenol ester,
in rat plasma. Yakugaku Zasshi. 2005;125(9):733-737.
92. Birajdar AS, Meyyanathan S, Suresh B. A RP-HPLC method for determination
of diclofenac with rabeprazole in solid dosage form. Pharma Science Monitor.
2010:448-455. ISSN: 0976-7908.
93. Dhaneshwar SR, Bhusari VK. Validated HPLC method for simulaneous
quantitation of diclofenac sodium and misoprostol in bulk drug and formulation.
Der Chemica Sinica. 2010;1(2):110-118. ISSN: 0976-8505.
94. Madni AU, Ahmad M, Akhtar N, Usamn M. New simultaneous High
Performance Liquid Chromatographic method for determination of NSAIDs and
opioid analgesics in advanced drug delivery systems and human plasma. World
Academy of Science, Engineering and Technology. 2009;55:158-163. ISSN: 2010-
3778.
95. Bandarkar FS, Vavia PR. A stability indicating HPLC method for the
determination of meloxicam in bulk and commercial formulations. Trop J Pharm
Res. 2009;8(3):257-264.
96. Battu PR, Reddy MS. RP-HPLC method for simultaneous estimation of
paracetamol and ibuprofen in tablets. Asian J Research Chem. 2009;2(1):70-72.
ISSN: 0974-4169.
97. Sultana N, Arayne MS, Shafi N, Siddiqui FA. Simultaneous RP-LC Analysis of
Diltiazem and Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs in Pharmaceutical
Formulations and Human Serum. Chromatographia. 2010;71(1-2):71-77.
98. Sora I, Galaon T, Udrescu S, Negru J, David V, Medvedovici A. Fast RPLC-
UV method on short sub-two microns particles packed column for the assay of
tenoxicam in plasma samples. J Pharm Biomed Anal. 2007;43:1437-1443. ISSN:
1873-264X.
99. Arayne MS, Sultana N, Siddiqui FA. A new RP-HPLC method for analysis of
meloxicam in tablets. Pak J Pharm Sci. 2005;18(1):58-62. ISSN: 1011-601X.
100. Bae JW, Kim MJ, Jang CG, Lee SY. Determination of meloxicam in human
plasma using a HPLC method with UV detection and its application to a
pharmacokinetic study. J Chromatogr B. 2007;859:69-73.
101. Zawilla NH, Abdul-Azim Mohammad M, El kousynm, El-Moghazy Aly SM.
Determination of meloxicam in bulk and pharmaceutical formulations. J Pharm
Biomed Anal. 2003;32:1135-1144. ISSN: 1873-264X.
102. Velpandian T, Jaiswal J, Bhardwaj RK, Gupta SK. Development and
validation of a new high-performance liquid chromatographic estimation method of
meloxicam in biological samples. J Chromatogr B. 2000;738:431-436.
103. Vignaduzzo SE, Castellano PM, Kaufman TS. Method development and
validation for the simultaneous determination of meloxicam and pridinol mesylate
using RP-HPLC and its application in drug formulations. J Pharm Biomed Anal.
2008;46:219-225. ISSN: 1873-264X.
104. Ganesan M, Rauthan KS, Pandey Y, Tripathi P. Determination of Ibuprofen in
human plasma with minimal sample pretreatment. Int J Pharm Sci Res.
2010;1(5):120-127. ISSN: 0975-8232.

59
105. Sajewicz M, Kowalska T. On problems with liquid chromatographic
quantification of chiral 2-arylpropionic acids by use of UV-absorbtion-based
detectrion. Acta Chromatographica, 2006;17:292-301. ISSN: 1233-2356.
106. Franceschi L, Daronco S, Furlanut M. A simple and sensitive of HPLC
method to monitor serum and synovial fluid concentrations of ketorolac in
rheumathologic patients. JBABM. 2010;2(6):121-124. ISSN: 1948-593X.
107. Sinha PK, Jeswani RM, Topagi KS, Damle MC. A validated RP-HPLC metod
for determination of meloxicam in the presence of its impurities. Int J PharmTech
Res. 2009;1(4):1051-1060. ISSN: 0974-4304.
108. Ganea M, Bota S, Gligor F, Moisa C, Vica L, Boji M. The identification
and assay of ketoprofen from solid pharmaceutical forms. Validation of HPLC
method. Farmacia. 2008;LVI(4):433-439. ISSN: 2065-0019.
109. Dhaneshwar SR, Salunkhe JV, Bhusari VK. Validated HPLC method for
simultaneous quantitation of levocetirizine hydrochloride and nimesulide in bulk
drug and formulation. IJCP. 2011;2(2):1-4. ISSN: 0976-8157.
110. Hasan SMF, Shoaib MH, Hassan F, Inam-Ur-Rehman. Bioequivalance studies
of two brands of meloxicam tablets in healthy Pakistani volunteers. Pak J Pharm
Sci. 2009;22(2):199-204. ISSN: 1011-601X.
111. Yuwono M, Indryanto G. Validation of chromatographic method of analysis.
n: Brittain HG (editor). Profiles of drug substances, excipients, and related
methodology. Vol.32. Orlando: Academic Press; 2006. p. 243-262. ISBN: 978-
0122608322.
112. *** The United States Pharmacopoeia 28. United States Pharmacopoeial
Convention. MD; 2004. p. 2748 2751.
113. *** ICH Topic Q2B: Validation of Analytical Procedures (CPMP / ICH / 281
/95). The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. Disponibil
la: http://www.uam.es/personal_pas/txrf/MU5.pdf.
114. *** Understanding Your Spectra Module, Agilent ChemStation for LC 3D
System, Agilent Technologies.2003.
115. Roman L, Boji M, Sndulescu R. Validarea metodelor de analiz i control.
Ed. Medical; 1998. ISBN: 973-3903620.
116. Snyder LR, Kirkland JJ, Glajch JL. Practical HPLC method development. 2nd
Edition. John Wiley & Sons, Inc; 1997. ISBN: 978-0471007036.
117. Oprean R, Rozet E, Dew W, Boulanger B, Hubert Ph. Ghid de validare a
procedurilor analitice cantitative. Cluj Napoca: Ed. Medical Universitar Iuliu
Haieganu; 2007
118. Jaba E. Statistica. Bucureti: Ed. Economic; 1998. p.343.
119. Carr GP, Wahlich JC. A practical approach to method validation in
pharmaceutical analysis. J Pharm Biomed Anal. 1990;8:613-618.
120. Somenath M (editor), Brukh R. Sample preparation techniques in analytical
chemistry. John Wiley & Sons, Inc.; 2003.
121. *** Reviewer guidance. Validation of Chromatographic Methods. Center for
Drug Evaluation and Research (CDER), FDA.1994.
122. *** Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Methods
Validation, FDA.1987.

60
123. Detlef W. Development and validation of an HPLC method to analyze IBP
and impurities according to the European Pharmacopoeia. Agilent Technologies
Inc., Application Note, 2010.
124. Dvok J, Hjkov R, Matysov L, Novkov L, Koupparis MA, Solich P.
Simultaneous HPLC determination of ketoprofen and its degradation products in
the presence of preservatives in pharmaceuticals. J Pharm Biomed Anal.
2004;36(3):625-629.
125. Kev N, Vijayasrinivas S, Kumar MK, Mathivanan N, Kumar MS, Meb R.
Simultaneous reverse phase HPLC estimation of NIMe and DICm. Indian J Pharm
Sci. 2003;658(4):407-409.
126. Tomu I, Vlase L, Leucua SE. HPLC determination of indometacin from
human plasma. Ovidius University Annals of Medical Science Pharmacy.
2003;1(1).
127. pac AF, Dorneanu V. Drugs: HPLC analysis of NSAIDs. n: Cazes J (editor).
Encyclopedia of Chromatography. Third Edition. Taylor & Francis Group.2009.
128. Panusa A, Multari G, Incarnato G, Gagliardi L. High-performance liquid
chromatography analysis of anti-inflammatory pharmaceuticals with ultraviolet and
electrospray-mass spectrometry detection in suspected counterfeit homeopathic
medicinal products. J Pharm Biomed Anal. 2007;43(4):1221-1227.
129. Iuliani P, Carlucci G, Marrone A. Investigation of the HPLC response of
NSAIDs by fractional experimental design and multivariate regression analysis.
Response optimization and new retention parameters. J Pharm Biomed Anal.
2010;51(1):46-55.
130. Negru J, pac AF, Dorneanu V. Identificarea unor medicamente
antiinflamatoare nesteroidiene dup separare HPLC i confirmare spectral. Rev
Med Chir Soc Med Nat. 2008; 2(2) - Supl. 1:369-377.
131. Joseph-Charles J, Bertucat M. Determination of MEL in tablets formulations
by ultraviolet spectrophotometry and high-performance liquid chromatography.
Anal Lett. 1999;32(10):2051.
132. Negru J, pac AF, Dorneanu V. Contribuii la alegerea fazei mobile n
vederea separrii prin HPLC i identificarea determinarea cantitativ a unor
antiinflamatoare nesteroidiene folosind detectorul UV-VIS. Rev Med Chir Soc
Med Nat. 2011; 115(1):236-244.
133. Perju AC, pac AF, Dorneanu V. Contribution to the meloxicam
determination by high pressure liquid chromatography. Al XIII lea Congres
Naional de Farmacie, Volumul de rezumate. Cluj Napoca. 28 30 septembrie
2006:78.
134. Perju AC, pac AF, Dorneanu V. Contribution to the nimesulide
determination by high pressure liquid chromatography. Al XIII lea Congres
Naional de Farmacie, Volumul de rezumate. Cluj Napoca. 28 30 septembrie
2006:78.
135. Sarzi-Puttini P, Atzeni F, Lanata L, Bagnasco M, Colombo M, Fischer F,
D'Imporzano M. Pain and KTP: what is its role in clinical practice? Reumatismo.
2010;62(3):172-188.

61
136. Moffat AC, Osselton MD, Widdop B. Clarkes Analysis of Drugs and Poisons
in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. Vol.2. 3rd ed.
Pharmaceutical Press, London, 2004:1156-1157.
137. Flanagan RJ. Guidelines for the interpretation of analytical toxicology results
and unit of measurement conversion factors. Annals of Clinical Biochemistry.
1998;35:261-267.
138. Ossipov MH, Jerussi TP, Ren K, Sun H, Porreca F. Differential effects of
spinal (R)-KTP and (S)-KTP against signs of neuropathic pain and tonic
nociception: evidence for a novel mechanism of action of (R)-KTP against tactile
allodynia. Pain. 2000;87(2):193-199.
139. Lovlin R, Vakily M, Jamali F. Rapid, sensitive and direct chiral high-
performance liquid chromatographic method for KTP enantiomers. J Chromatogr B
Biomed Appl. 1996;679(1-2):196-198.
140. Boisvert J, Caill G, McGilveray IJ, Qureshi SA. Quantification of KTP
enantiomers in human plasma based on solid-phase extraction and enantioselective
column chromatography. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1997;690(1-2):189-
193.
141. Baeyens WR, Van der Weken G, Haustraete J, Aboul-Enein HY, Corveleyn S,
Remon JP, Garca-Campaa AM, Deprez P. Application of the restricted-access
precolumn packing material alkyl-diol silica in a column-switching system for the
determination of KTP enantiomers in horse plasma. J Chromatogr A. 2000;871(1-
2):153-161.
142. Lees P, Taylor PM, Landoni FM, Arifah AK, Waters C. Ketoprofen in the cat:
pharmacodynamics and chiral pharmacokinetics. Vet J. 2003;165(1):21-35.
143. Igarza L, Soraci A, Auza N, Zeballos H. Some pharmacokinetic parameters of
R-(-)- and S-(+)-KTP: the influence of age and differing physiological status in
dairy cattle. Vet Res Commun. 2004;28(1):81-87.
144. Montoya L, Ambros L, Kreil V, Bonafine R, Albarellos G, Hallu R, Soraci A.
A pharmacokinetic comparison of meloxicam and KTP following oral
administration to healthy dogs. Vet Res Commun. 2004;28(5):415-428.
145. Jin YX, Tang YH, Zeng S. Analysis of flurbiprofen, KTP and etodolac
enantiomers by pre-column derivatization RP-HPLC and application to drug-
protein binding in human plasma. J Pharm Biomed Anal. 2008;46(5):953-958.
146. Jack DS, Rumble RH, Davies NW, Francis HW. Enantiospecific gas
chromatographic-mass spectrometric procedure for the determination of KTP and
ibuprofen in synovial fluid and plasma: application to protein binding studies. J
Chromatogr. 1992;584(2):189-197.
147. Paik MJ, Nguyen DT, Kim KR. Enantioseparation of flurbiprofen and KTP in
patches and in urine excretions by achiral gas chromatography. Arch Pharm Res.
2004;27(12):1295-1301.
148. Gowka FK, Karazniewicz-ada M. CE Determination of Ketoprofen
Enantiomers in Clinical Samples of Plasma, Synovial Fluid and Urine.
Chromatographia. 2008;67:S97S105.
149. Martin MJ, Pablos F, Gonzalez AG. Simultaneous determination of caffeine
and non-steroidal anti-inflammatory drugs in pharmaceutical formulations and

62
blood plasma by reversed-phase HPLC from liniar gradient elution. Talanta.
1999;49:453459.
150. Roda A, Sabatini L, Mirasoli M, Baraldini M, Roda E. Bioavailability of a
new KTP formulation for once-daily oral administration. Int J Pharm.
2002;241(1):165-172.
151. Suenami K, Lim LW, Takeuchi T, Sasajima Y, Sato K, Takekoshi Y, Kanno
S. Rapid and simultaneous determination of nonsteroidal anti-inflammatory drugs
in human plasma by LC-MS with solid-phase extraction. Anal Bioanal Chem.
2006;384(7-8):1501-1505.
152. Suenami K, Lim LW, Takeuchi T, Sasajima Y, Sato K, Takekoshi Y, Kanno
S. On-line sample extraction and enrichment of non-steroidal anti-inflammatory
drugs by pre-column in capillary liquid chromatography mass spectrometry. J
Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;846(1-2):176-1783.
153. Vergote GJ, Vervaet C, Van Driessche I, Hoste S, De Smedt S, Demeester J,
Jain RA, Ruddy S, Remon JP. In vivo evaluation of matrix pellets containing
nanocrystalline KTP. Int J Pharm. 2002;240(1-2):79-84.
154. Granero GE, Amidon GL. Possibility of enterohepatic recycling of KTP in
dogs. Int J Pharm. 2008;349(1-2):166-171.
155. Qiu HX, Liu J, Kong H, Liu Y, Mei XG. Isobolographic analysis of the
antinociceptive interactions between KTP and paracetamol. Eur J Pharmacol.
2007;557(2-3):141-146.
156. Negru J, Popa DS, Vlase L, Iacob D, Achim M, Dorneanu V. High-
throughput HPLC method for rapid quantification of ketoprofen in human plasma.
Farmacia. Acceptat spre publicare.
157. Popa DS, Vlase L, Leucua SE, Loghin F. Determination of cocaine and
benzoylecgonine in human plasma by LC-MS/MS. Farmacia. 2009;57(3):301-308.
158. Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of
Health and Human Services, Food and Drug Administration. Federal Register.
2001; 66.
159. Guidance on the Investigation of Bioavailability and Bioequivalence. The
European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for
Proprietary Medicinal Products. 2001; CPMP/EWP/QWP/1401/98.
160. Vlase L, Popa DS, Muntean D, Mihu D, Leucuta S. A New, High-Throughput
HPLC/MS Assay for Therapeutic Level Monitoring of Digoxin in Human Plasma.
J AOAC Intern. 2009;92(5):1390-1395.
161. Butnariu A, Popa DS, Vlase L, Andreica M, Muntean D, Leucuta S. New
high-throughput liquid chromatographic tandem mass spectrometry assay for
therapeutic drug monitoring of carvedilol in children with congestive heart failure.
RRML. 2009;15(2):7-15.
162. Vlase L, Popa DS, Leucuta SE, Loghin F. Bioanalysis of methadone in human
plasma and urine by LC/MS/MS. Rev Roum Chimie. 2008;53(12):11571164.
163. Vlase L, Popa DS, Muntean D, Achim M. A New LC/MS/MS Method for
Determination of Lisinopril in Human Plasma. Studia Universitatis Babe-Bolyai
Chemia. 2010:55(1):91-101.

Rezumat Teza - Negru Jean - Romana

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Rezumat Teza - Negru Jean - Romana

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Universitatea de Medicin i Farmacie

C timp de 5 sptmni (CV de -2,1% la nivelul inferior i

S-ar putea să vă placă și