Separarea, extractia

enzimelor
dimensiunea;
sarcina electric;
solubilitatea i
prezena unor situsuri specifice de legare.

Fluide de origine
animala sau vegetala

Precipitarea/indepartarea
Componentelor nedorite
(ex. cazeina, hematii)

Tesuturi,organe
animale si vegetale

Culturi
microbiene
Enzime
exocelulare

Separare lichid/solid

Organite
celulare

Tesut, organ
integral

solide

lichide

Separarea organitelor,
omogenizare partiala
si fractionare

Separare lichid/solid

solide

omogenizare

Enzime
endocelulare

lichide

omogenizare/dezintegrare celulara

Separare lichid/solid

DESEURI

lichide

solide

Indepartarea acizilor
DESEURI
nucleici
CONCENTRARE

CONDITIONARE

PRODUS

Purificare

Extracia enzimelor din sngele

mamiferelor
Ser

centrifugare

Sange total

+ ACD

20-60C

Metode de omogenizare a
microorganismelor
Exocelulare filtrare, centrifugare
Endocelulare:
sonicarea;
mojararea n prezena agenilor abrazivi perioade
lungi de timp;
agitarea n prezena perlelor de sticl;
nghe dezghe repetat;
aplicarea unor presiuni mari (French press).

 Perete cellular dur - Gradul de rupere

monitorizat prin examinare
microscopica
Prezenta acizilor nucleici
Eliberarea de enzime proteolitice

Metode de omogenizare a
esuturilor de la animale
Tesuturi proaspete
Tesuturi pastrate la 800C:
spalare cu solutie salina 1,8%
ngheare rapida n azot lichid (- 196 0C)

Omogenizarea:
Waring Blender , Potter-Elvehjem

medii extractive

esut
natura enzimei
solubilitate
localizarea celular

solubilitate
Tarie ionica mica:
ex. creatin kinaza in KCl 0,01M

Tarie ionica mare:

ex. Lipaza gastrica in KCl 1M

Medii de extracie izotonice (0,3 moliL-1):

ex. zaharoz sau manitol tamponate cu:

sau

Tris
Tris(hidroximetil)aminometan)

Hepes
(acid 4-(2-hidroxietil)-1piperazinetan sulfonic)

Cazuri dificile
Sonicare - 1 minut
Detergeni: Triton X-100, deoxicolat de
sodiu
Enzime interconvertibile: forme active si
inactive
Ex. Glicogen fosforilaza
Forma activa: pH=6,2, ATP, Mg2+, Ca2+, F Forma inactiva: AMP

Metode de omogenizare a
materialelor biologice vegetale
prezenei peretelui celulozic tare;
volumului mare ocupat de vacuole;
concentraiilor mari de pigmeni i
compui fenolici;
a concentraiilor mici de proteine;
contaminare cu acizi nucleici.

 pereti celulozici tari => omogenizare

dura

ruperea vacuolelor => proteinaze,

scderea pH ului

compui fenolici =>

HS-CH2-CH2-OH
2 mercaptoetanol

sau

azot lichid sau

compusi care inhiba
fenoloxidazele
polivinilpirolidon

 concentraii mici de proteine:

concentrare

contaminare cu acizi nucleici:

Precipitarea acizilor nucleici:
sulfat de protamin (0,2 0,4 g la 100 ml)
streptomicin (1 2 g la 100 ml )
MnCl2 (50 mM)
adiia de deoxiribonucleaz I (10 g/ml )
Precipitarea proteinelor: sulfat de amoniu (0,2 M)

Izolarea organitelor celulare

Separarea organitelor celulare prin
centrifugare difereniat
Separarea organitelor celulare prin
centrifugare izopicnic

Separarea organitelor celulare

prin centrifugare difereniat

v = viteza de sedimentare;
d = diametrul particulelor;
S = densitatea particulelor;
l = densitatea solutiei;
= viteza angulara (in radiani, s-1);
r = raza sistemului de rotatie;
FS = factor de corectie pentru interactiile
particulei si obstructionarea depunerii
= vascozitatea cinematica;
= factor geometric ce caracterizeaza
particulele (pentru particulele sferice este
egal cu 1);

Schema generala de separare a organitelor

celulare prin centrifugare diferentiata
Celule dezintegrate

Centrifugare la 600 g,
10minute

Sediment
(Nuclei)

Supernatant
(Mitocondrii, lizozomi, microzomi,
ribozomi, fractia solubila)
Centrifugare la 1000 g,
10 minute

Sediment
(Mitocondrii, lizozomi)

Supernatant
(Microzomi, ribozomi, fractia solubila)
Centrifugare la 100.000 g
3 ore

Sediment
(Microzomi, ribozomi)

Supernatant
(Fractia solubila)

enzime marker
NUCLEI: ADN nucleotidiltransferaza i
nicotinamid-nucleotid adeniltransferaza;
MITOCONDRII: succinat dehidrogenaza i
citocrom c oxidaza;
RETICUL ENDOPLASMATIC: glucozo 6fosfataza;
LIZOZOMI: fosfataza acid i ribonucleaza;
PEROXIZOMI: catalaza;
CITOSOL: glucozo 6-fosfat dehidrogenaza,
lactat dehidrogenaza i 6-fosfofructokinaza.

Separarea organitelor celulare

prin centrifugare izopicnic
centrifugare n gradient de densitate:
PERCOLL
- particule coloidale de silicagel cu
diametru: 15 30 nm
- acoperite cu polivinilpirolidona
gradiente intre 1,0 1,3 mg/ml
pH = 5,5 10

 Separarea Percollului prin centrifugare la

100.000g timp de 2 ore
Organitele raman deasupra sedimentului
Percollul imprastie lumina metode de
fluorescenta