POLIMORFISMUL RAPD-PCR LA PLANTELE DE

CUCUMIS SATIVUS L.
Duca Maria, Port Angela, Homenco Tatiana
Universitatea de Stat din Moldova
Introducere
Identicarea polimorsmului genetic n scopul aprecierii diversitii genetice,
selectrii formelor parentale i a caracterelor calitative i cantitative prezint o importan
deosebit n procesul de obinere a hibrizilor nalt productivi. Polimorsmul poate
identi? cat la diverse nivele de organizare prin analiza caracterelor morfo ziologice [4,
18, 19], biochimice [11, 12], citogenetice [5, 6, 9], moleculare [7, 10, 12, 13] etc. In
aspect fundamental, cercetarea variabilitii caracterelor ce determin polimorsmul
poate contribui la identicarea marcherilor genetico-moleculari utilizai n analiza
genetic i logenetic [16, 17]. n aspect practic, analiza polimorsmului genetic este
primordial pentru rezolvarea problemelor de conservare a biodiversitii [10, 15],
ameliorarea la heterozis asistat de marcheri moleculari [11, 13, 15], etc.
Fenomenul de heterozis este larg rspndit n natur i rmne a n continuare
una dintre cele mai actuale probleme ale geneticii i ameliorrii contemporane. Succesul
seleciei la heterozis este determinat de identicarea i studierea nsuirilor valoroase,
inclusiv analiza polimorsmului i evidenierea caracterelor complexe [1, 2, 8, 11].
Scopul lucrrii const n relevarea unor particulariti genetice specice prin
analiza polimorsmului RAPD-PCR la diverse genotipuri de castravei - linii, soiuri i
hibrizi F1 cu diferit productivitate i corelarea acestora cu vigoarea hibrid i efectul
de heterozis.
Material i metode
Investigaiile au fost efectuate pe parcursul anilor 2003-2007 n cadrul
laboratorului Securitate biologic al catedrei Biologie Vegetal, USM. Materialul de
cercetare - ase hibrizi de castravei (Cucumis sativus L.) i formele parentale ale acestora
a fost oferit de Institutul de legumicultur i irigaie din Tiraspol (tab.1.). Experienele
s-au efectuat n trei repetri biologice i au inclus genotipuri care formeaz o schem
dialel incomplet.
Tabelul 1. Liniile parentale i hibrizii de castravei utilizai n cercetare.

Forma
parental

Hibrizi cu productivitate
nalt

Varianta martor

Hibrizi cu productivitate
joas

H 273

H 274

Vzglead

Epilog

H6

H7

L 222

L 203

L 371

L 371

L 222

L 222

L 203

L 316

Beregovoi

Favorit

Beregovoi

Favorit

ADN-ul a fost izolat cu DNAzol (GIBCO BRL) i cuanticat spectrofotometrtic

[3]. Mediul de reacie PCR (25l) a inclus: 50 ng ADN, dNTP 200M de ecare tip,
primer 1 M, 1,25 uniti/pe reacie GoTaq ADN-polimeraza (Promega), MgCl2 2,5
mM. Programul de ampli care: 95?C - 3 min urmat de 45 cicluri: 95?C 1 min., 36?C 1

81

min., 72C 2 min. i 72C 5 min. Ampliconii s-au analizat prin electroforez n gel de
agaroz 1,6%, bromur de etidiu 0,5 g/ml i au fost notai conform primerului asociat
cu dimensiunea ampliconului, de ex.: P36800 amplicon de 800 pb obinut n reacia PCR
cu P36. Au fost utilizai opt primeri: P28 (GACCGCTTGT), P36 (CCGAATTCGC),
P37 (CTGACCAGCC), P43 (AGTCAGCTGC), P44 (GGACCCCGCC), P46
(GGTTGGGGAG), P48 (GCGGTGCTCG), P49 (GACAGCCTA).
Rezultate
Relevarea organizrii genetice a organismului n baza analizei ADN-ului ca unitate
structural a genei, evitnd ncruciarea i aciuni ndelungate de testri n cmp, rmne
a una dintre direciile de perspectiv n ameliorarea plantelor. Aceste argumente au
motivat o serie de analize RAPD-PCR cu utilizarea a opt primeri arbitrari.
Toi primerii testai au participat la amplicare, rezultnd un numr variabil de
ampliconi. Primerii P43, P46, P48, P49 au generat pro luri cu cate 1- 4 benzi comune
pentru toate genotipurile homo- i heterozigote studiate: P43470; P46500; P46290; P46180;
P48480; P48290; P48150; P49920; P49800; P49750; P49600 ( g. 1. A; B; C; D), rezultate care
ne-au determinat s le excludem din analizele ulterioare.

Fig. 1. Prolul ampliconilor RAPD obinui cu primerii: P43 (A),

P46 (B), P48 (C), P49 (D).
M-martor; 1- L216; 2- H 274; 3- /L203; 4-L 222; 5- Beregovoi; 6- Vzglead;
7- L 371; 8- Epilog; 9- Favorit; 10 - L22; 11- H 6; 12- H 7.

Analiza polimorsmului genetic la hibrizii cu productivitate nalt. PCR -RAPD

obinut cu P28, P36, P37 i P44 a pus n eviden spectre electroforetice heterogene
att dup dimensiunea ampliconilor, ct i dup intensitatea uorescenei, sugernd
cantiti diferite ale produsului de amplicare.
Astfel, prolul hibrizilor experimentali cu productivitate nalt obinut cu primerul
P28 a prezentat 12 ampliconi cu dimensiuni de la130 pn la 830 pb (g. 2). Genotipurile
formelor parentale ale hibrizilor H 274 i H 273 conin trei ampliconi comuni: P28480,
P28500 i P28600, ultimii doi variind dup intensitatea uorescenei n funcie de genotip.
Restul 9 produse de ampli? care cu acest primer au prezentat un polimor sm estimat
prin prezen/absen i inclusiv - luminozitate. Liniile, homozigote patern i matern,
ale hibridului H 274 s-au caracterizat prin dou (P28130; P28270) i respectiv una (P28300)
benzi polimorfe, toate trei ind cu uorescen slab. Linia patern a hibridului 273
este similar liniei materne a hibridului H 274 (L 203). Cealalt linie parental a acestui
hibrid L 222, conine dou benzi polimorfe dintre care una similar dup dimensiune
cu linia patern a hibridului H 274 (P28270) i una cu greutate molecular medie de 700
pb ( g. 2).

82

Hibrizii H 274 i H 273 conin ase i respectiv 4 locusuri polimorfe. Studiul

polimorsmului molecular prin intermediul secvenelor de ADN amplicate arbitrar cu
primerul P36 a relevat prezena a 7 fragmente cu lungimea de 450-950 pb (g. 2).
Diversitatea genetic n cadrul hibrizilor omologai i formelor parentale.
Analiza RAPD a hibridului H 274 i a formelor parentale a constatat ase benzi
cu masa molecular cuprins ntre 550-850 pb. Similar primerului analizat P28, trei
ampliconi cu aceeai greutate molecular, ns diferii dup coninut au fost comuni
pentru formele homo- i heterozigote. Forma parental 203 comun ambelor combinaii
de ncruciare nu conine ampliconi specici. Celelalte dou forme parentale ale hibrizilor analizai se deosebesc ntre ele att prin numrul benzilor polimorfe, ct i dup intensitatea uorescenei. Linia patern a hibridului H 274 conine dou benzi polimorfe
P36800 i P36900, iar cea matern a hibridului H 273 o singur fracie P36900 .
Primerul 37 a generat prole cu ase secvene polinucleotidice dintre care
dou comune pentru toate genotipurile studiate: P37280 i P371300. Aceti ampliconi se
deosebesc ntre ei dup coninut. P37280 s-a remarcat printr-o uorescen mai intens
comparativ cu ampliconul cu greutate molecular mare - P371300. Majoritatea benzilor
polimorfe au fost de o intensitate medie a luminozitii (g. 2). Linia 203 s-a evideniat
printr-o singur band polimorf (P37480) care este motenit i de hibridul H 274. Linia
patern a acestui hibrid conine doi ampliconi specici P37560, i P37900 care de asemenea
sunt regsii n prolul genotipului heterozigot. H 274 se deosebete de ambele linii
parentale prin prezena produsului de amplicare P37600. Electroforegramele hibridului
273 i formelor parentale au pus n eviden cinci benzi cu masa molecular cuprins
ntre 280-1300 pb. Forma matern se deosebete de cea patern prin prezena a dou
benzi polimorfe cu greutate molecular medie: P37560 i P37900 cu o intensitate slab a
luminozitii (g. 2).
Spectrele electroforetice obinute cu primerul P44 au prezentat un polimor sm
mai pronunat determinat att de genotip (homo- sau heterozigot), ct i de modul
de asociere n combinaii de ncruciare. Acest primer a generat 12 componeni
polinucleotidici cu dimensiuni de 100 - 1000 pb variabili n coninut (g.2). Prolele
RAPD ale primerului P44 au demonstrat trei produi de amplicare comuni pentru
formele parentale i hibrizii de prima generaie - P44100, P44250 i P44650. Linia patern
are dou benzi polimorfe cu dimensiunea de 200 i 500 pb. Linia matern este mai
heterogen, prezentnd patru benzi polimorfe dintre care banda de 330 pb n lungime
este specic, lipsind la forma patern i la hibrid. Linia matern a hibridului H 273
de asemenea conine patru benzi polimorfe, ns nici una dintre ele nu este specic.
Toate secvenele sunt prezente i n genotipul homozigot patern (P44200, P44500 ) sau in
cel heterozigot (P44380, P44400 ).
Analiza comparativ a spectrelor electroforetice a hibrizilor omologai
Vzglead i Epilog, inclusiv a formelor parentale ale acestora demonstreaz, c produsele
de ampli care a ADN-ului cu primerul P28 s-au se parat n ase i respectiv apte
componeni electroforetici, dintre care patru au fost polimor. Lungimea fragmentelor
de amplicare a fost cuprins n limitele 270-730 pb (g. 3).

83

Fig. 2. Pro lul electroforetic RAPD generat de primerii P28, P36, P37, P44 la hibrizii
nalt productivi i formele parentale.
M-martor; 1 - L216; 2 -H 274; 3 -L203; 4 -H 273; 5 -L222.

Ampliconii P28480; P28500 i P28600 comuni pentru genotipurile hibrizilor cu

productivitate nalt sunt prezeni i la aceste genotipuri heterozigote i homozigote, care
de asemenea variaz dup intensitatea luminozitii benzilor n cadrul unei combinaii
de ncruciare. n aspect comparativ formele parentale ale hibrizilor omologai se
deosebesc de cele ale hibrizilor H 274 i H 273 prin faptul, c toi aceti ampliconi sunt
de o intensitate mai mare a luminozitii la ambii hibrizi. Forma matern a hibrizilor
nu conine benzi specice spre deosebire de formele paterne care prezint un amplicon
P28270 n cazul soiului Beregovoi i doi ampliconi P28700 i P28730 in cazul soiului
Epilog (g.3). Genotipul heterozigot Vzglead conine trei benzi polimorfe dintre care
P28270 prezent i la forma patern i doi ampliconi P28310 i P28700 care lipsesc la liniile
parentale. Hibridul Epilog are un pro l similar cu cel al F1 Vzglead. Acesta nu conine
ampliconul P28730 prezent la linia patern.
Primerul arbitrar P36 a produs 5 ampliconi: trei comuni i patru polimor cu
masa molecular cuprins ntre 450 - 950 bp (g. 3). La nivelul spectrelor electroforetice
ale liniilor parentale ale hibridului Epilog nu au fost relevate deosebiri calitative. ns,

84

spre deosebire de hibridul Vzglead, hibridul Epilog a motenit toi componenii de la

prini.

Fig. 3. Pro lul electroforetic RAPD generat de primerii P28, P36, P37, P44 la hibrizii
omologai i formele parentale.
M-martor; 1- Beregovoi; 2- Vzglead; 3-L 371; 4-Epilog; 5- Favorit.

Genotipurile studiate cu primerul P37 au fost caracterizate prin 5 locusuri,

ampliconii incluzndu-se n limita de valori ale greutii moleculare 280-1300
pb. Spectrele RAPD ale ambelor combinaii de ncruciare au constatat dou benzi
nespecice de 280 i1300 pb i trei benzi polimorfe P37480, P37560 i P37 900 ( g. 3).
Paternele ampliconilor ale hibrizilor sunt asemntoare, cu excepia faptului, c
F1 Vzglead conine P37900 iar hibridul Epilog - P37560 care lipsesc la prini. ADN-ul
acestor dou familii amplicat cu primerul P44 a prezentat apte benzi. Spre deosebire
de formele parentale a hibrizilor experimentali cu productivitate nalt, n prolul
obinut cu acest primer s-au depistat 5 benzi comune formelor homo- i heterozigote,
inclusiv ampliconul P44500 care a prezentat polimorsm de prezen/absena la primele
combinaii de ncruciare analizate (g. 3).

85

Analiza polimorsmului genetic la hibrizii cu productivitate joas

Spectrele RAPD la hibrizii H 6 i H 7 i la formele lor parentale cu primerul
P28 a stabilit prezena diferenelor calitative i cantitative. Genotipul matern comun
ambilor hibrizi s-a caracterizat prin doi ampliconi polimor : P28270 i P28700. Formele
paterne se deosebesc de cea matern prin lipsa fraciilor P28700 in cazul hibridului H 6
i lipsa P28270 corelat cu prezena ampliconului P28730 in cazul hibridului H 7 ( g. 4).

Fig. 4 . Pro lul electroforetic RAPD generat de primerii P28, P36, P37, P44 la hibrizii cu
productivitate sczut i formele parentale.
M-martor; 1- Beregovoi; 2- H6; 3-L 222; 4-H 7; 5- Favorit.

Hibrizii H 6 i H 7 se caracterizeaz prin prezena a trei i doi ampliconi polimor.

O particularitate distinctiv n acest caz este faptul c P28270 este prezent la formele
parentale ale H 6 iar P28700 - la cele ale hibridului H 7. Hibrizii se deosebesc intre ei la
nivelul ampliconului cu dimensiunea de 310 pb care este prezent la H6 i lipsete la H7,
inclusiv i variaii cantitative ale ampliconilor nespecici.
Paternele ampliconilor obinute prin amplicarea cu primerul P36 sunt
caracterizate prin prezena a trei benzi nespecice prezente la toate genotipurile
analizate indiferent de combinaia de ncruciare, o band polimorf la hibridul H6 cu
dimensiunea de 900 pb, care de altfel se conine i la linia matern i un amplicon specic

86

P36450 n cazul hibridului H 7 (g. 4). La nivelul spectrelor obinute cu primerul P37
s-a constatat prezena a dou benzi nespecice i trei secvene de ADN polimorfe de
480 pb, 560 i 900 pb (g.4). Analiza hibrizilor H 6 i H 7 reprezint similaritate la
nivel tuturor produselor de ampli care, insumand ampliconii de la formele parentale.
Pro lul RAPD generat de primerul 44 a demonstrat aceeai heterogenitate comparativ
cu ceilali primeri, observat la analiza hibrizilor cu productivitate nalt (g. 4).
Generaliznd rezultatele obinute putem constata, c nivelul polimorsmului
difer de la un genotip la altul, cel mai nalt grad al diversitii genetice a fost nregistrat
la hibrizii cu un heterozis superior, iar cel mai mic la hibrizii cu productivitate sczut
n special la H 7. Tabloul general al analizei RAPD (tab. 2) a evideniat un numr mai
mic i aproape constant (n aproximativ 50% din cazuri) de benzi la linia matern n
comparaie cea patern i n special n raport cu F1. Cea mai mare heterogenitate s-a
constatat la hibrizii de prima generaie, unde numrul de benzi a variat ntre 5 i 9
produse de amplicare. Mai informativi au fost primerii P28 i P44.
Tabelul 2. Numrul benzilor generate de primeri analizai prin RAPD-PCR.
Hibrizi cu:
efect de heterozis superior

F1

productivitate nalt,
omologai

productivitate sczut

H 274

H 273

Vzglead

Epilog

H6

H7

P28

P36

P37

P44

P28

P36

P37

P44

P28

P36

P37

P44

Concluzii
Analiza spectrelor electroforetice ale ampliconilor RAPD-PCR la 12 genotipuri
de castravei cu opt primeri arbitrari a permis s constatm o heterogenitate nalt a
materialului ameliorativ, care reect structura genotipic a liniilor i hibrizilor inclui
in cercetare.
Patru primeri au pus n eviden 1-4 ampliconi identici pentru toate genotipurile,
iar ali patru au evideniat un nalt grad de polimorsm. Cel mai nalt grad al diversitii
genetice a fost relevat la H 273, iar cel mai mic la H 7. Cel mai inalt polimor sm
molecular a fost relevat la analiza RAPD-PCR cu primerii P28 i P44.

87

Referine
1. Goral H. Heterosis and Combining Ability in Spring Triticale (x Triticosecale, Wittm.). Plant
Breed. Seed Sci., 1999, vol. 43, p. 25-34.
2. Lopez-sese A.I., Staub J.E., Gomez-guillamon M.L. Combining ability analysis of yield
components in cucumber. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 2002, vol. 127, p. 931-937.
3. Sambrook J., Russel D.W. Molecular cloning: a laboratory manual, V. II, New-York, 2001.
4. Smith O.S., Smith J.S.C., Bowen S.L., Tenborg R.A., Wall S.J. Similarities among a group of
elite maize inbreds as measured by pedigree, F1 grain yield, grain yield, heterosis, and RFLPs. Theor. Appl.
Genet., 1990, vol. 80, p. 833-840.
5. Staub J.E., Sun Z., Chung S.M., Lower R.L. Evidence for colinearity among genetic linkage
maps in cucumber. HortScience, 2007, vol. 42, p. 20-27.
6. Wilde P. Multi-stage selection for combining ability among pollen parent lines in hybrid rye
breeding. Vortr. P anzenzuchtg, 1996, vol. 35, p. 15-25.
7. Witkowicz J., Urbaczyk E., Przybecki Z. AFLP marker polymorphism in cucumber (Cucumis
sativus L.) near isogenic lines differing in sex expression. Cellular & Molecular Biology Letters, 2003,
vol. 8, Nr. 2, p. 375-381.
8. .., .. ()-
. . ., 1986, . 33, . 4, . 769-777.
9. .., .., ..
.
i i. . i. , 1997, 3, . 37-40.
10. .
: . . - .-. : . ., 2002, 33.
11. .. . . . .-.
.. . ., , 1983, 320.
12. .. . .: , ,
1982, . 163-177.
13. .. -
. , 1984, . 9, . 99-104.
14. .
// ., . . .. . : 2001.c. 128-133.
15. .., .., .. .. :
. . ., . . . .-. .
., 1997, . 211.
16. . . : .
. ., 1974, . 35, 5, c.666-678.
17. .. .
, 1986, . 22, 2, c.229-242.
18. .., ..
. , 1994, . 41, 1, . 92-96.
19. .. . ., 1972, 32c.
Cercetarile au fost efectuate cu suportul nanciar oferit de Moldavian esearch and Development
Association (MRDA) i U.S. Civilian Research & Development Foundation (CRDF) prin grantul
MERL-1300``.

88