EXTRACIA ENZIMELOR

Este evident c pentru a putea nelege n detaliu comportarea unei enzime ntr-un sistem
complex n care ea exist n mod obinuit - aa cum sunt organitele celulare (mitocondrii,
lizozomi, ribozomi etc.), celule, tesuturi, organe parti sau ntregul organism este necesar s
ncercm n primul rnd s-i nelegem proprietile n cel mai simplu sistem posibil, adica o
solutie apoasa. n cele mai multe cazuri, cnd enzima este exocelular, sistemul simplu este
constituit dintr-o soluie enzimatic care conine i mici cantiti de ioni,
molecule tampon, cofactori, etc. n alte cazuri, ns, cum sunt cele n care enzimele sunt
endocelulare, componente a unor organite celulare sau sunt legate de membranele celulare
izolarea enzimei este un proces mai complicat, deoarece enzima poate fi inactivat prin insasi
procesul de separare sau dac n mediu nu exist unii componeni adiionali specifici.

Strategia de alegere a sursei enzimatice

Pentru studierea proprietatilor structurale sau/si biochimice ale unei enzime trebuie aleasa
sursa care raspunde cel mai bine cerintelor de izolare cu:
activitate catalitic maxim adic enzima prezent sa nu fie degradat sau inactivat;
puritate maxim posibil adic nu trebuie s conin alte enzime sau molecule mari;
randament maxim posibil rezultat din procentul de activitate recuperat comparativ cu
activitatea extractului original. In cazul in care se doreste si purificarea enzimei acesta
este un criteriu definitoriu in alegerea metodei de purificare.
Strategia de alegere a unui material biologic pentru extragerea unei enzime utilizabile in
diferite scopuri sau pentru studiul ei este necesar s se in cont de o serie de factori cum
sunt:

abundena enzime;

disponibilitatea i preul de cost;

localizarea enzimei (preferabil extracelulara);

caracterizarea sursei;

studii comparative.

In toate etapele de alegere a sursei trebuie sa se aibe in vedere posibilele dificulti n

manipularea sursei si stabilitatea enzimei in timpul procesului de extractie.
1. Abundena enzimei. Deoarece pentru orice studiu, experimentare si/sau aplicare este
necesar s se obin extracte proteice totale cu concentraii ridicate ale enzimei de interes
trebuie alese surse biologice bogate n enzima dorit.
Astfel rdcinile de hrean sunt surse extrem de bogate in peroxidaze, muchiul inimiii este
bogat n lactatdehidrogenaze, glandele mamare n periada lactaiei sunt o surs bun de
acetil CoA carboxilaze i rinichii sunt bogai n hidrolaze.
Microorganismele sunt surse de obinere prin procese biotehnologice a enzimelor utilizate n
diverse domenii cum sunt agricultura, industria alimentar, industria farmaceutic, pielrie
etc. De exemplu un microorganism cunoscut de toat lumea, drojdia de bere
(Saccharomyces cerevisiae), care este utilizat n special n panificaie i industria berii, se
obine uor n cantiti mari i este foarte bogat n enzime glicolitice. Avantajul utilizrii
microorganismelor ca surse de enzime, const n faptul c prin modificri ale mediului de
cultur sau modificri genetice se poate crete nivelul de producie a enzimei de interes.
Astfel sinteza -D-galactozidazei poate fi indus la E. coli prin creterea bacteriei ntr-un
mediu care conine lactoz (substratul enzimei) ca unic surs de carbon.
Dezvoltarea tehnicilor de clonare molecular, a ADN-ului recombinant, a determinat apariia
unor noi metode de realizare a unor tulpini de microorganisme nalt productoare de enzime.
n aceast tehnic, gena care codific o enzim este izolat de la organismul parental i
expresat la un nivel ridicat ntr-un organism de cretere convenabil cum sunt E. coli
(Escherichia coli) i drojdiile. Prin aceast tehnic o tulpin de E. coli a produs de 100 pn la
200 de ori mai mult glutation reductaz dect tulpina slbatic.

In acelasi mod, tehnicile moderne pot fi utilizate si in productia de enzime prin culturi de celule
vegetale, animale sau microbiene.
Trebuie s subliniem c dei aceste tehnici reprezint posibiliti reale de cretere a
capacitii de biosintez a unei enzime pot aprea probleme considerabile la exprimarea unor
gene eucariote n celule procariote, astfel nct, n unele cazuri proteinele supra exprimate
pot forma agregate insolubile i recuperarea activitii enzimatice din acestea nu a fost
totdeauna posibil.
2. Disponibilitatea sursei si pretul de cost. Sursa biologic trebuie s fie accesibil
atat din punct de vedere geografic cat i economic. n acest sens nu se recomand utilizarea
unor surse scumpe, ca de exmplu muchiul de homar (kinaze, tiaminaze), sau a unor surse
care se gsesc n regiuni, locuri ndeprtate, exotice, ale globului (ex. specii bioluminiscente
- luciferaze).
esuturile umane sunt surse greu de procurat n multe ri si in cele mai multe cazuri cad sub
incidenta unor legi protective fata de etica de obtinere a acestora.
n multe situaii sursele clasice pentru anumite enzime au fost nlocuite de surse alternative:
De exemplu creierul porcului de guinea, sursa clasic pentru extracia i purificarea
histamin-metiltransferazei, poate fi nlocuit cu rinichiul de porc, surs mai ieftin i mai
accesibil;
n studiul structurii subunitare a ceruloplasminei umane (se afla in sange, sintetizata in
ficat/hepatocite este o -globulina cuprica enzima feroxidazica: Fe 2+Fe3+), o
problem a fost sensibilitatea mare a acestei proteine la atacul enzimelor proteolitice.
Cnd s-a descoperit c ceruloplasmina uman este aproape similar cu cea porcin,
studiile au fost orientate spre aceast surs n care proteina se gsete n cantiti
mult mai mari i este mai stabil la atacul enzimelor proteolitice;
Enzimele pectolitice necesare obtinerii sucurilor limpezi din fructe sau legume se obtin
cu ajutorul microorganismelor. Obtinerea lor din fructe le-ar ridica pretul foarte mult
ceea ce ar duce la indisponibilitatea lor pentru industria de sucuri.

Sursele animale sau microbiene tradiionale pentru anumite enzime pot fi nlocuite la ora
actual de microorganisme obinute prin inginerie genetic sau de culturi de celule eucariote.
n alegrea sursei de izolare i purificare a unei enzime trebuie s se fac un compromis ntre
abundena i accesibilitatea acesteia.
3. Localizarea unei enzime, intracelular sau extracelulara, este esenial de cunoscut
pentru a se putea stabili cea mai convenabil metod de extracie. Astfel dac o enzim are o
singur localizare n celul (cum sunt de exemplu succinat dehidrogenazele i alte enzime din
ciclul acizilor tricarboxilici care se gsesc exclusiv n mitocondrii) se poate utiliza pentru
purificare i studiu un omogenat obinut din ntregul esut.
n cazul unor enzime similare ca functionalitate si structura, localizate n mai multe formaiuni
intracelulare, este necesar o fracionare subcelular nainte de a ncepe purificarea enzimei
de interes. Astfel, n cazul purificrii adenozintrifosfatazei mitocondriale, enzim implicat n
transportul H+, este necesar obinerea unui preparat mitocondrial cu puritate rezonabil,
pentru a se evita contaminarea cu alte adenozintrifosfataze implicate de exemplu n
transportul Na+ i K+ prin membrana celular.
Fracionarea subcelular se realizeaz prin procese specifice de centrifugare, deoarece
organitele celulare sedimenteaz la diferite valori ale forelor centrifugale
4. Caracterizarea sursei. Sursa aleas trebuie s fie perfect caracterizat.
Cnd sursa aleas este vegetal, este necesar cunoaterea genului, speciei, varietii
acesteia i partea din planta care se foloseste ( tulpina, radacina, fruct, seminte, frunze etc.).
Adeseori este necesara si cunoasterea zonei, climei in care s-a dezvoltat sursa vegetala
precum si perioada de recoltare.
Pentru surse animale, este necesar prelevarea de esuturi sau organe de la animale
normale, avnd acelai sex, aceiai greutate i vrst, care au fost supuse unui regim
alimentar identic. n cazul surselor animale este necesar cunoaterea aproximativ a
compoziiei sursei pentru a nltura unele interferene care pot aprea pe parcursul extraciei
i purificrii. De exemplu, ficatul conine o cantitate mare de glicogen care interfer n multe
dozri. Pentru a limita aceste interferene, animalele de laborator trebuie supuse unui regim
de inaniie nainte de sacrificare. Partea endocrin a pancreasului este bogat n lipide care
4

interfer n extracia enzimelor. Pentru a limita acest neajuns se recomand ndeprtarea

mecanic a acesti pri a pancreasului nainte de extracia enzimelor.
n cazul microorganismelor este necesar utilizarea unei tulpini bine caracterizate, crescut
pe medii de cultur cu compoziie bine determinat.
5. Studii comparative.
Unele enzime au fost studiate in unele specii sau in diferite tesuturi ale unor specii. In
asemenea cazuri este de mare importanta sa se studieze enzimele respective si in diferite
alte specii sau tesuturi in vederea evaluarii evolutiei enzimei, proprietatile ei comparativ cu
altele similare, structura primara, tertiara, diferitele izoenzime etc.

Metode de extracie
Exist numeroase metode de extracie a enzimelor extracelulare (medii n care acestea se
afl in afara celulelor) ct i endocelulare (enzimele se afla in interiorul celulelor). In ultimul
caz sunt necesare metode speciale de spargere a celulelor. Alegerea metodei de extracie
este dependent de natura esutului, organismului sau mediului utilizat ca surs enzimatic.
Astfel unele materiale biologice permit obinerea de soluii clare sau aproape clare de
proteine, enzime, prin simple procedee de filtrare sau centrifugare deoarece enzimele sunt, n
aceste cazuri, libere n solventul (in majoritatea cazurilor apa) materialului biologic respectiv.
n aceast categorie putem aminti ca exemple urmtoarele: urina, laptele, serul sanguin,
sucul unor fructe, veninul de arpe, mediile extracelulare rezultate dup cultivarea
microorganismelor sau a celulelor animale sau vegetale. Alegerea unei astfel de surse
prezint avantajul c materialul de la care se pornete procedeul de extracie conine un
numr relativ mic de componente, iar proteinele extracelulare sunt relativ stabile. Unele dintre
aceste surse, cum este urina sau supernatantele culturilor de celule, datorita dilutiei existente,
trebuie supuse unor operaii de concentrare nainte de nceperea purificrii efective.
n cazul unor surse este, ns, necesar extracia proteinei cu o anumit activitate enzimatic
dintr-un esut sau dintr-un anumit tip de celul. n aceste cazuri, alturi de proteina de interes
5

sunt eliberate un numr mare de alte molecule contaminante, printre care i enzime
proteolitice, enzime care fac destul de dificil purificarea proteinei de interes. Astfel, extracia
i purificarea unei proteine particulare dintr-o surs solid implic cel mai adesea un
compromis ntre gradul de recuperare (randament) i puritatea acesteia (factor de purificare).
Dezintegrarea celulelor sau esuturilor i eliberarea coninutului acestora n mediul de
extracie se poate realiza printr-o serie de metode specifice.
n anumite cazuri se prefer sau este necesara dezintegrarea esuturilor i prepararea unor
populaii omogene de celule intacte nainte de ruperea membranelor celulare.
Alegerea metodei de dezintegrare depinde de sursa si de tipul de esut sau organ utilizat ca
surs de izolare a enzimei. n urma dezintegrrii celulare se obin omogenate celulare care
conin componentele celulare suspendate n mediul de extracie. Principalele metode utilizate
pentru dezintegrarea celulelor sunt :

Metoda

Principiul de baz
Metode blnde

Liza celular

Ruperea osmotic a membranei celulare

Digestia enzimatic

Ruperea pereilor celulari; eliberarea coninutului

celular n mediu.

Omogenizator

Potter- Celulele sunt dezintegrate ntr-un spaiu ngust

Elvehjem

existent ntre pistil i pereii de sticl; membranele

celulare sunt rupte datorit forelor care apar;
Metode moderate

Omogenizator cu cuite

Membranele sunt tiate cu ajutorul unor lame care

(Warning blendor)

se rotesc

Mojarare n prezen de

Membranele

nisip, alumin sau perle

abraziv a particulelor de nisip sau alumin

sunt

ndeprtate

prin

aciunea

de sticl
6

Metode severe
Presare
(French press)

Celulele sunt forate s treac prin orificii mici la

presiuni foarte mari astfel incat forele de rupere
afecteaz integritatea membranelor

Decompresiune

Celulele sunt echilibrate cu un gaz inert la presiune

exploziv

scazuta, ceea ce determin ruperea membranelor

i eliberarea coninutului celular

Mcinare cu bile
(bead mill)
Ultrasonicare

Vibraiile rapide realizate cu ajutorul perlelor de

sticl conduc la ndeprtarea pereilor celulari
Tratarea suspensiilor celulare cu frecvene sonice
determin ruperea membranelor

nghe-dezghe repetat

Ruperea legturilor de hidrogen i a celor hidrofobe

realizate ntre enzime i alte componente precum si
a membranelor ca urmare a inghetarii apei.

Se recomand pe ct posibil utilizarea unor metode de dezintegrare blnde, care s nu

afecteze enzima de interes i s nu determine eliberarea enzimelor degradative din organite
celulare de tipul vacuolelor sau/si a lizozomilor.