UNIVERSITATEA DE MEDICIN

I FARMACIE DIN CRAIOVA

COALA DOCTORAL

TEZ DE DOCTORAT
Genomica accidentului vascular cerebral ischemic.
Implicaii n terapia celular.

REZUMAT

CONDUCTOR TIINIFIC
Prof. univ. dr. Mogoan Laureniu

STUDENT DOCTORAND
Cojocaru Gabriel-Radu
CRAIOVA
2012

CUPRINS

INTRODUCERE
PARTEA I - STADIUL CUNOATERII

1.Accidentul vascular cerebral ischemic-date generale

2.Fiziopatologia accidentului vascular cerebral ischemic

PARTEA II CONTRIBUII PERSONALE

3.Scopul i obiectivele lucrrii
4.Material i metode
5.Rezultate
6.Discuii
7.Concluzii

BIBLIOGRAFIE

Cuvinte cheie: accident vascular cerebral, ischemie cerebral, genomica

accidentului vascular cerebral ischemic, terapie celular

II

INTRODUCERE

Accidentul vascular cerebral (AVC) afecteaz n principal populaia vrstnic

din rile industrializate i reprezint una dintre cauzele importante de boal, pentru
care nu avem nc n practica clinic un tratament specific. Din punct de vedere al
costului social ns, accidentul vascular cerebral se situeaz pe primul loc.
Posibilitatea de nelegere a principalelor procese moleculare i biochimice ce
se succed n timpul ischemiei i induc leziuni ale creierului a crescut n ultimii ani,
dar capaciile de tratare ale pacienilor cu accident vascular cerebral sunt nc la un
nivel destul de limitat.
Lund n considerare c majoritatea accidentelor vasculare cerebrale (AVC)
afecteaz persoanele n vrst, marea majoritate a victimelor accidentului vascular
cerebral avnd peste 65 de ani i cu sanse mai mici de recuperare, studiile
experimentale axate pe accidente vasculare cerebrale, desfurate mai degrab pe
obolani vstnici dect pe modelul de obolan tnr, ar putea fi optime pentru
identificarea rspunsurilor celulare clinic relevante, precum i pentru identificarea
interveniilor benefice pentru pacientii n vrst.
Studiul i propune s urmreasc genele asociate sindromului neuropatic,
stresului, tulburrilor de anxietate i depresiei (Acvr1c, Cort, Htr2b i Pnoc). Noi
opiuni terapeutice pentru obolanii vrstnici pot include, de asemenea, Calcrl,
Cyp11b1, Prcp, Cebpa, Cfd Gpnmb, Fcgr2b, Fcgr3a, Tnfrsf26, Adam 17 i Mmp14.
O int neateptat este enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A sintetaza 1 la
obolanii vrstnici, o enzim-cheie n calea de sintez a colesterolului.
Un tratament etapizat, multimodal la animalele vrstnice ar avea o
probabiltate mai mare de a produce rezultate pozitive. O astfel de abordare
terapeutic trebuie s se concentreze asupra refacerii esutului, dar ar trebui de
asemenea s abordeze i alte aspecte ale terapiei pacientului post-AVC, cum ar fi
sindromul neuropatic, stresul, tulburrile de anxietate, depresia, neurotransmisia i
tensiunea arterial.
CAPITOLUL I - ACCIDENTUL VASCULAR CEREBRAL ISCHEMICDATE GENERALE
Accidentul vascular cerebral este definit de ctre Organizaia Mondial a
Sntii (OMS), drept "perturbarea rapid a funciei cerebrale cu semne de
dezvoltare focal (sau global), cu simptomatologie care dureaz 24 de ore sau mai
mult, sau care duce la moarte, de nici o alt cauz aparent, altele dect cele de
origine vascular". Accidentul vascular cerebral se identific nc ca o problem
major de sntate la nivel mondial. n rile industrializate, aceast problem de
sntate reprezint cauza primar de dezvoltare a unui handicap pe termen lung, i
a treia cauz de deces, primul loc fiind ocupat de ctre bolile de inim, iar locul
secund de ctre toate tipurile de cancer (Warlow et al., 2003).
Anual, la nivel mondial, accidentul vascular cerebral induce decesul unui
numr foarte mare de persoane, fiind pierdute circa cinci milioane de viei, i

III

genereaz dizabiliti severe unui numr egal de pacieni (Lopez AD et al, 2006).
Doar cinsprezece milioane de pacieni reuesc s supravieuiasc dup apariia i
dezvoltarea unui accident vasular cerebral (Lipton P et al, 1999).
Mortalitatea datorat accidentului vascular cerebral ischemic este cuprins
ntre 20-30%. Dintre pacienii care au reuit s supravieuiasc accidentului vascular
cerebral ischemic, o treime i mbuntete simptomatologia n prima sptmn,
la 40% simptomatologia rmne neschimbat, iar la 20% are loc o deteriorare
continu a funciilor cerebrale pe parcursul primei sptmni (Hankey, 2003).
CAPITOLUL II - FIZIOPATOLOGIA ACCIDENTULUI VASCULAR CEREBRAL
ISCHEMIC
Accidentul vascular cerebral este caracterizat prin debut brusc sau rapid,
reprezentnd o disfuncie neurologic acut major, de origine vascular, fiind
caracterizat de apariia simptomelor i semnelor corespunztoare ariei cerebrale ce a
suferit ntreruperea fluxului sangvin (Goldstein et al, 1989).
n general consecinele ischemiei depind de mai muli factori, n principal
acetia fiind reprezentai de ctre starea anterioar a sitemului cardiovascular, de
efectul recepionrii celulare a hipoxiei, de alimentarea cu snge n teritoriile
cerebrale i nu n ultimul rnd de viteza de instalare (Biagas K. 1999). Dei creierul
reprezint doar o mica parte (2 %), comparativ cu greutatea total a corpului,
consumul acestuia de energie este mult disproporionat, consumul de O2 atingnd un
procent important de 20 % din consumul total al organismului (Michiels C. 2004).
Fiziopatologia accidentului vascular cerebral implic, ntr-un grad mai mic sau
mai mare, o succesiune important de procese i evenimente definitorii, dintre care
amintim: ntrerupera barierei hemato-encefalice (BHE), epuizarea rezervelor celulare
energetice, niveluri crescute de calciu intracelular, toxicitate prin implicare de radicali
liberi, citotoxicitate mediat de ctre citokine, generarea de metabolii ai acidului
arahidonic, activarea sistemului complement, activarea celulelor gliale i infiltrarea cu
leucocite (Woodruff TM et al, 2011).
CAPITOLUL III - SCOPUL I OBIECTIVELE LUCRRII
Accidentul vascular cerebral este o afeciune devastatoare, care afecteaz n
special persoanele vrstnice, pentru care nu exist terapie eficient n mbuntirea
reabilitrii neurale. Un mare beneficiu clinic poate rezulta din descifrarea i intirea
mecanismelor neurobiologice eseniale care stau la baza recuperrii sistemului
nervos central (SNC) post-AVC, att din punct de vedere structural, ct i funcional.
Studiile pe animale de laborator privind AVC au identificat o varietate de intervenii cu
efecte neuroprotectoare marcate, dar cele mai multe dintre aceste abordri nu au
adus un beneficiu pacienilor umani vrstnici ce au suferit un accident vascular
cerebral, probabil pentru c astfel de terapii au fost dezvoltate pe modele de accident
vascular cerebral folosind animale tinere. ntr-adevr, studiile recente privind AVC la
animale experimentale vrstnice susin c diferenele de vrst ar putea avea o
relevan clinic important, att pentru nelegerea rspunsurilor celulare n AVC,

IV

ct i pentru identificarea interveniilor benefice (Lindner et al. 2003, Markus et al.

2005, Popa-Wagner et al. 2011). Totui, aceste studii, nu reuesc s explice n
totalitate recuperarea mai bun a obolanilor tineri, probabil pentru c au fost
investigate doar un numr mic de evenimente genetice. Progresele recente n
genomic i tehnologia ADN array ar putea genera o perspectiv cuprinztoare
asupra mecanismelor care stau la baza diferenelor dintre animalele vrstnice i cele
tinere, n ceea ce privete viteza i gradul de reparare i regenerare al creierului
dup AVC.
Numeroase studii au utilizat aceste tehnici, cu scopul de a identifica noi inte
terapeutice pentru tratamentul AVC. Unele dintre aceste studii au evideniat
modificri n transcripia diverselor gene implicate n rspunsul la stres, inflamaie,
moarte celular acut sau ntrziat la obolani tineri (Lu et al. 2003, SchmidtKastner et al. 2002), n timp ce un studiu mai recent a evideniat o cale
transcripional implicat n aprarea i repararea esuturilor cerebrale pe un model
AVC la oareci tineri (Tseveleki et al. 2010). O omisiune important a acestor studii
este c ele nu includ animalele vrstnice. Importana vrstei animalelor n rspunsul
fiziologic la accident vascular cerebral este accentuat de un studiu recent care a
identificat un transcriptom de regenerare specific vrstei care moduleaz difereniat
procesul de reorganizare a creierului dup infarct cerebral la animalele tinere
comparativ cu cele vrstnice (Li et al. 2010). Cu toate acestea, rspunsul genomic la
accident vascular cerebral, nu se limiteaz la nmugurirea axonal, dar include, de
asemenea procese fiziologice, metabolice, imunologice, apoptotice, proliferative, de
dezvoltare, angiogenez i de vindecare a plgilor, care prezint o importan egal
n reabilitarea neurologic.
n cadrul unui studiu menit s elucideze rolul unora dintre aceste procese
suplimentare, s-au utilizate array-uri ADN personalizate care conin gene implicate n
semnalizarea din hipoxie, deteriorarea ADN-ului i apoptoz, rspunsul celular la
leziuni, injurii i cretere axonal, difereniere celular, dendritogenez i
neurogenez. S-a evideniat c, desfurarea, dependent de vrst, a evenimentelor
genetice n emisfera contralateral, nedeteriorat post-accident vascular cerebral la
obolanii vrstnici, este diferit de cea observat la animalele tinere (Buga et al.
2008). Studiul actual extinde acest rezultate, profitnd de evoluiile recente din
genomica obolanului, efectund analiza ntregului genom transcriptomic al
infarctului perilezional n fazele acut i de recuperare ce succed AVC.
Mai mult, prin extragerea de date i determinarea funciei fiecrei gene, n
contextul fiziopatologic al accidentului vascular cerebral, am asociat 161 de gene,
nou identificate, cu procese implicate n accident vascular cerebral, cum ar fi cele
menionate mai sus.
CAPITOLUL IV - MATERIAL I METODE
Animalele utilizate n experiene
Au fost utilizai treizeci (30) de obolani tineri, cu vrsta cuprins ntre 3 i 4
luni i patruzeci i cinci (45) de oboani vrstnici, cu vrsta cuprins ntre 19 i 20

luni, de sex masculin, rasa Sprague-Dawley, nscui i crescui n laborator. Cele

dou grupe de vrst au fost mprite aleator n grupuri de supravieuire post-AVC
de 3 zile i 14 zile. n plus, nousprezece (19) obolani tineri (3 - 5 luni) i douzeci
i patru (24) vrstnici (18 - 20 luni) de sex masculin, rasa Sprague-Dawley, au fost
folosii ca martori. Greutatea acestora a variat ntre 290 - 360 g pentru obolanii tineri
i 520 - 600 g pentru obolanii vrstnici. obolanii au fost inui n cuti standard
(L=595mm x l=380mm x h=200mm), cte doi obolani n fiecare cuc, talajul din
interiorul cutii fiind steril, schimbat la o perioad fix de dou zile. Cutile cu animale
au fost inute ntr-un mediu controlat, la o temperatur de 22oC, umiditate 40-60% i
lumin ntre orele 07.00-19.00, animalele avnd acces liber la hran i ap.
Metode utilizate n experimente
Ocluzia reversibil a arterei cerebrale medii (OACM)
Infarctul cerebral a fost indus prin ntreruperea transcranian a fluxului de
snge prin ridicarea arterei cerebrale medii, cu un crlig de tungsten. Optsprezece
ore nainte de intervenia chirurgical, obolanii au fost privai de hran. Apa a rmas
disponibil n orice moment. Artera cerebral medie drept a fost ridicat cu un crlig
de tungsten ataat la un micromanipulator.
Extracia ARN-ului i controlul calitii ARN-ului
Dup ce esutul a fost omogenizat, ARN total a fost extras din esutul
microdisecat utiliznd reactivul TRIzol (Invitrogen life technologies, Karlsruhe,
Germania). ADN-ul genomic a fost eliminat cu ajutorul Rneasy Plus Kit (Qiagen).
ARN-ul purificat l-am folosit n etapele de cDNA arrays i RT-PCR.
Hibridizare microarray
nainte de preprocesarea probei, integritatea ARN-ului a fost evaluat cu
nanokitul ARN 6000 folosind instrumentul Bioanalyzer 2100 (Agilent, Bblingen,
Germania). Valorile de integritate ARN au variat ntre 6,5 i 8,2. 200ng din fiecare
prob au fost prelucrate cu kit de expresie a transcriptului complet (whole transcript WT) (Ambion, Darmstadt, Germania), adic a fost amplificat ARN-ul prin reverstranscripie la ADNc dublu catenar i ulterior transcripie in vitro, urmat de o nou
rund de revers-transcripie rezultnd ADN monocatenar sens. Amestecurile de
hibridizare au fost realizate dup fragmentarea i etichetarea cu biotina a ADN-ului
int conform protocolului GeneChip WT, kit de etichetare terminal (Affymetrix,
Santa Clara, CA).
Evaluarea Microarray-urilor
nalta i constanta calitate a datelor obinute din microarray a fost asigurat
prin inspecia vizual a imaginilor scanate pentru descoperirea de artefacte de

VI

hibridizare i analiza corespondenei dintre datele microarray brute i cele

normalizate. Normalizarea a fost efectuat prin metoda cuantilelor (Bolstad, 2003),
iar corecia de fond i sumarul setului de valori au fost realizate cu Robust Microarray
Average (RMA) [Irizarry, 2003].
PCR cantitativ n timp real
Pentru PCR cantitativ n timp real (qPCR), am sintetizat ADNc din fonduri mari
(n = 19-24) de ARN total utiliznd kitul de revers transcripie High-Capacity cDNA
(Applied Biosystems, USA). qPCR a fost efectuat pe o plac cu perei subiri cu 96
de godeuri de 0.1 ml (Applied Biosystems), folosind sistemul One Step Plus (Applied
Biosystems).

CAPITOLUL V - REZULTATE
Dup normalizarea datelor brute i sumarul setului de probe, am utilizat
metodologia empiric Baysian pentru a analiza valorile de expresie ale celor 28.826
seturi de transcripie privind expresia diferenial ntre probele post-AVC de la
obolani tineri i vrstnici i controalele lor respective. Aceasta a evideniat un total
de 1658 gene exprimate difereniat cu un coeficient de multiplicare de minim doi
(supra/subexprimare) a ratei de transcripie. Intensitile seturilor de gene exprimate
difereniat din toate probele au fost grupate ierarhic aglomerativ (GIA), iar rezultatele
au fost afiate ca un heat-map.
CAPITOLUL VI - DISCUII
n general, modelul de expresie genic sugereaz puternic c rspunsul
creierului de obolan vrstnic este calitativ, mai degrab dect cantitativ, diferit fa
de obolanul tnr, i anume numrul total de gene reglate este comparabil ntre
cele dou grupe de vrst, dar obolanii vrstnici au avut mari dificulti n montarea
unui rspuns la AVC n timp util.
CAPITOLUL VII - CONCLUZII
n acest lucrare am realizat o analiz transcriptomic la nivelul ntregului genom a
expresiei genelor post-AVC, la animalele tinere i vrstnice identificnd 161 de gene
noi, care sunt de interes pentru cercetarea AVC, precum i unele care pot fi inte
pentru dezvoltarea de noi terapii n AVC.
Prin transcriptomic comparativ, am identificat 26 de noi obiective terapeutice care
pot ajuta la stabilizarea organismelor vrstnice imediat dup AVC i la facilitarea
recuperrii comportamentale i a esuturilor dup 2 sptmni post-AVC.
Am demonstrat c dendogramele de expresie genic ale obolanilor naivi sunt clar
delimitate fa de cele ale obolanilor post-AVC.

VII

Rezultate studiului sprijin noiunea de rspuns activ n AVC dup 3 zile, la obolanii
tineri, echilibrat de un efect inhibitor asupra unui numr aproximativ similar de gene
(circa 1.400), care se degradeaz n timp, astfel nct, n ziua 14 pot fi observate
preponderent nivele sczute de ARNm.
Cele mai multe dintre modificrile observate sunt rspunsuri active, o privire de
ansamblu asupra expresiei genice sugereaz existena unui anumit grup de gene cu
expresie crescut (comparativ cu animalele naive) la 3 zile dup AVC, precum i cu
expresie redus mai trziu (14 zile). Acest grup de gene sunt direct implicate n
procesele ce cuprind vindecarea rnilor i formarea de esut cicatricial, precum i
angiogeneza i remodelarea vascular.
Am identificat la animalele vrstnice mai multe schimbri unice n expresia genic n
emisfera lezat: (i) o cretere important a numrului de gene tardiv supraexprimate
i o cretere substanial a numrului de gene persistent supraexprimate; (ii) o
cretere a numrului de gene persistent subexprimate. Creierul afieaz un rspuns
ntrziat la leziune la animalele btrne comparativ cu animalele tinere, argumet
susinut de numrul de gene subexprimate n faza tardiv a rspunsului la AVC, i
anume la 14 zile dup accident.
Avnd n vedere constatrile noastre cum c AVC are impact asupra unei game largi
de sisteme ntr-un mod dependent de vrst, de la fiziologia SNC la regenerarea i
plasticitatea SNC, i cunoscnd faptul c pn n prezent, toate ncercrile, prin
monoterapie, de a preveni sau diminua leziuni ale creierului n urma unui accident
vascular cerebral au euat, considerm ca ineficiente terapiile care vizeaz un singur
sistem int.
Rezultatele obtinute sugereaz c un tratament etapizat, multimodal la animale
vrstnice are o probabilate mai mare de a produce rezultate pozitive. O astfel de
abordare terapeutic trebuie s se concentreze asupra refacerii tisulare, dar ar trebui
s abordeze, de asemenea, alte aspecte ale terapiei pacientului post-AVC, cum ar fi
sindromul neuropatic, stresul, tulburrile de anxietate, depresia, neurotransmisia i
tensiunea arterial.
BIBLIOGRAFIE
1.

2.

3.

4.
5.

Biagas K. Hypoxic-ischemic brain injury: advancements in the understanding of

mechanisms and potential avenues for therapy. (1999) Curr Opin Pediatr.
Jun;11(3):223-238
Buga AM, Sascau M, Pisoschi C, Herndon JG, Kessler C and Popa-Wagner A (2008)
The genomic response of the ipsilateral and contralateral cortex to stroke in aged
rats. J Cell Mol Med 12:2731-2753.
Goldstein, M. , Barnett, H. J. M. , Orgogozo, J. M. , Sartorius, N. , Symon, L. , &
Vereshchagin, N. V. (1989). Stroke1989: Recommendations on stroke prevention,
diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other
Cerebrovascular Disorders. Stroke, 20 (10):14071431.
Hankey GJ. (2003) Long-term outcome after ischaemic stroke/transient ischaemic
attack. Cerebrovasc Dis.;16 Suppl 1:14-149
Li F, Ravetch JV (2011) Inhibitory Fc receptor engagement drives adjuvant and antitumor activities of agonistic CD40 antibodies. Science 333:1030-1034.

VIII

6.

7.
8.

9.

10.

11.
12.
13.

14.

15.
16.

Lindner MD, Gribkoff VK, Donlan NA and Jones TA (2003) Long-lasting functional
disabilities in middle-aged rats with small cerebral infarcts. J Neurosci 23:1091310922
Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons, (1999),Physiol Rev 79: 1431-1568.
Lopez AD, Mathers CD, Ezzati M, Jamison DT, Murray CJ. (2006) Global and
regional burden of disease and risk factors, 2001: systematic analysis of population
health data.Lancet. May 27;367(9524):1747-1757.
Lu A, Tang Y, Ran R, Clark JF, Aronow BJ and Sharp FR (2003) Genomics of the
periinfarction cortex after focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 23:786810.
Markus TM, Tsai SY, Bollnow MR, Farrer RG, O'Brien TE, Kindler-Baumann DR,
Rausch M, Rudin M, Wiessner C, Mir AK, Schwab ME and Kartje GL (2005)
Recovery and brain reorganization after stroke in adult and aged rats. Ann Neurol
58:950-953.
Michiels C.Physiological and pathological responses to hypoxia (2004). Am J Pathol.
Jun;164(6):1875-1882
Popa-Wagner A, Buga AM and Kokaia Z (2011) Perturbed cellular response to brain
injury during aging. Ageing Res Rev 10:71-79.
Schmidt-Kastner R, Zhang B, Belayev L, Khoutorova L, Amin R, Busto R and
Ginsberg MD (2002) DNA microarray analysis of cortical gene expression during
early recirculation after focal brain ischemia in rat. Brain Res Mol Brain Res 108:8193.
Tseveleki V, Rubio R, Vamvakas SS, White J, Taoufik E, Petit E, Quackenbush J and
Probert L (2010) Comparative gene expression analysis in mouse models for multiple
sclerosis, Alzheimer's disease and stroke for identifying commonly regulated and
disease-specific gene changes. Genomics 96:82-91
Warlow C, Sudlow C, Dennis M, Wardlaw J, Sandercock P. Lancet. (2003)
Stroke.;362(9391):1211-1224
Woodruff TM, Thundyil J, Tang SC, Sobey CG, Taylor SM, Arumugam TV. (2011)
Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic
stroke.Mol Neurodegener.;6(1):11

IX