Separarea, extractia enzimelor

O extracie, separare, o purificare de succes, este determinat, pentru o enzim, o substan,

de evaluarea corect a proprietilor specifice ale acesteia.
Pentru alegerea procesului de separare trebuie sa se tina cont in primul rand de sursa
enzimatica si de principalele caracteristici majore ale enzimelor, ce pot fi exploatate n
procesele de separare si anume:

dimensiunea;

sarcina electric;

solubilitatea i

prezena unor situsuri specifice de legare.

Procesele, etapele fiecarui proces, utilizate pentru separarea, extracia i dac este cazul
purificarea unei enzime, trebuie astfel alese nct s fie ct mai convenabile pentru enzima de
interes.
Pentru realizarea unei extracii, indiferent dac este vorba de omogenat global sau din fracii
subcelulare si indifferent de natura sursei, prima etap este omogenizarea total sau
parial a sursei. O schem general ce trebuie urmat n acest scop este prezentat n fig
nr.1 n funcie de natura sursei, metodele de omogenizare sunt diferite.
Extracia enzimelor din sngele mamiferelor.
Sngele poate fi pstrat n mai multe feluri.
Pentru a obine ser, sngele este prelevat n absena anticoagulanilor n tuburi de sticl.
Dup formarea cheagului de snge, se centrifugheaz, supernatantul limpede fiind serul.
Majoritatea enzimelor rmn n stare activ pentru o perioad de cel puin o lun, dac la 1
ml snge, prelevat pe anticoagulani de tipul heparinei sau EDTA ului, se adaug 0,15 ml de
amestec acid citrat dextroz (ACD), cu un coninut de 0,8 g de acid citric, 2,2 g de citrat
trisodic i 2,45 g de dextroz la 100 ml soluie. Sngele cu ACD poate fi pstrat la temperaturi
cuprinse ntre +20 i +60C. nghearea acestuia poate inactiva unele enzime, ca de exemplu
lactat dehidrogenaza.

Fluide de origine
animala sau vegetala

Precipitarea/indepartarea
Componentelor nedorite
(ex. cazeina, hematii)

Culturi
microbiene
Enzime
exocelulare

Enzime
endocelulare

Separare lichid/solid

omogenizare

Organite
celulare

Tesut, organ
integral

solide

lichide

Separarea organitelor,
omogenizare partiala
si fractionare

Separare lichid/solid

solide

Tesuturi,organe
animale si vegetale

lichide

omogenizare/dezintegrare celulara

Separare lichid/solid

DESEURI

lichide

solide

Indepartarea
acizilor nucleici DESEURI

CONCENTRARE

Purificare

CONDITIONARE

PRODUS

Fig. 1 Schema general a etapelor implicate n extracia i purificarea enzimelor

2

Metode de omogenizare a microorganismelor

Enzimele biosintetizate de microorganisme sunt de dou feluri : exocelulare i endocelulare.
Enzimele exocelulare sunt eliberate de microorganisme n mediul de cultur, izolarea
acestora realizndu-se printr-o filtrare, centrifugare a mediului.
Izolarea enzimelor endocelulare este mai dificil datorit pereilor celulari duri ai
microroganismelor. Ruperea pereilor celulari se poate realiza prin utilizarea unor metode
severe de dezintegrare cum ar fi:

sonicarea;

mojararea n prezena agenilor abrazivi perioade lungi de timp;

agitarea n prezena perlelor de sticl;

nghe dezghe repetat;

aplicarea unor presiuni mari (French press).

Gradul de rupere al pereilor celulari poate fi monitorizat prin examinare microscopic. Dac
suspensia celulelor dezintegrate conine agregate gelatinoase de acizi nucleici este indicat
sonicarea acestora nainte de centrifugare.
Pe lng problemele ridicate de prezena peretelui celular dur, drojdiile i ali fungi conin
cantiti mari de enzime proteolitice. Acest dezavantaj poate fi minimalizat prin selecia sau
construcia unor mutante deficitare n producia de proteinaze sau prin represarea sintezei
acestora prin creterea pe medii care nu conin substraturi proteice. Dac acest lucru nu este
posibil este necesar adugarea de inhibitori ai proteinazelor (ex. azida de sodiu).
Metode de omogenizare a esuturilor provenind de la animale
Omogenizarea esuturilor animalelor este relativ uoar deoarece cele mai multe dintre
acestea nu au pereii celulari rigizi. Extraciile se realizeaz n mod obligatoriu din esuturi
proaspete sau pstrate la 800C. Inainte de pstrare esuturile proaspete trebuie ngheate
rapid n azot lichid (- 1960C).
nainte de a fi prelucrate/omogenizate este necesar ca probele de esut s fie splate cu o
soluie salin de concentraie 1,8% pentru ndeprtarea sngelui contaminant.

n mod obinuit esutul este tiat n buci mici, mrunit apoi omogenizat cu ajutorul unor
aparate numite omogenizatoare de tip Waring Blender sau Potter-Elvehjem. n general
esuturile mai tari, cum sunt muchii scheletici sau cei ai inimii, sunt tocate i omogenizate cu
aparate de tip Waring Blender care este prevzut cu cuite metalice. esuturile moi, cum sunt
cele de ficat sau creier sunt omogenizate cu aparate de tip Potter-Elvehjem. Acesta este
format dintr-un pistil de Teflon sau sticl care este ataat la o tij de metal i introdus ntr-un
vas de sticl grunjos pe interior. n spaiul ngust dintre sticl i pistil se introduce o cantitate
corespunztoare de esut i mediu de extracie. Pistilul este rotit rapid (n medie cu 1000
rpm), micare care determin dezintegrarea esuturilor i celulelor.
Omogenizrile cu astfel de aparate trebuie realizate la rece pentru a preveni nclzirea
probelor.
Extracia enzimelor prin procesul de omogenizare se realizeaz n cele mai multe cazuri timp
de 30 de minute. Omogenatul obinut este centrifugat si extractul clar obinut este extractul
proteic total (EPT).
Pentru realizarea unei extractii prin omogenizare se folosesc medii extractive. Mediile de
extracie utilizate sunt diverse i se aleg n funcie de esutul ce se omogenizeaz de natura
enzimei i de localizarea intracelular a enzimei de interes.
Taria ionica a mediilor de extractie se alege in functie de solubilitatea enzimelor de interes.
Astfel enzimele uor solubile se extrag n medii cu trii ionice mici (de exemplu creatin kinaza
din muchi este extras cu o soluie de KCl 0,01 M), iar cele mai greu solubile in medii cu trii
ionice mari (de exemplu lipaza gastrica in soluie de KCl 1 M).
n cazul n care se dorete dezintegrarea organitelor subcelulare se utilizeaz medii de
extracie izotonice. Soluiile izotonice realizeaz aceiai presiune osmotic ca cea datorat
coninutului celular i conin in general 0,3 moli L-1 specii dizolvate. Astfel de soluii sunt cele
de zaharoz sau manitol tamponate cu Tris [Tris(hidroximetil)aminometan)] sau Hepes [acid
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetan sulfonic] la pH = 7,4.

Tris

Hepes
4

Unele enzime nu pot fi eliberate n mediu dup dezintegrare cu ajutorul omogenizatoarelor.

De exemplu mitocondriile nu sunt dezintegrate complet prin astfel de metode. n astfel de
situaii se procedeaz fie la sonicare pe perioade de timp de pn la 1 minut, fie la adiia unor
cantiti mici de detergeni (Triton X-100, deoxicolat de sodiu). De exemplu Triton X-100 n
concentraie de 0,1% (w/v) crete solubilizarea 5-nucleotidazei i adenozin kinazei din multe
esuturi.
Unele enzime exist n esuturile animale sub forme interconvertibile, dintre care unele sunt
mai puin active. n astfel de cazuri se recomand alegerea mediului si conditiilor de extractie
adecvate pentru obinerea formei active. De exemplu, forma activ a glicogen fosforilazei,
forma a, poate fi obinut dac extracia se realizeaz la pH = 6,2 i n prezena ATP ului,
Mg2+, Ca2+ i F-. n aceste condiii fosforil - fosfataza, enzima care convertete forma a la
forma inactiv b, este inhibata, iar fosforil - kinaza, enzim care catalizeaz conversia la
forma a este activat. Fosforilaza b poate fi extras n prezena activatorului su alosteric
AMP-ul.
Metode de omogenizare a materialelor biologice vegetale
Extracia enzimelor din plante ridic probleme speciale datorit:

prezenei peretelui celulozic tare;

volumului mare ocupat de vacuole;

concentraiilor mari de pigmeni i compui fenolici;

a concentraiilor mici de proteine.

contaminare cu acizi nucleici

Pentru spargerea peretilor celulozici tari se folosesc metode de omogenizare dure.

Ruperea vacuolelor conduce la eliberarea proteinazelor i la scderea pH ului extractului
dac acesta nu este tamponat corespunztor.
Pentru evitarea efectelor nedorite se utilizeaza procedee i medii de extracie diferite n
funcie de esutul vegetal ales ca surs biologic.
O mare problema in cazul plantelor sunt compuii fenolici, care n prezena oxigenului, sub
aciunea unor enzime numite fenoloxidaze, sunt transformai n pigmeni polimerici. Aceti
5

pigmeni pot adsorbi i inactiva unele enzime din extracte. Pentru a minimaliza aceste efecte
si avnd n vedere c fenoloxidazele sunt active numai n prezena oxigenului este convenabil
ca extractele sa se prepare la rece i n atmosfer de N 2, mai ales in cazul esuturilor plantelor
lemnoase. Prin ngheare n azot lichid nainte de dezintegrare acestea devin fragile i uor
de mcinat. Daca tesuturile sunt moi sau nu avem azot lichid, in mod obisnuit se adaug n
mediile de extracie,: 2 mercaptoetanol, substan care inhib fenoloxidazele i un polimer
de tipul polivinilpirolidon care adsoarbe polimerii fenolici.

HS-CH2-CH2-OH
2 mercaptoetanol

polivinilpirolidon

Observatie
Contaminarea EPT ului cu acizi nucleici poate fi estimat prin msurarea absorbiei la 260 i la 280 nm. Dac
raportul absorbanelor se apropie de valoarea 1, contaminarea cu acizi nucleici este mare.

Interaciile proteine acizi nucleici pot fi slbite prin creterea triei ionice a mediului si ca un
rezultat precipitare fie a acizilor nucleici fie a proteinelor.
Acizii nucleici pot fi ndeprtai prin metode de precipitare cu sulfat de protamin (concentraie
final de 0,2 0,4 g la 100 ml), streptomicin (concentraie final de 1 2 g la 100 ml) sau
MnCl2 (50 mM). O alt alternativ este adiia de deoxiribonucleaz I (10 g/ml), enzim care
degradeaz ADN-ul.
Proteinele se precipita in general prin intermediul sulfatului de amoniu pn la o concentraie
de 0,2 M. Dup realizarea extraciei sulfatul trebuie ndeprtat din mediu acest lucru
efectundu-se de obicei prin dializ.

Izolarea organitelor celulare

Izolarea organitelor celulare este necesar atunci cnd enzima de interes are o localizare
intracelular. Avnd n vedere faptul c, formele moleculare ale enzimelor pot avea proprieti
cinetice i moleculare diferite, studiul uneia dintre forme, cu o localizare intracelular
caracteristic, nu poate fi realizat dect prin separarea fraciei subcelulare n care aceasta se
gsete.

Au fost puse la punct mai multe procedee de separare a organitelor celulare dintre acestea
cele mai utilizate fiind:

Separarea organitelor celulare prin centrifugare difereniat

Separarea organitelor celulare prin centrifugare izopicnic

Separarea organitelor celulare prin centrifugare difereniat.

Dupa liza peretilor celulari, organitele celulare din depozitele celulare ale microorganismelor
sau esuturile animale/vegetale pot fi separate prin creterea treptat a forei centrifugale. n
aceast tehnic fraciile sedimentate la diferite valori ale forei centrifugale aplicate, conin
diferite organite celulare.
Sedimentarea diferitelor componente ale unui amestec, intr-un camp centrifugal se poate
caracteriza prin ecuatia:

in care:
v = viteza de sedimentare;
d = diametrul particulelor;
S = densitatea particulelor;
l = densitatea solutiei;
= viteza angulara (in radiani, s-1);
r = raza sistemului de rotatie;
FS = factor de corectie pentru interactiile particulelor si obstructionarea depunerii.
= vascozitatea cinematica;
= factor geometric ce caracterizeaza particulele (pentru particulele sferice este egal
cu 1);
Pentru o separare cat mai completa sedimentele obinute sunt reluate n tampon i
resedimentate. Repetarea acestor operaii de 2 3 ori pentru fiecare fracie n parte, conduce
7

la o mai bun separare a organitelor celulare, in special a nucleilor, mitocondriilor i

microzomilor (microzomii apar ca urmare a ruperii reticulului endoplasmatic prin procedeul de
dezintegrare celular aplicat). Procedeul nu conduce la o bun separare a mitocondriilor de
lizozomi, ntruct aceste formaiuni au mase i densiti foarte apropiate.
O modalitate de a realiza o bun separare a lizozomilor de mitocondriile din ficatul de obolan
const n injectarea animalului nainte de sacrificare cu Triton WR 1339 (detergent anionic,
sare de sodium a unui alchil aril poliester sulfat) sau cu aur coloidal. Cele dou substane
sunt fagocitate de lizozomi, cauznd creterea, densitilor lizozomilor i implicit separarea lor
de mitocondrii.
Un model general de separare a organitelor celulare este prezentat in fig.nr.2

Celule dezintegrate
Centrifugare la 600 g,
10minute

Sediment
(Nuclei)

Supernatant
(Mitocondrii, lizozomi, microzomi,
ribozomi, fractia solubila)
Centrifugare la 1000 g,
10 minute

Sediment
(Mitocondrii, lizozomi)

Supernatant
(Microzomi, ribozomi, fractia solubila)
Centrifugare la 100.000 g
3 ore

Sediment
(Microzomi, ribozomi)

Supernatant
(Fractia solubila)

Fig.2 Schema generala de separare a organitelor celulare prin centrifugare diferentiata.

Observatie:
Exprimarea conditiilor de centrifugare se poate face prin Forta centrifugala relativa (RCF), exprimata prin unitati
de gravitatie (g), sau prin viteza (rotatii pe minut)(RPM). Relatia de transformare dintre RCF si RPM este:
g = (1,118x10-5) R S2
unde g este forta centrifugala, R raza rotorului in cm si S viteza centrifugii in rotatii per minut.

Integritatea organitelor obinute se poate evalua prin studii de microscopie electronic.

Puritatea organitelor celulare separate poate fi testat biochimic, prin determinarea activitii
enzimelor marker specifice pentru fiecare formaiune intracelular. De exemplu, prezenta unei
activiti succinat dehidrogenazice, enzim exclusiv mitocondrial, n preparatele nucleare,
indic o contaminare a acestora cu mitocondrii.
De exemplu unele enzime marker sunt pentru:
Nuclei: ADN nucleotidiltransferaza i nicotinamid-nucleotid adeniltransferaza;
Mitocondrii: succinat dehidrogenaza i citocrom c oxidaza;
Reticul endoplasmatic: glucozo 6-fosfataza;
Lizozomi: fosfataza acid i ribonucleaza;
Peroxizomi: catalaza;
Citosol: glucozo 6-fosfat dehidrogenaza, lactat dehidrogenaza i 6-fosfofructokinaza.
Separarea organitelor celulare prin centrifugare izopicnic
n aceast tehnic organitele celulare sunt separate prin centrifugare n gradient de densitate.
Gradientul de densitate se realizeaz cu ajutorul unui mediu, numit Percoll, cel mai usor de
obtinut de la firma suedez Pharmacia. Percollul const din particule coloidale de silicagel, cu
diametrul cuprins ntre 15 i 30 nm, acoperite cu polivinilpirolidon. Cu ajutorul Percoll-ului se
pot forma gradiente de densitate cuprinse ntre 1,0 i 1,3 mg/ml, pe un interval de pH cuprins
ntre 5,5 i 10. Valori de pH sub 5,5 i prezena ionilor bivaleni determin gelificarea matricei
de silicagel. Gradientele necesare separrii organitelor pot fi create, fie printr-o cretere
regulat a densitii (linear sau sigmoidal), fie printr-o cretere n trepte a densitii.
Percoll-ul poate fi separat de organitele purificate prin centrifugare timp de 2 ore la 100.000g,
organitele rmnnd plasate deasupra sedimentului format.
Datorit faptului c Percoll-ul este un mediu care mprtie lumina, n evaluarea activitilor
enzimatice n prezena acestuia sunt preferate metodele de fluorescen n detrimentul celor
spectrofotometrice.