1

Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar

Ion Ionescu de la Brad Iai

Sinteza rezultatelor

Programul CNCSIS: IDEI
Tipul proiectului: Proiecte de cercetare exploratorie
Cod proiect: ID_666
Contractul de finanare nr. 275/2007
Perioada 2007 2010

Titlul proiectului: Cercetri pentru determinarea cantitativ simultan a patru bacterii
patogene din produse alimentare prin PCR n timp real multiplex

Director de proiect: ef de lucrri dr. Viorel FLORITEAN
Obiective
Principalul obiectiv ale acestui proiect a fost punerea la punct a unei metode de detectare
rapid multipl din alimente a patru bacterii patogene importante pentru sigurana alimentelor
(Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 i Campylobacter jejuni).
Ca obiective secundare n cadrul proiectului s-a urmrit:
organizarea i dotarea unui laborator de biologie molecular pentru analiza
alimentelor n cadrul Laboratorului de siguran alimentar al Facultii de Medicin
Veterinar din Iai.
formarea de specialiti necesari pentru buna funcionare a laboratorului, obiectiv
realizat prin efectuarea de ctre tinerii cercettori implicai n proiect a unor stagii de
pregtire n Laboratorul de microbiologie a alimentelor al Facultii de Medicin
Veterinar din Liege, Belgia

Crearea de metode de detectare i de stabilire a numrului de bacterii patogene prin metode
rapide i specifice, constituie un obiectiv permanent valabil, pentru a rspunde nevoilor industriei
alimentare i a autoritilor de reglementare. Aceste metode sunt eseniale pentru evaluarea
inocuitii produselor alimentare, a validrii practicilor de producie, dar i pentru obinerea datelor
necesare pentru evaluarea riscurilor legate de consumul unui anumit aliment.
n microbiologia alimentelor, metodele tradiionale cuprind izolarea si identificarea
microorganismului. n funcie de germenul n cauz, intervalul de rspuns poate fi de cteva zile,
chiar de o sptmna. n paralel cu metodele tradiionale, n ultimii ani s-au dezvoltat metode
alternative, mai rapide, n special metode de biologie moleculara foarte sensibile i deosebit de
specifice. Ele ofer astzi perspective vaste n detectarea microorganismelor patogene, fiind
reprezentate de hibridarea moleculara si de amplificarea genica. Ele pun n eviden un fragment de
acid nucleic, ADN sau ARN, ca marker de contaminare a unui produs alimentar.
Metodele care se bazeaz pe caracterizarea genetic proprie a fiecrui microorganism permit
detectarea acestuia n condiii de nalt specificitate i sensibilitate. Metodele de PCR n timp real
au nceput s fie utilizate n industria alimentar dar exist dificulti legate de situaiile n care
reacia este inhibat.
2

Datorit dezvoltrii spectaculoase a tehnologiei PCR n timp real, se remarca un interes
deosebit pentru punerea la punct a unor protocoale de diagnostic a germenilor responsabili de
producerea de toxiinfecii alimentare. n ultimii douzeci de ani s-a dezvoltat amplificarea ADN in
vitro prin PCR, care este un instrument foarte important pentru diagnosticul microbiologic. A doua
generaie de metodologii bazate pe PCR permite att amplificarea unor fragmente specifice de acid
nucleic ct i determinarea imediat a nivelului de amplificare.

2. Material i metod
Culturi bacteriene, medii de cultur i condiiile de cultivare
Culturile bacteriene folosite n cadrul studiului au provenit n marea lor majoritate din
colecia laboratorului de microbiologie alimentar fiind izolate din alimente de origine animal
acestea fiind identificate i confirmate pe baza caracterelor morfologice, culturale i biochimice. Pe
lng tulpinile autohtone, pentru confirmarea rezultatelor obinute, au fost folosite mai multe
tulpini bacteriene de referin: Salmonella enterica serovarietatea enteritidis ATCC 4391; Listeria
monocytogenes - ATCC 35152; Escherichia coli O
157
H
7
ATCC 43895; Campylobacter jejuni
ATCC 33291 i Campylobacter coli ATCC 43478.
Culturile bacteriene pregtite au fost cultivate iniial pe medii selective pentru purificare
(Agar MCCD- Preston pentru Campylobacter spp., Agar MacConkey cu sorbitol pentru E. coli
O157:H7, Agar XLD pentru Sammonella spp. respectiv Agar Cromo Listeria pentru Listeria
monocytogenes).
De pe mediile selective, colonii caracteristice au fost trecute pe mediul TSA (S. enteritidis,
L. monocytogenes, E. coli O157:H7). Dup o incubare de 12 18 ore la 37
0
C, cu o ans s-a
transferat o colonie n mediul lichid (TSB). Culturile au fost incubate la 37
0
C timp de 24 ore
agitndu-se recipientele continuu (200 rpm) pentru a se atinge faza staionar a dezvoltrii
bacteriene. Pentru Campylobacter jejuni incubarea s-a efectuat n atmosfer controlat (5% O
2
,
10% Co
2
i 85% N) la 42
0
C n bulion nutritiv suplimentat cu snge defibrinat de oaie (5%) i
supliment Preston Campylobacter..
Substraturile alimentare au fost inoculate cu celule bacteriene aparinnd celor patru specii,
separat i n combinaie, n concentraii variabile. Au fost realizate ncrcturi bacteriene de la 10
pn la 10
6
UFC/g sau ml, prin introducerea unor probe de aliment n volume de 10 ori mai mari de
ap peptonat steril, nsmnat cu culturi bacteriene pe mediul lichid, n pungi din plastic sterile
i omogenizate n stomacher. Nivelul ncrcturii bacteriene a fost stabilit, pentru fiecare specie
bacterian prin nsmnarea diluiilor seriate pe mediile solide prezentate anterior.
Extracia ADN
Pentru extracia ADN a fost folosit kitul Prepman Ultra (Applera - Applied Biosistems,
Biogen Romania).
n cazul culturilor pe medii solide: Celulele bacteriene, prelevate cu o ans steril din
coloniile specifice au fost suspendate n 100 l reagent PrepMan Ultra. Amestecul a fost vortexat
energic timp de 5 minute dup care a fost nclzit la 100
0
C i pstrat la acest temperatur timp de
10 minute. Dup tratamentul termic amestecul a fost adus la temperatura camerei i centrifugat la
12.000 rpm timp de 2 minute. Un volum de 50 l din supernatantul rezultat n urma centrifugrii a
fost transferat ntr-un tub special i pstrat la 4
0
C pn la utilizare.
n cazul culturilor pe medii lichide a fost prelevat un volum de 1 ml cultur care a fost
centrifugat la 12000 rpm timp de 2 minute. Supernatantul a fost ndeprtat prin aspirare cu
protejarea sedimentului. Peste sedimentul rezultat s-a adugat 100 l reagent PrepMan Ultra.
Amestecul a fost vortexat energic timp de 5 minute apoi nclzit la 95 - 100
0
C i pstrat la aceast
temperatur timp de 10 minute pe un termobloc (Biometra, Germania). Dup tratamentul termic
amestecul a fost adus la temperatura camerei i centrifugat la 12000 rpm timp de 2 minute. Un
volum de 50 l din supernatantul rezultat n urma centrifugrii a fost transferat ntr-un tub special i
pstrat la 4
0
C pn la utilizare.
Din probele contaminate a fost prelevat cte un ml din partea lichid rezultat n urma
omogenizrii care a fost transferat ntr-un tub steril i a fost supus centrifugrii la 16000 rpm timp
3

de 3 minute. Amestecul a fost vortexat energic timp de 5 minute apoi nclzit la 95 -100
0
C i pstrat
la aceast temperatur timp de 10 minute. Dup tratamentul termic amestecul a fost adus la
temperatura camerei i centrifugat la 12.000 rpm timp de 2 minute. Un volum de 50 l din
supernatantul rezultat n urma centrifugrii a fost transferat ntr-un tub special i pstrat la 4
0
C pn
la utilizare.
Extracia ADN din proba de aliment, nainte de inocularea cu bacterii s-a efectuat dup o
procedur similar; ADN-ul rezultat, n amestec cu ADN-ul de la tulpinile de referin purificat
fiind utilizat pentru depistarea inhibitorilor de reacie.
Primeri i sonde
Primerii i sondele utilizate au fost obinui cu ajutorul programului Primer Express 2.0
(Applied Biosystems) pornindu-se de la secvene nucleotidice specifice celor patru bacterii. Pentru
Salmonella s-a pornit de la gena ttr (GenBank AF282268), pentru Escherichia coli a fost luat n
considerare gena rfbE (GenBank S83460), pentru Listeria monocytogenes a fost analizat gena
HlyA (GenBank AF253320) iar pentru Campylobacter jejuni a fost luat n studiu gena VS1
(GenBank X71603)
n urma analizei combinate a celor patru gene au fost obinute un numr de 32 de combinaii
de primeri specifici pentru cele patru bacterii. Dintre acestea au fost alese pentru testare dou
combinaii caracterizate prin parametrii cei mai convenabili pentru punerea la punct a metodei PCR
de detectare multipl rapid (temperatura de denaturare, raportul G-C i lungimea ampliconului).
Primerii testai sunt formai dintr-un numr de 20 24 nucleotide, au o temperatur de
denaturare cuprins ntre 58,7 i 59,9
0
C, i delimiteaz ampliconi cu lungime variabil, cuprins
ntre 207 i 684 perechi de baze.
Pornindu-se de la seturile de primeri au fost obinute sondele caracteristice pentru
ampliconii delimitai de primeri. Sondele obinute sunt alctuite din 20 24 nucleotide
compelmentare nucleotidelor de pe una dintre cele dou catene ale ampliconului, i au temperatura
de denaturare cu 5 pn la 7
0
C mai mare dect primerii. La extremitatea 5a sondelor s-a ataat unul
din markerii fluoresceni:VIC, FAM, TET i Texas Red iar la captul opus un inhibitor de
fluorescen unic DQ. Alegerea markerilor fluoresceni a fost fcut inndu-se cont de lungimea de
und la care acetia emit fluorescena maxim i de filtrele cu care este dotat aparatul cu care s-a
efectuat experimentele (Applied Biosystems Real-Time PCR 7500) n aa fel nct s se reduc la
maximum posibilitile de suprapunere a spectrelor de emisie. n ceea ce privete inhibitorul de
fluorescen s-a apelat la un inhibitor unic care nu emite fluorescen deoarece instrumentul folosit
are numai cinci filtre disponibile. Sondele de tip MGB (Minor Grove Binding) folosite se deosebesc
de alte sonde prin aceea c au o temperatur de topire mai mare dect a sondelor cu marker
fluorescent
Primerii i sondele astfel concepute au fost sintetizate de ctre Applied BioSystems USA.
Specificitatea primerilor i a sondelor obinute a fost testat in silico cu ajutorul
programului Primer Express 2.0 i prin utilizarea bazei de date BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool) aparinnd Centrului National pentru Informare Biotehnologic (NCBI) care poate fi
accesat on line la adresa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi i ulterior prin in vitro
folosindu-se ADN extras din culturile pure ale tulpinilor de referin i ale tulpinilor bacteriene din
colecia laboratoarelor de microbiologie i igien ale Facultii de Medicin Veterinar din Iai (11
tulpini de Salmonella spp., 9 tulpini de Listeria monocytogenes, 2 tulpini de Escherichia coli
O157:H7 i 8 tulpini de Campylobacter jejuni).
Real time PCR
Amplificarea genic s-a efectuat cu ajutorul unui aparat Real-Time PCR 7300 (Applied
Biosystems USA) Experimentul a fost efectuat pe fiecare tulpin bacterian n parte, pe grupuri de
cte dou, trei i, n final, patru baterii. Au fost efectuate teste att pe culturi bacteriene ct i pe
substraturi alimentare contaminate artificial. Reaciile au fost efectuate n triplicat.
Prin tatonare i n concordan cu structura i dimensiunile primerilor i a sondelor s-a
stabilit un protocol de lucru similar pentru toate cele patru bacterii analizate. Pentru optimizarea
condiiilor de reacie au fost folosite concentraii variabile de primeri (ntre 100 i 400 nM) i sonde
4

(ntre 50 i 200 nM). Amplificarea s-a fcut n microplci, n godeurile acestora introducndu-se
cte TakMan Environmental PCR Master Mix (Applied Biosystems) i amestec primeri i sonde de
la speciile bacteriene. (Volumele folosite au variat ntre n funcie de numrul speciilor bacteriene
testate simultan). Dup agitarea lent a acestora, n godeuri a fost introdus i ADN-ul extras anterior
i adus la o concentraie stabilit anterior. Godeurile au fost acoperite cu folia adeziv pentru a se
preveni contaminarea i introduse n sistemul de amplificare. Amestecul a fost supus unei
temperaturi de 50
0
C timp de 5 minute, apoi la 95
0
C pentru 10 minute, pentru activarea enzimei
AmpliTaq Gold i la 40 de cicluri de formate din dou etape: denaturare la 95
0
C timp de 15 s i
aliniere elongare 60 63
0
C timp de 1 minut (temperatura optim de legare a primerilor/sondelor a
fost stabilit dup mai multe ncercri pentru a se obine un randament maxim).
Rezultatul reaciei a fost vizualizat n timp real cu ajutorul software-ului ce nsoete
sistemul de amplificare prin monitorizarea evoluiei fluorescenei dup fiecare ciclu de amplificare.
Optimizarea reaciei PCR
Orice metod PCR, nainte de a fi introdus n practica de laborator trebuie s fie optimizat,
adaptat unor reageni bine caracterizai i stabilirea cu exactitate a procedurilor de lucru.
Procesul de optimizare se refer la stabilirea cu exactitate a temperaturii i timpului de
legare a primerilor i sondelor, stabilirea concentraiei optime de primeri, sonde i nucleotide

pentru ca amplificarea s se desfoare cu eficien apropiat de 100%.
Pentru optimizarea reaciei puse la punct n laborator s-au folosit unor concentraii ce au
variat ntre 40 i 200 M pentru nucleotide (dNTPs). Concentraia prea mare a nucleotidelor n
mixul de reacie poate constitui un factor de inhibare a reaciei n timp ce concentraia prea mic
mpiedic amplificarea prin aportul insuficient de nucleotide.
n ceea ce privete concentraiile primerilor i a sondelor au fost testate mai multe
combinaii ncepnd cu concentraiile standard recomandate de productorul primerilor i sondelor
(Applied Biosystems) respectiv 10 M pentru sonde i 50 M pentru primeri.
Un alt aspect avut n vedere pentru optimizarea reaciei PCR a fost asigurarea puritii
ADN-ului extras, prin diluare, n vederea ndeprtrii eventualilor inhibitori provenii din matricea
alimentar.
Purificarea ADN s-a efectuat atunci cnd absorbana determinat prin spectrometrie a fost
mai mare de 1,8 2, prin tratarea acestuia dup cu fenol, cloroform i izopropanol urmat de
centrifugare i precipitarea ADN cu etanol.
De asemenea, tot referitor la ADN a fost necesar aflarea cantitii optime de ADN ce
trebuie introdus n reacie pentru a se obine valori optime ale amplificrii. O cantitate prea mare
de ADN va inhiba reacia prin favorizarea consumului unor cantiti exagerate de nucleotide nc
din primele cicluri ale amplificrii. Pe de alt parte o cantitate prea mic de ADN va conduce la
obinerea de amplificri nespecifice.
Concentraia iniial a ADN-ului din probe a fost determinat spectrofotometric
determinndu-se absorbana la 260 nm cu ajutorul unui spectrofotometru SmartSpec 3000(BioRad,
Frana). Materialul genetic extras a fost diluat cu ap ultrapur (DNase free) obinndu-se diluii
seriate pentru testarea sensibilitii reaciei. Diluarea a fost efectuat ori de cte ori a existat
suspiciunea existenei n extras a unor inhibitori.
Cantitatea optim de ADN a fost stabilit prin tatonare prin diluarea acesteia nainte de
testare.
Validarea reaciei PCR
Una dintre etapele cele mai dificile i mai costisitoare din procesul de impunere a unei
metode de laborator este validarea acesteia.
Validarea metodei PCR iniiat n laboratorul nostru a constat n efectuarea de teste multiple
i repetate pe un numr mare de tulpini pentru a se evidenia sensibilitatea i specificitatea metodei.
Pentru stabilirea limitelor de detecie a reaciei PCR de detectare multipl (multiplex) au fost
testate diluii zecimale ale materialului genetic (1010
4
) i sau comparat rezultatele cu cele obinute
n urma reaciilor PCR efectuate pentru fiecare bacterie separat (uniplex) la diluii similare.
5

Sensibilitatea reaciilor PCR (uniplex i multiplex) a fost analizat i n urma inoculrii
artificiale crnii de pasre cu cele patru specii bacteriene.
Specificitatea metodei a fost testat pe un grup de 9 tulpini bacteriene din colecia proprie,
din specii mai mult sau mai puin nrudite cu cele testate (S. gallinarum, Enterobacter spp. S.
typhimurium, S. arizonae, Klebsiella spp., S. enteritidis, Pseudomonas spp., Staphylococcus spp.,
Pasteurella multocida).
Controlul contaminrii
Prevenirea contaminrii probelor a fost obinut prin separarea fizic a spaiilor: n care a
fost extras ADN-ul; s-au introdus primerii, sondele i master mixul, i s-a realizat amplificarea-
citirea.
Tot pentru prevenirea efectelor nedorite ale contaminrii a fost utilizat Universal MasterMix
cu UNG Amperase, care previne amplificarea ADN-ului contaminant.

Rezultate i discuii
n urma experimentelor efectuate, pornindu-se de la secvene nucleotidice a cror
specificitate pentru cele patru specii bacteriene, s-au obinut mai multe seturi de primeri pentru
fiecare dintre cele patru specii de bacterii. Primerii i sondele obinute au secvene nucleotidice
diferite de cele descrise n literatura de specialitate.
Testarea specificitii primerilor i a sondelor
Cele patru perechi de secvene nucleotidice concepute pentru a fi complementare cu gene
caracterizate prin specificitate ridicat pentru Salmonella spp., E. coli O157:H7, Listeria
monocytogenes i Capmylobacter jejuni, n urma testrilor in silico i in vitro pe culturile
bacteriene selecionate au demonstrat c sunt specifice pentru fiecare specie bacterian, producnd
ampliconi cu dimensiunea prognozat. Specificitatea relativ a fost demonstrat pe un numr total
de 34 de tulpini bacteriene dintre care 4 tulpini de referin ATCC.
Testarea sensibilitii metodei
Sensibilitatea unei reacii PCR poate fi stabilit prin identificarea numrului minim de
secvene nucleotidice int ce poate fi detectat n condiii de specificitate ridicat i cu obinerea de
rezultate reproductibile.
Testarea sensibilitii reaciei a necesitat un protocol complex care a constat n efectuarea de
determinri pe ADN-ul celor patru bacterii separat i dup gruparea acestora, extras att din
culturile obinute pe medii specifice ct i din carnea de pasre dup inocularea experimental a
acesteia. ADN-ul obinut a fost diluat, obinndu-se diluii cu coninut de ADN bine determinat.
Sensibilitatea testului Real-Time PCR uniplex
n cazul testelor PCR, efectuate pentru fiecare baterie n parte, n condiiile studiului, s-a
reuit detectarea unor cantiti de ADN corespunztoare unei ncrcturi bacteriene pornind de la 1
UFC/ml pentru toate cele 4 specii bacteriene testate (Tabel 1).
Tabel 1 Amplificarea ADN-ului bacterian obinut prin extracie din culturile bacteriene, n
concentraii diferite, prin RT-PCR

Inocul log
UFC/ml
(genom
echivalent)
PCR uniplex
Salmonella E. coli O157:H7
Listeria
monocytogenes
Campylobacter
jejuni
0 + + + +
1 + + + +
2 + + + +
3 + + + +
4 + + + +
5 + + + +
6

Repetarea testelor, n condiii similare, pe ADN extras consecutiv inoculrii experimentale a
crnii de pasre a furnizat rezultate concludente ns limita de detecie a fost de 10 UFC/ml pentru
trei din cele patru specii bacteriene (Salmonella, E. coli, Campylobacter jejuni) (Tabel 2).

Tabel 2 Amplificarea ADN-ului bacterian obinut prin extracie din carne, n concentraii diferite,
prin RT-PCR

Inocul (log
UFC/ml)
genom
echivalent
PCR uniplex
Salmonella E. coli O157:H7
Listeria
monocytogenes
Campylobacter
jejuni
0 - - + -
1 + - + +
2 + + + +
3 + + + +
4 + + + +
5 + + + +

Reducerea limitei de detecie a fost consecina prezenei n mediul de reacie a unor
inhibitori. Identificarea inhibitorilor de reacie este foarte dificil. Acetia pot aciona prin reducerea
activitii enzimelor necesare amplificrii, degradarea materialului genetic sau prin reducerea
eficienei extraciei materialului genetic. Literatura de specialitate citeaz numeroi factori care pot
avea aciune inhibitoare cu origine n carne dar mecanismul intim de aciune al acestora nu este pe
deplin cunoscut. Cele mai des citate sunt unele molecule organice din carne i snge, cum sunt
glicogenul, unii compui fenolici i imunoglobulinele. Principalele metode prin care se reduce
efectul inhibitorilor de reacie utilizate n prezent constau n alegerea unor metode de pregtire a
probelor preponderent fizice cum este flotaia care concentreaz materialul genetic la partea
superioar a tuburilor de centrifugare sau prin adugarea unor stimulatori de amplificare n
amestecul de reacie (albumin seric de bovine), care acioneaz prin legarea inhibitorilor sau prin
atenuarea efectului proteazelor ce pot afecta ADN polimeraza. n cazul nostru, deoarece astfel de
substane au fost prezente n mixul de reacie fiind introduse de ctre productor cauza principal a
reducerii limitei de detecie pare a fi legat de metoda utilizat la pregtirea probelor. n etapa
ulterioar de optimizare a reaciei va trebui s modificm metoda de extracie a ADN ului pentru a
reduce astfel de fenomene.
Evaluarea curbelor standard de amplificare obinute prin regresia linear a valorilor CT
(Cycle Threshold = punctul n care fluorescena dezvoltat prin amplificare depete limita de
detecie, stabilit manual sau automat de ctre aparatul de amplificare) obinute prin amplificarea
diluiilor seriate ale ADN-ului extras din culturile bacteriene i din carnea de pasre a demonstrat
eficiena procesului de amplificare.
Compararea acestor curbe arat, de asemenea, o eficien a amplificrii mai mic n cazul
ADN ului obinut n urma inoculrii crnii de pasre. Valorile R
2
sunt, de regul mai mari n cazul
ADN ului din culturile bacteriene. Valorile CT mai mari de 39 au fost interpretate ca lips de
amplificare deoarece, dup specificaiile productorului sistemului de amplificare, acestea depesc
sensibilitatea acestuia
Optimizarea metodei
n urma optimizrii, prin ajustarea cantitilor de reactivi i controlul temperaturii de
desfurare a reaciei s-a reuit obinerea de unor eficiene ale procesului de amplificare cuprinse
ntre 62,85 i 98,12. Eficiena procesului de amplificare a fost mai mare n cazul reaciilor de tip
multiplex. Cele mai mici valori ale eficienei amplificrii au fost obinute n cazul reaciilor
multiplex n care au fost testate tulpinile de Campylobacter jejuni, situaii n care nu s-a reuit
obinerea unei eficiene a procesului de amplificare satisfctoare prin modificarea cantitilor de
reactivi utilizai sau a temperaturii de desfurare a reaciilor (Tabel 3).
7


Tabel 3. Rezultatele procesului de optimizare al reaciilor PCR

Metoda Specia Bacteriana
ADN Primeri Sonde MasterMix Temperatura
Eficiena
reaciei
Vol. Vol. Conc. Vol. Conc. Vol. I II
Uniplex
Salmonella spp. 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 90 60 92,63
E. coli O157H7 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 90 60 86,55
Listeria monocytogenes 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 90 60 93,35
Campylobacter jejuni 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 90 60 92,63
Duplex
Salmonella spp. 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l
90 60
93,35
Campylobacter jejuni 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 68,86
Salmonella spp. 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l
90 60
89,19
Listeria monocytogenes 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 92,63
Salmonella spp. 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l
90 60
96,71
E. coli O157H7 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 74,22
Campylobacter jejuni 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l
90 60
63,57
Listeria monocytogenes 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 89,24
Campylobacter jejuni 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l
90 60
64,21
E. coli O157H7 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 89,25
Listeria monocytogenes 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l
90 60
98,12
E. coli O157H7 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 76,97
Triplex
Salmonella spp. 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l
90 60
84,66
Listeria monocytogenes 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 91,35
E. coli O157H7 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 82,54
Salmonella spp. 2,2 l 0,8 l 50M 0,5 10M 12,5 l
90 60
91,53
Listeria monocytogenes 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 83,35
Campylobacter jejuni 2,8 l 1,2 l 50M 0,5 10M 12,5 l 62,85
Campylobacter jejuni 2,8 l 1,2 l 50M 0,6 10M 12,5 l
90 60
67,63
Listeria monocytogenes 2,5 l 1 l 50M 0,5 10M 12,5 l 89,35
E. coli O157H7 2,2 l 0,9 l 50M 0,4 10M 12,5 l 89,63

8

Eficiena redus a procesului de amplificare, constatat n reaciile de tip multiplex poate fi
pus pe seama unor incompatibiliti ntre primerii i sondele alese fapt care, n principiu, ar pute
fi corectat prin tatonri i testarea unor combinaii variate ntre acestea i cantitatea de ADN de la
bacteriile analizate.
Din pcate lipsa fondurilor nu a permis achiziionarea n timp util a tuturor reactivilor
necesari i efectuarea unei optimizri/validri dup toate regulile artei.

Concluzii
1. Metodele ce au la baz biologia molecular la modul general i n special cele bazate pe
Real Time PCR reprezint tehnici versatile de detecie i caracterizare a microorganismelor
din alimente;
2. Aceste metode extrem de sensibile trebuie efectuate n laboratoare de specialitate. dotate
corespunztor, cu personal bine instruit i cu respectarea riguroas a protocoalelor de lucru
prin care se poate asigura obinerea de rezultate relevante tiinific i cu aplicabilitate n
practic;
3. n condiiile experimentelor efectuate, secvenele nucleotidice (primeri i sonde)
identificate pentru detecia i cuantificarea celor patru bacterii patogene din alimente au
dovedit specificitate ridicat;
4. Metoda pus la punct n acest experiment a dovedit sensibilitate pentru detecia i
cuantificarea speciilor de bacterii patogene vizate;
5. Dintre cele patru specii bacteriene luate n studiu, n urma experimentelor efectuate au fost
obinute rezultate concludente pentru trei (Salmonella, E. coli O157:H7 i L.
monocytogenes), n cazul speciei Campylobacter jejuni rezultatele fiind concludente doar
pentru testele de tip uniplex.
6. Sensibilitatea metodei a fost mai mare n cazul testelor uniplex dect n cazul testelor
multiplex.
7. Sensibilitatea metodei s-a diminuat atunci cnd experimentele au fost efectuate pe alimente
inoculate artificial;
8. n cazul testelor uniplex, limita de detecie stabilit n condiiile studiului efectuat a variat
de la 1 UFC/ml pentru L. monocytogenes la 10 UFC/ml pentru Salmonella, E. coli
O157:H7 i Campylobacter jejuni.
9. n cazul testelor multiplex, limita de detecie a variat 1 UFC/ml pentru L. monocytogenes la
10 UFC/ml pentru Salmonella, E. coli O157:H7, pentru specia Campylobacter jejuni
rezultatele nepermind nc stabilirea limitei de detecie;
10. Procesul de optimizare a metodelor PCR este unul anevoios i costisitor fapt care a fcut
imposibil efectuarea a unui numr suficient de determinri, necesare pentru a se
mbunti parametri funcionali ai metodei puse la punct;
11. Timpul scurt, unele probleme tehnice i mai ales lipsa fondurilor a fcut imposibil
efectuarea testelor necesare pentru a se pune la punct o metod de detectare a celor patru
bacterii luate n considerare;
12. Cu toate c obiectivul principal al proiectului a fost parial realizat, din motive obiective,
rezultatele obinute sunt ncurajatoare;
13. Cercetrile iniiate prin acest proiect ar trebui continuate, pentru a se valorifica rezultatele
obinute pn n prezent, i punerii la punct a metodei de detectare simultan a celor patru
bacterii, ceea ce ar constitui o premier mondial.
14. Laboratorul de biologie molecular din cadrul Laboratorului de Siguran Alimentar al
Facultii de Medicin Veterinar, dotat n principal cu fonduri din acest proiect, dispune
de specialiti capabili s realizeze aceste obiective n condiiile unei finanri
corespunztoare.
Director proiect,
ef de lucrri dr. Viorel FLORITEAN