www.referat.

ro

Determinarea activitii antioxidante a

extractului de ceai verde
Ceaiul verde reprezint frunzele de Camelia sinensis. Acestea nu sunt lsate s
fermenteze i sunt imediat uscate, fiind numit i ceai nefermentat i ceai virgin.
Recent a fost dezvoltat un unguent pe baza extractului de ceai verde, care
acioneaz mpotriva leziunilor HPV genitale i anale. Acestea sunt datorate aciunii
HPV (human papilomavirus), un agent rezistent la majoritatea tratamentelor, cu excepia
unor tehnici chirurgicale complicate.
OH

HO

OH

OH
OH
Figura 1. Structura catechinei
Efectul inhibitor este datorat catechinelor din compoziia extractului vegetal care
au un puternic efect antioxidant i antioxidant.
n general este cunoscut ca a avea efecte antioxidante puternice mpotriva
radicalilor liberi. Este cel mai vechi i mai utilizat n tratamentele naturiste de prevenire a
apariiei tumorilor canceroase. De asmenea extractul de ceai verde se utilizeaz pentru a
preveni atacurile cardiovasculare i la scderea colesterolului.
Se gsete sub form de pliculee cel mai frecvent. n farmaciile de specialitate
se gsete i sub form de pastile sau ncoporat n diferite creme i unguente.

Materiale necesare: balan analitic, tvie de cntrire, spatul, pahar

Berzelius, eprubete, stativ, pipete de sticl, spectrofotometru, rotavapor, ceai verde uscat,
etanol., 2,2 Difenil 1 picrilhidrazil (DPPH).
Mod de lucru:
1. Obinerea extractului vegetal
100 g produs vegetal (ceai verde) uscat se pun ntr-o sticl cu dop. Se toarn peste
200 de ml de metanol. Se las dou zile, dup care se ndeprteaz materialul vegetal prin
centrifugare la 10.000 rpm timp de 10 minute, ntr-o centrifug EBA 32R cu rcire.
Lichidul rezultat se concentreaz ntr-un rotavapor Buchi pn la 50%, la 40 0C, 150 rpm
i 150 mbar. Produsului concentrat i se determin activitatea antioxidant total i
coninutul n fenoli.
2. Determinarea activitii antioxidante totale
Activitatea antioxidant total a fost evaluat prin metoda spectrofotometric
indirect care utilizeaz 2,2 difenil 1 picrilhidrazil (DPPH) ca sistem de generare a
radicalului liber stabil DPPH
. Amestecul de reacie conine urmtoarele:
Soluii
Prob
Etanol 80%
Vitamina

Prob
50 l
-

E/Trolox
DPPH 0,04% 5 ml

Martor
50 l
-

Standard
50 l

5 ml

5 ml

n etanol
Amestecurile se las timp de 30 de minute i se va msura absorbana la 517 nm,
fa de etanol. Astfel, concentraia radicalilor DPPH a fost calculat prin utilizarea
urmtoarei formule de calcul:

A0 A1
A0
Activitate antioxidant total (%) =
100, unde:
A0 absorbana martorului
A1 absorbana probei
2. Determinarea coninutului fenolic total
Determinarea s-a reaclizat cu reactiv Folin Ciocalteau utiliznd acidul galic ca
standard. Amestecul de reacie este format din 1 ml extract vegetal diluat n 46 ml ap
distilat. Se mai adaug 1 ml reactiv Folin Ciocalteau, iar dup 3 minute aproximativ 3
ml carbonat de Na 2%. Amestecul se las 2 ore, agitnd periodic Se citete absorbana la
760 nm. Concentraia total de fenoli se exprim n mg/g de extract uscat. Concentraia
componenilor fenolici totali din extract se determin ca g de acid galic utiliznd ecuaia
obinut de la curba standard de acid galic:
Absorbana = 0,0008 acid galic (g).
n funcie de materialul vegetal supus extraciei i de rezultatele ce se urmresc a
se obine, se mai pot efectua urmtoarele analize:
a. Determinarea puterii de reducere. Se fac diluii ale extractului n eprubete diferite cu
ap ultrapur i se analizeaz fiecare diluie n parte. Amestecul va conine:
- 1 ml diluie;
- 2,5 ml tampon fosfat 0,2M, pH 6,6;
- 2,5 ml fericianur de potasiu 1%.
Amestecul se introduce la 500C, timp de 20 de minute. Peste amestec se adaug
2,5 ml acid tricloracetic 10% i se centrifugheaz la 1000 rpm 10 minute.
ntr-o eprubet curat se pun 2,5 ml supernatant, 2,5 ml ap distilat i 1 ml FeCl 3
1%. Se msoar absorbana la 700 nm. Creterea absorbanei odat cu creterea
concentraiei extractului este direct proporional cu creterea puterii reductoare. Articol
descifrat formulas

b. Determinarea activitii de legare a radicalului hidroxil. Se realizeaz o serie de

eprubete ce vor conine extract vegetal de diferite concentraii. Amestecul de reacie are
urmtorul coninut:
-

0,1 ml EDTA 1mM;

0,01 ml FeCl3 10 mM;

0,1 ml H2O2 10 mM;

0,36 ml deoxiriboz 10 mM;

1 ml extract vegetal dizolvat n ap ultrapur;

0,33 ml tampon fosfat 50 mM, pH 7,4;

0,1 ml acid ascorbic 1 mM.

COOH

HO

OH
OH

Figura 2. Structura chimic a acidului galic

Amestecul a fost introdus ntr-un termostat la 370C, timp de 1 or. n alte eprubete
notate la fel se adaug:
-

1 ml amestec iniial;

1 ml TCA 10%;

1 ml acid tiobarbituric (TBA) 0,5%.

n paralel se face i o prob martor n care se utilizeaz un compus ca martor (acid

galic). Se msoar absorbana amestecului la = 532 nm. Capacitatea de legare a

radicalului hidroxil (% OH-) se calculeaz dup formula:

AMartor APr ob
AMartor
% OH- =
100, unde:
AMartor absorbana reaciei martor
AProb absorbana probei ce conine extractul vegetal
c. Determinarea activitii de legare a radicalului oxid nitric. Metoda se bazeaz pe
generarea oxidului nitric din nitroprusidul de Na n soluie i care au fost msurai prin
utilizarea reaciei Griess.

2-

O
N

N
C

2Na +

N
C

Fe
C

C
N

Figura 3. Structura chimic a nitroprusidului de Na

Se pregtesc o serie de eprubete cu diferite concentraii ale extractului vegetal. n
paralel se face i o prob martor n care se utilizeaz un compus ca prob martor (butilat
hidroxi-toluenul). Amestecul de reacie este format din:
-

3 ml mitroprisid de Na 10 nM n tampon fosfat

2 ml prob extract vegetal.

Se prepar un martor, care are n locul extractului vegetal, metanolul sau etanolul,

n funcie de solventul cu care se efectueaz extracia. Amestecul rezultat se incubeaz

timp de or, n baie de ap la temperatura de 25 0C. ntre timp se pregtete reactivul
Greiss, care conine:
-

1% sulfanilamid

0,1% N-l-naftiletilen-diamin-dihidroclorid de sodiu n 2% H3PO4.

ntr-un alt set de eprubete notate identic se adaug urmtoarele:

5 ml soluie ce conine extract vegetal

5 ml reactiv Griess.
Se msoar absorbana fiecrei eprubete la 546 nm, fa de metanol. Calcularea

activitii de legare a radicalului oxid nitric se face dup urmtoarea formul:

AMartor APr ob
AMartor
% NO =
100, unde:
AMartor absorbana reaciei martor
AProb absorbana probei ce conine extractul vegetal.
d. Determinarea activitii de legare a anionului superoxid. Radicalii super oxid sunt
generai prin oxidarea NADH i determinai prin reducerea nitro blue tetrazoliu (NBT).
Pentru determinarea se procedeaz conform tabelului urmtor:
Soluie
Tampon Tris HCl 3 ml

Prob

Martor
3 ml

(16 mM, pH 8)
NBT 50 M
NADH 78 M
Extract vegetal

1 ml
1 ml
3 ml

1 ml
1 ml
-

(50 300 g/ml)

Acid ascorbic

3 ml

(50 300 g/ml)

Fenazin metosulfat 1 ml

1 ml

10 M
Amestecurile se realizeaz n 2 eprubete care se vor introduce n etuv timp de 5
minute la 2500C. Se va citi absorbana martorului i a probei fa de blanc
(realizat .........). Inhibarea generrii anionului superoxid se calculeaz conform formulei:

AMartor APr ob
AMartor
% SOD =
100, unde:
AMartor absorbana reaciei martor
AProb absorbana probei ce conine extractul vegetal.
e. Determinarea activitii de legare a radicalului H2O2.
Metoda se bazeaz pe capacitatea extractului vegetal de a lega radicalii H 2O2. Se prepar
n eprubete diferite probe de extract vegetal n ap distilat i cu o concentraie diferit.
Se adaug 0,6 ml H2O2 40 mM. Se prepar un martor n tampon fosfat pH7,4, la care se
adaug 0,6 ml H2O2 40 mM. Amestecurile se fac n eprubete care se pstreaz 10 minute
la temperatura camerei.
Se citete absorbana la 230 nm fa de tampon fosfat pH 7,4. Capacitatea de
legare a H2O2 se calculeaz conform formulei:

AMartor APr ob
AMartor
% H2O2 =
100, unde:
AMartor absorbana reaciei martor
AProb absorbana probei ce conine extractul vegetal.

Powered by http://www.referat.ro/
cel mai tare site cu referate