www.arh.pub.ro/cravariu/Biodispozitive.

doc

Partea I

Capitolul X. BIODISPOZITIVE I BIOSENZORI

10.1. Introducere 10.1.1. Introducere n domeniul bio-engineering

ntr-o prim etap dorim s subliniem importana domeniului bioingineresc, n contextul actual. Vom porni de la cteva motive de ordin social i economic. Se tie c populaia globului este n cretere numeric. n diverse rapoarte sociologice se specific o cretere a mediei de vrst. n Europa, se prognozeaz c pn n anul 2020 peste 30% din populaie va avea o vrst mai mare de 60 de ani, n timp ce procentul persoanelor cu handicap va tinde spre 20%, [66]. Este de la sine neles c rata bolilor cronice va fi n continu cretere. n schimb, numrul limitat de medici nu va mai putea satisface o cerere att de numeroas. Serviciile de sntate public au reacionat la acest fapt. n cadrul unui program de sntate public internaional [66, 67], s-au lansat trei direcii principale de lucru n urmtorii zece ani: (1) sporirea accesului individual la actul medical decizional, prin intermediul telemedicinei i internetului. Pacientul se poate informa despre boala sa, se autourmrete n timpul tratamentului (cu ajutorul unor biodispozitive, biosenzori) i poate fi monitorizat de la distan de ctre medic. (2) creterea rolului geneticii n depistarea precoce, prevenirea i corectarea unor boli. (3) Electronic healthcare sau orientarea noilor tehnologii electronice micro i nano spre ngrijirea sntii. n scopul ndeplinirii acestor trei deziderate se va lucra intens n urmtoarele arii, [68]: a) Telemedicina se refer la crearea unei reele de comunicaii de tip Internet, ntre: unitatea medical, unitatea farmaceutic i pacient. Acest sistem poate servi la ngrijiri medicale la domiciliul pacientului, permite consultaii profesionale de la distan, ori rezolv cazuri de urgen pentru

pacienii aflai n locuri izolate. b) Analize biologice. n acest sens, se dorete realizarea unor biosenzori ce pot fi utilizai direct de ctre pacient. Momentan exist sisteme de monitorizare individual a glicemiei i ureei. Din punct de vedere al plasrii biodispozitivelor, exist dou metode de abordare: (1) metode invazive (in vivo), cnd biodispozitivul este implantat n corpul pacientului (aici elementul cheie este gsirea de materiale biocompatibile); (2) metode ne-invazive (in vitro), cnd se preleveaz snge sau alt biolichid (printr-o puncie spre exemplu), iar apoi analiza se efectueaz n afara corpului. c) Monitorizarea pacienilor are n vedere totalitatea metodelor de transmitere n timp util, a tuturor parametrilor msurai cu ajutorul biosenzorilor, spre un centru medical decizional (fizic sau virtual). Interpretarea analizelor se va face fie de ctre o persoan fizic, fie de ctre un software specializat. d) Crearea de dispozitive implantabile pentru: regenerarea funciei unor organe, tratamentul bolilor cronice, nregistrarea de semnale biologice, proteze pentru diferite organe. e) Chirurgie cu invazie minim. Tehnica laparoscopic a minimizat mult invazia n actul chirurgical. Finalul acestei curse ar fi intervenia chirurgical la nivel celular. Acest domeniu reprezint o cerere continu pentru industria de micro- i nano-componente electronice. f) Succesul geneticii, care este condiionat de existena unor nanoinstrumente i nano-dispozitive, necesare manipulrii materialului genetic. Acum cteva detalii de ordin economic. n 1996, se estima valoarea desfacerilor de produse medicale pe plan internaional la 130B$ [68]. Dintre acestea, microsistemele din aparatura medical valorau 120M$ [68]. Asta nseamn c microsistemele sunt prezente n majoritatea aparatelor medicale. Pentru produse n valoare de 73B$ a rezultat urmtoarea repartiie, [68]: 37B$ pentru instrumentar medical i chirurgical, 19B$ pentru analize de snge efectuate cu biosenzori, 12B$ pentru sisteme furnizoare de medicamente, 2.5B$ pentru aparate necesare bolilor cardiace, 2.5B$ pentru proteze auditive. Se observ c piaa biosenzorilor este o provocare pentru micro- i nanoelectronic. Aici nu mai exist delimitri clare ntre domeniile: electronic, biologic, chimic, fizic. n final, toate elementele componente ale biosenzorului sunt integrate pe un singur cip sau pe un multicip hibrid [68]. n continuare se va descrie principiul senzorial din lumea vie. nelegnd bine aceste mecanisme, proiectanii de biosenzori au cutat s aduc ct mai aproape de natur principiul de funcionare al senzorilor.

10.1.2. Principiul senzorial n lumea vie

Biosenzorii au fost realizai dup o atent observaie a receptrii substanelor n lumea vie. La scar microscopic, vorbim despre recepionarea substanelor la nivel celular. Cuplarea unor substane de celule provoac schimburi de sarcini ionice, eliberare de substane semnalizatoare etc. Aceste "impresii" sunt transmise mai departe pe cale biochimic. S vedem n continuare cum capteaz o celul vie doar o anumit substan din mediul nconjurtor. Celulele vii au posibilitatea s se adapteze la modificrile mediului exterior cu ajutorul receptorilor. Receptorul const dintr-o protein ce este legat la membrana celulei. El posed o nalt afinitate de a se cupla doar cu anumite substane ce pot fi: hormoni, enzime, anticorpi, produi de metabolism, ioni - denumite ligani. Un receptor este specializat strict pe o substan. Spre exemplu, n sistemul nervos uman s-au evideniat dou tipuri de receptori pentru neurohormonul acetilcolin: nicotinici - constau n proteine cu proprieti ionofore i muscarinici - receptori cuplai de proteina G i bazai pe sistemul mesagerilor secundari, [69, 70].
Mediu extern celular Ligant Biolichid (purttor de ligani)

Na
+

Protein - Receptor

K+
Mediu intern celular Membran celular Fig. 10.1. Captarea unui ligant n receptorul celulei.

Legarea ligantului de proteina receptor cauzeaz schimbri structurale ale receptorului. Aceste modificri permit deschiderea temporar a unui canal prin membrana celulei, pentru ionii cu mobilitate mare: Na +, K+ (vezi fig.10.1). Influxul de ioni pozitivi Na+, K+, modific puternic potenialul membranei (chiar o singur legtur produce o cretere detectabil de

potenial). Se obine astfel amplificarea substanial a semnalului incident. Dup transmiterea semnalului, cel mai adesea, complexul receptor-ligant se degradeaz n interiorul celulei. De aceea, regenerarea unui nou receptor n membran necesit ceva timp. Cele mai simple proteine receptor utilizate n domeniul biosenzorilor, au fost enzimele.

10.1.3. De la celula vie la biodispozitiv

De multe ori tehnica" a mprumutat principii de funcionare din principii similare biologice. Exist dispozitive electronice ce pot fi considerate dualele unor simuri: fototranzistorul "simte" semnalul luminos i-l transmite amplificat, iar dispozitivele acustice cu cristal piezoelectric echivaleaz cu celulele receptoare de sunet, etc. Biosenzorii sunt biodispozitive sau pri ale acestora, care recepioneaz substane. Deci clasa biodispozitivelor este o clas mai larg, care o include pe cea a biosenzorilor. Definiie: Vom nelege prin biodispozitiv un ansamblu de pri electrice, biologice, mecanice, optice ca elemente active (traductoare, amplificatoare, de caracterizare, etc) i a unor elemente de interconectare, capsule, terminale, microcanale de alimentare cu biolichid ca elemente de conectare cu mediul extern. Biodispozitivul poate avea funcii complexe. Atunci cnd el este construit doar pentru a detecta o anumit substan, poart numele de biosenzor. Dar exist biodispozitive create i n alte scopuri: caracterizarea unor materiale biologice, furnizarea unui medicament, sau detectarea multor substane (biodispozitiv de tip multisenzor) combinat cu furnizarea de substane, vehicularea i manipularea de substane, esuturi, etc. Un exemplu de biodispozitiv este cel utilizat pentru furnizarea insulinei la diabetici. Acest dispozitiv conine ca elemente active: structuri traductoare care detecteaz nivelul glicemiei i o micropomp pentru insulin, [68]. n continuare ne vom focaliza atenia mai mult asupra biodispozitivelor ce au ca unic funcie recepionarea de substane biosenzorii.

10.2. Biosenzor - definiii, clasificri

Definiie: Biosenzorul const n cuplarea spaial ntre un substrat biologic activ (receptorul) imobilizat pe un traductor de semnal (dispozitiv

electronic) i un circuit electronic de amplificare. Toate aceste elemente integrate ntr-o singur capsul poart numele de biocip. n figura 10.2 este prezentat schematic structura bloc a unui biosenzor. O problem specific a biosenzorilor este imobilizarea receptorilor pe suprafeele dispozitivelor electronice. Doar cu titlu informativ, dm ca exemple cteva metode: a) adsorbia biomoleculelor pe suprafee (ce utilizeaz forele de adeziune, iar alteori forele de atracie electrostatic); b) captarea biomoleculelor n geluri din polimeri (fixarea moleculelor este mai sigur); c) crearea unor reacii chimice prin care biomoleculele se leag covalent de elementele traductorului. O alt problem specific este refacerea substratului biologic (dup consumarea complexului receptor-ligant) pentru o nou msurtoare. Timpul de regenerare al receptorului este un parametru important n alegerea unui biosenzor de ctre un utilizator.

Fig. 10.2. Prezentarea schematic a unui biosenzor.

R E C TRADUCTOR E P T (DISPOZITIV O ELECTRONIC) R

Semnal electric (I, V)

Circuit electronic de amplificare

Substane purttoare de diveri ligani

Substana purttoare a diverilor ligani, poate fi: ser, limf, snge; generic o vom denumi biolichid. Spre exemplu n snge exist o multitudine de ligani. Receptorii au rolul de a extrage din acel amestec o singur substan, pentru care au afinitate. Aceast substan, pentru analiza creia a fost conceput biosenzorul, o vom numi analit. Spre exemplu dac se dorete msurarea concentraiei de glucoz din snge, se folosete ca receptor enzima GOD (glucozoxidaz), iar analitul este glucoza. Modificrile ce au loc n biosenzor la reinerea analitului, pot fi: modificarea grosimii unui strat, schimbarea indicelui de refracie, a temperaturii, modificri n absorbia luminii, creterea sarcinii electrice,

modificri de potenial electric sau de curent electric. Clasificarea biosenzorilor. 1) Biosenzori de afinitate. Analitul nu se modific chimic n timpul msurtorii. El doar se leag de receptor. La sfrit el poate fi ndeprtat chimic sau prin splare. 2) Biosenzori de metabolism. Aici substratul biologic se consum printr-o reacie chimic cu analitul. Se formeaz un nou produs. Starea iniial se poate reface dup completa consumare a analitului. Exemplu: se dorete detectarea microorganismului Helycobacter Pylor n substana purttoare suc gastric. n metabolismul su, acest microb produce NH 3 (amoniac). Aadar, senzorul nu va detecta microbul n sine, ci concentraia de amoniac. 3) Imunosenzori. Detectarea substanelor de tip antigen (Ag) se face cu ajutorul anticorpilor (Ac), pe principiul "lact-cheie". Anticorpii sunt proteine cu molecule n form de Y (numite imunoglobuline). n vrfurile Y-ului sunt doar dou locuri, unde se poate leaga un singur tip de antigen. Aceti anticorpi sunt produi de organism ca rspuns la o anumit substan strin (antigen), pe care nu o poate elimina prin fagocitoz i creia, n ultim instan, i "ncurc planurile", legndu-se de ea: Ac+Ag AcAg. Exemplu: n referina [2] se descrie un biosenzor cu material piezoelectric acoperit cu anticorpi pentru Candida Albicans (microorganism din familia fungilor). n timp de aproximativ o or celulele receptoare au captat ntre 106 i 108 celule de Candida A., avnd ca rezultat scderea frecvenei de rezonan a cristalului piezoelectric cu 0,5...1,4kHz. 4) Senzori biomimetici. Cu ajutorul acestor senzori se detecteaz semnale fizice (sunet, stres mecanic, lumin) pe baza interaciunii lor cu substratul biologic activ (receptorul).

10.3. Structura i funciile traductorilor

Traductorii trebuie s converteasc n mrimi electrice parametri generali ca: entalpia de reacie (termistorul), modificri ale masei depuse (cristal piezoelectric), grosimi ale unor straturi transparente (dispozitive optoelectronice), concentraii de substane sau ioni (traductoare ISE).

10.3.1. Traductori termici

La senzorii de metabolism exist reacii chimice ntre analii i anumii receptori enzimatici cu degajare / absorbie de cldur. n acest caz nu se

msoar cantitatea analitului, ci variaia de temperatur, T. Tabelul 10.1 prezint entalpiile molare, H, a ctorva reacii catalizate de enzime.
Tabelul 10.1. Entalpiile molare a ctorva reacii catalizate de enzime.

Enzima receptor Catalaz Cholesterol-oxidaz (COD) Glucoz-oxidaz (GOD) Ureaz

Analit H2O2 Cholesterol Glucoz Uree

- H (kJ/mol) 100.4 52.9 80 6.6

Enzima-receptor se imobilizeaz pe sticl poroas pe suprafaa unui termistor. Se imerseaz totul n soluia de msurat. Termistorul joac rolul traductorului i furnizeaz T. De aici rezult numrul de moli de analit, conform relaiei:
H = C T

(10.1)

unde este numrul de moli de analit, C este cldura molar a dispozitivului (ce se determin anterior prin msurtori calorimetrice). Dezavantajul principal este schimbul de cldur ce apare ntre diversele componente ale experimentului, ceea ce va induce erori mari n evaluarea lui T. Optimizrile vizeaz izolarea calorimetric a biosenzorului ntr-un reactor.

10.3.2. Traductori optoelectronici

Cu ajutorul traductorilor optici se poate indica variaia unor parametri precum: coeficient de absorbie a luminii, lungime de und, indice de refracie, grosimi ale unor straturi transparente. Ca exemplu, n figura 10.3, este prezentat principiul de detectare a albuminei serice cu un senzor optoelectronic, [2]. Biolichid
purttor de analit A A A A LED

Rec.

Membrana de Rec. bromocresol

Rec. Rec. Rec. Rec.

Fotodioda

Fig. 10.3. Principiul de detectare a albuminei serice cu un senzor optoelectronic.

Receptorul a fost imobilizat pe o membran de bromocresol transparent. Curgerea biolichidului purttor de albumin a determinat captarea ei pe receptori. Creterea grosimii stratului de analit se face ntre o surs de lumin (led) i un detector de lumin (fotodiod). Curentul prin fotodiod scade pe msur ce crete grosimea stratului de albumin depus pe receptor.

10.3.3. Traductori piezoelectrici

Principiul pe care se lucreaz aici urmrete scderea frecvenei de rezonan a unui cristal piezoelectric cnd se absoarbe un material strin la suprafaa sa i-l comprim, [71]. Cristalul este acoperit cu un material receptor. Efectele zgomotului electric au putut fi nlturate prin utilizarea de cristale pereche. Aceti traductori au fost utilizai pentru detectarea: NOx, COx, H+, microorganisme, [2].

10.3.4. Traductori electrochimici

Reaciile electrochimice se produc la interfaa electrod soluie, iar reaciile biologice cu transfer de electroni se produc la interfaa enzim soluie. Se utilizeaz poteniometria, cnd se determin variaia potenialului electric al unui electrod receptor n funcie de concentraia ionilor de analit dintr-o soluie. Metoda tradiional de detecie a unor ioni ntr-o substan purttoare folosete ISE (Ion Selective Electrodes). Din punct de vedere electronic ISE poate fi privit ca o surs de tensiune electromotoare (de sute de milivoli pentru biosenzori) i cu o impedan de ieire mare (pn la sute de M), [72]. Masa electric este soluia, iar ieirea sursei este electrodul de referin. Dac concentraia ionilor de analit din soluie se modific, atunci potenialul electrodului sensibil la aceti ioni (receptorul) se modific dup relaia lui Nerst, (9.8). Spre exemplu, n cazul pH-ului (concentraia ionilor de H+), o scdere a acestuia cu o unitate, determin creterea tensiunii furnizate cu circa 55mV, [72]. Muli biosenzori electrochimici folosesc amperometria. n acest caz au loc reacii chimice de oxido-reducere cu transfer de electroni n medii electrolitice. n domeniul biosenzorilor, aceast tehnic a nsemnat detectarea unui analit prin msurarea concentraiei unui produs de metabolism, mult mai uor de determinat. Pentru aceasta se folosesc electrozi cu enzime receptor aezate n unul sau mai multe straturi. Pentru msurarea concentraiei de glucoz se folosete enzima GOD care accelereaz foarte mult procesul de oxidare al glucozei, n urma cruia

rezult i H2O2. Este mult mai uor s se msoar concentraia de H 2O2, dup care se calculeaz din reacie concentraia de glucoz. Curenii care se stabilesc n aceste straturi sunt de natura unor cureni de difuzie, [2]. Curentul, Ilim este proporional cu concentraia substanei care se determin mai uor, ci, (i=H2O2, n exemplul anterior cu glucoza), conform modelului (9.14), (9.15).

10.3.5. Traductori biologic intaci

Pentru determinarea unui analit, aceste traductoare folosesc chemoreceptori direct din lumea vie. Spre exemplu, s-a realizat un receptor de acetilcolin, utiliznd organul electric al petelui Torpedo i un senzor capacitiv, [2]. Cnd biolichidul purttor coninea acetilcolin n concentraie mrit, cretea tensiunea electric furnizat de traductorul organic al petelui, ceea ce ncrca senzorul capacitiv. S-au putut face msurtori n domeniul 1....100mol/l concentraie de acetilcolin n biolichidul purttor prin tehnici de C-V-metrie. Alt direcie de lucru este cuplarea unor celule receptoare vii cu una sau mai multe fibre nervoase. Stimularea unor celule olfactive sau gustative cu un anumit analit conduce la generarea unui impuls nervos detectabil ctre neuronii din fibr. Ca exemplu, s-a realizat un senzor pentru determinarea concentraiei de aminoacizi, utiliznd drept traductor organul olfactiv din antenulele crabului Calinectes Sadipus. Antenulele, legate de o unic fibr nervoas, au fost conectate cu o sond de platin. Stimularea receptorilor olfactivi cu aminoacidul L-glutamat, n concentraia 0,01...1mmol/l, a creat impulsuri nervoase msurabile, cu valori cuprinse ntre 10-1000V. n plus, s-a obinut o linearitate bun n aceast gam de msur, [2]. Observaie: Au fost amintite i exemplificate o serie de substane ca: acetilcolina, dopamina, ioni de Na+, Ca+, K+. Ele particip ca neurotransmitori la propagarea impulsului nervos. De reinut, c transmiterea unui impuls nervos se face pur electric: prin deplasare de sarcin electric. Datorit acestei comportri "electronice" a sistemului nervos uman, s-a dezvoltat o ramur nou n tiinele biologice: neuroelectrofiziologia, [2].

10.4. Dispozitive Bio-FET

Prin Bio-FET vom nelege totalitatea dispozitivelor biologice ce conin ca element traductor activ un tranzistor cu efect de cmp. Ele pot fi biosenzori (precum tranzistoarele ISFET, ENFET, etc) sau dispozitive de testare i investigare a materialelor biologice, sau dispozitive create n alte scopuri.

10.4.1. Tranzistoarele ISFET

Tranzistoarele ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistor ) au derivat direct din ISE (electrozii sensibili la ioni). Din punct de vedere constructiv, dispozitivul ISFET este un MOSFET, pentru care receptorul - un electrod ce sezizeaz doar anumii ioni (de exemplu de Ca +, K+) - este un metal special (Pt, Pd, Ir). Regiunea porii este imersat ntr-o soluie biologic cu analit. Modelarea se face analog cu cea a MOS-FET-ului, doar c tensiunea de poart VG depinde de concentraia ionilor de analit conform relaiei lui Nerst. O categorie aparte o reprezint tranzistoarele MEM-FET (MEMbrane-FET), la care electrodul receptor este o membran organic depus n dreptul porii tranzistorului, i care capteaz selectiv sarcina ionic. n figura 10.4. este prezentat structura i simbolul ales pentru tranzistorul ISFET.
G Biolichid cu ioni de analit ISE

S n+

. . . . . .2 . . .3 . 4 ..

SiO / Si N

D n+ G D

Canal de electroni S p-substrat SB (Substrat)

SB

(a)

(b)
b) Simbol.

Fig. 10.4. a) Structura tranzistorului ISFET;

Tensiunile aplicate: VS=VSB=0, VG>0 i VD>0 se menin constante. Cnd concentraia ionilor de analit crete, se modific diferena de potenial metal-semiconductor, conform cu relaia (9.8). Deci variaz V FB i n consecin potenialul porii. Rezult o mbogire a canalului n electroni,

iar n final o cretere a curentului de dren. Fluctuaiile concentraiei de ioni de analit se traduc prin fluctuaii ale curentului ID. Adoptnd pentru curentul de dren al tranzistorului ISFET modelul simplificat n regim cvasiliniar (5.52), plus efectul tensiunii de poart asupra mobilitii purttorilor din canal, (5.61), n care neglijm termenul VDS2, la tensiuni VDS mici, avem:
ID = ( VGt VT ) VDS 1 + G ( VGt VT )

(10.2)

Tensiunea de poart total, VGt este suma tensiunii, VG, aplicat de la o surs extern i a potenialului de electrod ME, dat de relaia lui Nerst:
VGt = VG + 0 + RT ln c A zF

(10.3)

Prin nlocuirea relaiei (10.3) n relaia (10.2), rezult dependena curentului de dren, ID, de concentraia de analit, cA:
RT VG VT + 0 + ln c A VDS zF ID = RT 1 + G VG VT + 0 + ln c A zF

(10.4)

Observaie: Ne dorim o sensibilitate curent-concentraie de analit ct mai mare. Relaia (10.4) arat c este mai favorabil un regim de lucru la tensiuni VGt mici, astfel nct s se poat neglija efectul atenurii mobilitii sub influena cmpului electric transversal. Rezult astfel, o dependen logaritmic curent-concentraie. n plus, dac s-ar lucra sub prag, unde I D depinde exponenial de VG (vezi relaia 5.94), prin compunere cu relaia lui Nerst ar rezulta o dependen polinomial curent-concentraie, net superioar funciei logaritmice. Observaie: ISFET-urile care determin concentraia ionilor de H + se mai noteaz prin pH-FET-uri, innd cont c pH=-lg [cH+]. O soluie apoas este neutr cnd pH=7, moment n care concentraia ionilor de H+ o egaleaz pe cea a ionilor negativi de OH-. Soluia apoas este acid pentru pH<7 i bazic pentru pH>7. Pentru electrolitul complex al organismului uman neutralitatea are loc de asemenea cnd cH+=cOH-, dar aceasta se ntmpl la temperatura de 370C pentru un pH=6,75. Sngele are pH=7,36, deci se comport slab bazic. Cu acest gen de tranzistor s-au fcut experimente pentru determinarea concentraiei ionilor de H+ i K+. National Company Japan a realizat un

biosenzor integrat pe cip de tipul Silicon On Sapphire, coninnd un K +FET cu membran de GOD i dou H+-FET cu membran de ureaz. Cu acest biosenzor se pot face simultan analize de glucoz i uree n snge [2]. Alt exemplu. S-a realizat un dispozitiv ISFET, ca senzor de metabolism, ce msoar concentraia de amoniac, ca n figura 10.5, [2]. Receptorul care sesizeaz NH4- este Paladiu (Pd). El este depus peste oxidul de poart. Se constat o cretere major a sensibilitii biosenzorului dac peste Paladiu se depune un strat de Iridiu (Ir). Se obine o cretere a tensiunii V G de la 20mV n cazul electrodului de Pd, la 400mV n cazul acoperirii Pd cu Ir, cnd concentraia de NH4- este 400ppm. De reinut aceste dou materiale: paladiu, iridiu, n construcia biosenzorilor.
VG biolichid Ir Ir Ir Ir Ir S Fig. 10.5. Dispozitiv MOS pentru detectarea ionului de amoniu. n+ NH3

............

Pd SiO2

D n+

p-substrat SB

Un alt dispozitiv specific msurtorilor de poteniometrie este prezentat n figura 10.6. Scopul acestui Bio-FET este caracterizarea electric a unor biolichide, [2].
VG VS Semiconductor organic ID(A) 80 60 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ Suport izolator VD 40 20 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

(a)

(b)

VG(V)

Fig. 10.6. a) Dispozitiv Bio-FET microelectrochimic; b) Caracteristica ID-VG msurat.

Primul dispozitiv microelectrochimic studiat deinea semiconductori organici (polimeri) depui ntre surs i dren. Se obineau caracteristici ca de diod. Dac n plus intervenea al treilea electrod - poarta, se obineau caracteristicile din figura 10.6.b., pentru semiconductorul organic din polianilin. Ca i la tranzistoarele MOS, s-a constatat c n vecintatea "pragului", rezistena ntre surs i dren variaz cu peste 6 ordine de mrime la variaii foarte mici ale tensiunii V G (cu 0,1...0,3V). Spre deosebire de tranzistoarele pe Siliciu, la tranzistoarele Bio-FET de acest gen, dup atingerea unei valori maxime curentul scade. Acest dispozitiv este potrivit pentru studierea proprietilor diverselor materiale biologice. Dac se nlocuiete semiconductorul organic cu o soluie neutr, n care se crete concentraia unui neurotransmitor (adrenalin, noradrenalin, acetilcolin, dopamin, serotonin etc) se pot obine caracteristici I D-VG, furnizoare de parametri de model. Modelele tranzistoarelor MOS pot fi extinse i aici, pe anumite subdomenii de msur. Acest lucru permite extragerea unor parametri echivaleni (tensiune de prag - concentraie de prag, tensiune de nivel mare - concentraie de neurotransmitor de nivel ridicat). Aceti parametri ar putea fi deosebit de utili n stabilirea unor concentraii limit ntre care se face transmiterea impulsului nervos.

10.4.2. Tranzistoare EN-FET, IM-FET, Microbial-FET

Denumirea de ISFET este generic. Prin tranzistoare ISFET trebuie s se neleag doar acele FET-uri care determin concentraia ionilor ntr-o soluie pe baza unui electrod selectiv prin metoda poteniometric. Din aceast clas de tranzistoare au derivat i IMuno-FET, ENzime-FET, Microbial-FET, a cror denumire sugereaz tipul relaiei analit-receptor. De aceea, termenul generic de "Bio-FET" acoper orice tranzistor cu efect de cmp folosit ca element traductor n domeniul biosenzorilor. M. Gotoh i colaboratorii si, [73] a realizat un senzor pentru acetilcolin cu un tranzistor ISFET. Receptorii au fost fixai pe poarta tranzistorului cu ajutorul unei membrane de polivinilbutirat. Legarea acetilcolinei de receptori n concentraie de 0,1....10mol/l a produs creteri detectabile ale potenialului porii (zeci de mV). Tamya i colaboratorii, [74] au realizat un senzor de metabolism cu tranzistor Bio-FET pentru determinarea alcoolului. Microorganismul Gluconobacter, care prin metabolismul su produce alcool, a fost prins ntro pelicul de arginat de calciu pe poarta tranzistorului. Astfel de dispozitive fac parte din categoria aa numitelor Microbial-FET-uri.

IMmuno-Fet-uri sunt tranzistoare cu efect de cmp, a cror poart este acoperit cu o membran ce conine anticorpi. n 1987, D. Begreld, [75] a realizat o astfel de prob pentru detectarea imunoglobulinei umane IgG cu ajutorul albuminei. S-au detectat concentraii de analit de ordinul 10 -11..10-7 mol/l, [2, 75]. Avantajul major al unor astfel de dispozitive este recepionarea sigur doar a analitului dorit (deoarece se lucreaz pe principiul lact-cheie). Dezavantajele sunt legate de dificultatea realizrii unei membrane receptoare perfect izolatoare, dar i imuno-responsiv i suficient de subire pentru a transmite creterile de potenial cauzate de cuplarea Ag-Ac, la suprafaa semiconductorului. Cea mai consacrat aplicaie n medicin a metodei poteniometrice a fost msurarea ureei sangvine. Ureea, n prezena catalizatorului ureaz, d anumii ioni ca produi de reacie: NH4+, OH-, HCO3-. Concentraia acestor substane ncrcate electric a fost uor de msurat cu ISE. Aceast clas tranzistoarelor Bio-FET, ce utilizeaz o membran enzimatic receptiv pentru ionii de analit (amoniu, n cazul de fa) poart numele de EN-FET (ENzime-FET). Enzima receptoare - ureaz - se depune fie pe capacitoare MOS cu straturi de Ir/Pd, fie n poarta tranzistorului peste un strat de Si 3N4. Rspunsul neliniar al unui astfel de senzor va fi studiat n paragraful 10.9. ntrebare: Care este diferena ntre ISFET i ENFET ? Rspuns: La tranzistorul ISFET, metalul porii (Pt, Pd, Ir) este elementul receptor. El reacioneaz electrochimic cu ionii (de H+, K+, Ca+) i formeaz la echilibru termic un material cu un alt E F, conform relaiei lui Nerst. Variaiile de concentraie de analit (ioni n cazul nostru) se traduc n variaii ale MS. La tranzistoarele ENFET, pe metalul porii se depune o enzim receptoare (de exemplu acetilcolinesteraz - AcChE). Ea va favoriza hidroliza acetilcolinei n colin, acetat i H +. n urma reaciei rezult 1 mol de H+ per 1 mol de reactant de acetilcolin. EN-FET-urile sunt n majoritate senzori de metabolism, iar n cazul de fa se msoar concentraia ionilor de H+. Acesta este rolul enzimei specifice c accelereaz foarte mult o reacie catalitic (hidroliza n exemplul nostru), i se obin ioni de H+ cu preponderen din hidroliza doar a analitului (acetilcolin n exemplul nostru). Concentraia de analit se traduce n concentraie de sarcin acumulat n poarta tranzistorului i deci n variaii de curent prin tranzistor.

10.4.3. Optimizri ale tranzistoarelor Bio-FET

S considerm un tranzistor Bio-FET care msoar concentraia ionilor de K+ captai de o membran permeabil. De fapt este vorba de un tranzistor

MIS-FET care are, n locul oxidului de poart, biolichid ce conine ioni. Receptorii se pot depune fie lng metalul porii, fie lng suprafaa semiconductorului, fie sunt dispersai n volumul respectiv. Cnd biolichidul curge prin acest spaiu, receptorii capteaz ionii de K+ (n aceeai manier n care celulele vii rein analiii din snge, cnd acesta curge prin capilare foarte nguste). Ionii se vor aglomera lng receptor.
sa K+ K+ K+ K+ K+ K+ 0 xG
I

Receptor

Receptori Receptor sb K+ K+ K+ x
M

sc

K+ K+ K+ K K+ K+ K+ K K+ K+ K+ K 0 xG
I

K+ K+ K+ 0 xG
I

(a)

(b)
+

(c)

Fig. 10.7. Distribuia sarcinii ionice de analit (K ) captat de receptori (liniile punctate) ce au fost plasai: (a) superior, (b) inferior, (c) uniform n volum.

Metalul porii deine un MS cunoscut. Sarcina ionilor de potasiu, captai din lichidul purttor de ctre receptor, polarizeaz poarta tranzistorului. Acelai lucru l fceau ionii de sodiu i potasiu n cazul tranzistoarelor MOS, atunci cnd calculam tensiunea de benzi netede. Se studiaz n continuare poziia de amplasare optim a unei membrane cu receptori n spaiul porii tranzistorului Bio-FET, astfel nct efectul ionilor s fie ct mai puternic resimit la suprafaa semiconductorului, [76]. n figura 10.7 sunt prezentate trei variante de distribuie a sarcinii electrice ionice n dreptul porii tranzistorului, cnd receptorii sunt plasai: superior (la x=0), inferior (la x=xG) i dispersai uniform n volumul porii (vezi i fig. 10.8).
G receptor curgere S Fig. 10.8. Structura Bio-FET. n+ K+ Biolichid cu ioni K+ K+ receptor K+ Metal 0 Izol. (Biolichid) xG Semic.

D n+

p-substrat

Prin integrarea ecuaiei Poisson n spaiul x (0, x G ) , se calculeaz tensiunea echivalent indus pe poart de ctre ionii K+. Se aproximeaz distribuia de sarcin ca fiind liniar n cele 3 situaii. Dac se noteaz cu CG = is/xG capacitatea specific a izolatorului de deasupra porii i cu sa, sb, sc, densitile de sarcin de suprafa n cele 3 cazuri (vezi fig. 10.7.a, b, c), se deduc urmtoarele expresii pentru tensiunea indus pe poart:
1 1 VGa = sa ; VGb = sb ; VGc = sc 6 CG 3 CG CG

(10.5)

Se poate presupune c sa=sb=sc pentru receptori identici, ce atrag aceeai cantitate de analit la suprafa, indiferent de poziie. Un rspuns maxim se obine n cazul c. Dac nu este posibil plasarea receptorilor uniform n volum, atunci preferabil este situaia b, adic plasarea receptorilor ct mai aproape de suprafaa semiconductorului.

10.5. Biodispozitive de tip MEMS

Sunt biodispozitive care combin structuri mecanice (micropompe, actuatori) cu structuri microelectronice. n cazul Sistemelor Micro-ElectrMecanice (MEMS) problemele sunt legate de vehicularea biolichidului n spaiul porii tranzistorului. n mod clasic, acest lucru se face cu o micropomp cu membran i valve, acionat de un actuator, figura 10.9.a.
Actuator Actuator deformat membrana n repaus Difuzor deformat membrana n repaus

Valva V1 Camera de admisie

Valva V2 Camera de refulare

Confuzor

Camera de admisie

Camera de refulare

(a)

(b)

Fig. 10.9. Metode de vehiculare a biolichidului: a) micropomp cu membran i valve; b) micropomp cu membran i difuzor-confuzor.

Prin actuator se nelege dispozitiv de acionare. Proiectarea actuatorilor se studiaz la automatizri. Dezavantajele acestei micropompe sunt: fiabilitatea sczut (deoarece valvele fiind elemente n micare se pot bloca, defecta uor), posibilitatea deteriorrii unor componente biologice prin nchiderea / deschiderea valvelor. De aceea este preferat micropompa cu difuzor-confuzor din fig.10.9.b, fr pri n micare, [77]. Este adevrat c atunci cnd actuatorul ridic membrana, se absoarbe lichid att prin difuzor din camera de admisie (un flux mare), ct i prin confuzor din camera de refulare - fapt nedorit - (dar un flux mic). Oricum, marele avantaj vine din simplitatea tehnologic: microstructurile difuzor-confuzor se realizeaz uor prin corodare anizotrop a siliciului; n plus nu au pri n micare.
Actuator Gfront

S
n+

oxid poart fa Si-film, p = membrana micropompei = corp tranzistor canal de inversie Oxid ngropat Membrana cu Receptori

D
n+

Si

K+

Si

Si, p

Si, p

Si, p

Camera de admisie Biolichid

Gback

Camera de refulare Biolichid

Fig. 10.10. Structur Bio-FET cu tranzistor SOI-MOSFET.

n figura 10.10 este prezentat o variant constructiv de tranzistor BioFET pe structur SOI i alimentare prin micropomp cu difuzor-confuzor. Filmul de siliciu reprezint sediul tranzistorului, dar i membrana pe care o acioneaz actuatorul. Elementul traductor din fig. 10.10 este un tranzistor SOI-MOSFET clasic. Pentru a avea canalul de inversie ct mai aproape de membrana cu receptori, se recomand polarizarea porii din spate, G back. Poarta din fa, Gfront, poate fi utilizat doar pentru conexiunea mecanic cu actuatorul. Analiza fcut cu formulele (10.5) recomand plasarea membranei cu receptori pe partea inferioar a filmului de siliciu (ct mai aproape de zona activ a tranzistorului). Microcanalele difuzor-confuzor au o form n trunchi de piramid i se obin uor prin corodare (spre exemplu pentru Si <111>, unghiul de corodare este 54,74 0). Membrana cu receptori poate fi depus sub stratul ngropat. Acest izolator ngropat reprezint un excelent strat de stopare a corodrii siliciului. S
Si-film, n = membrana micropompei = = corp tranzistor canal de acumulare Membrana Si Oxid ngropat cu Receptori K+ Si

Si, p

Si, p

Si, p

Camera de admisie Biolichid

Gback

Camera de refulare Biolichid

Fig. 10.11. Structur SOI-BioFET optimizat.

Tehnologiile SOI permit realizarea unor filme de siliciu de grosimi variabile. Ele trebuie astfel proiectate nct s reziste din punct de vedere

mecanic. Aceasta deoarece din punct de vedere electric, se dorete un film ct mai subire pentru o sensibilitate maxim a senzorului. Este nevoie ca traductorul s fie sensibil la tensiuni foarte mici (proporionale cu concentraii mici de analit). De aceea, se poate utiliza aici tranzistorul pseudo-MOS ca element traductor, deoarece are avantajul fa de tranzistorul SOI-MOSFET, c "simte" tensiuni de poart n orice regim de lucru. Astfel, se elimin o grij suplimentar: aducerea tranzistorului n regim de inversie. Avem urmtoarele simplificri tehnologice: nu mai sunt necesare difuziile n+ n filmul de siliciu, nici depunerile de oxid i metal pentru poarta din fa, Gfront. Mai putem face nc un pas n optimizarea structurii: eliminarea actuatorului. El avea rolul de a ridica i cobor membrana de siliciu. Acelai efect l poate avea poarta din spate (care ea nsi nu este mobil), dar acioneaz un film de siliciu suspendat, care se poate arcui. Se pot adapta aici principiile de la tranzistorul MOS cu poart mobil, dar avnd grij ca deformarea filmului de siliciu s nu duc la spargerea sa. De fapt, nu este nevoie de o deformare prea ampl a filmului. Mici pulsuri negativepozitive (de cca 8V), aplicate pe Gback, pot produce ncovoieri suficiente ale filmului pentru a recircula biolichidul prin dreptul membranei cu receptori. Figura 10.11. prezint structura optimizat a SOI-BioFET. Pentru recircularea biolichidului este necesar s se fixeze V S=VD=0V, iar pe terminalul Gback s se aplice ntr-un timp tr, pulsuri de tensiune de +8V i respectiv 8V. Aceast manevr arcuiete n jos filmul de siliciu la tensiuni pozitive, iar prin confuzor se elimin vechiul fluid; apoi, la tensiuni negative, filmul se arcuiete n sus i prin difuzor se absoarbe noul fluid. Dup timpul de recirculare, tr, (calculat din considerente de microfluidic) se poate presupune c s-a mprosptat tot biolichidul n spaiul porii. Urmeaz msurtorile electrice. Pentru msurarea concentraiei de analit captat n spaiul porii de ctre receptor, se monitorizeaz curentul de dren, I D. Se procedeaz astfel: se aplic tensiuni constante, de referin pe cele 3 terminale: V S=0, VD>0, VGback>0. n acest mod, tranzistorul pseudo-MOS este n regim de acumulare, unde curenii sunt mai mari i deci mai uor de msurat. Se las dispozitivul n repaus un timp de captare, tc, (calculat din considerente biologice: captarea analitului pe receptor). Se citete curentul ID. Cu ajutorul acestui curent, dintr-o relaie de tipul (10.4) se calculeaz concentraia de analit, cA.

10. 6. Biodispozitive pentru caracterizare

Spre deosebire de biosenzori, care sunt biodispozitive destinate determinrii concentraiei unui analit ntr-un amestec de substane, biodispozitivele concepute pentru caracterizarea proprietilor fizicochimice ale unor compui biologici pot msura alte mrimi dect concentraiile (cureni, capaciti electrice). Prin msurtori polarografice se determin curentul n funcie de tensiunea aplicat pe biodispozitiv. Diferena dintre polarografia clasic, utilizat n chimie, i cea aplicat aici const n faptul c biodispozitivul lucreaz cu o cantitate mult mai mic de substane. Spre exemplu, dac ntr-o instalaie chimic de polarografie se utilizeaz 100-500 ml soluie ntre doi electrozi metalici, la biodispozitive cantitatea de soluie ajunge la 0,1-0,5 ml. Uneori aceast cantitate infim de biolichid este ncapsulat n cadrul unei structuri complexe pentru a evita evaporarea sau reaciile chimice secundare nedorite. Alteori este nchis ntr-o cavitate ce comunic cu exteriorul sau cu un microrezervor prin intermediul unei membrane semipermeabile. n fig.10.12.a este prezentat un biodispozitiv pentru caracterizarea soluiei de epinefrin (adrenalin) de concentraie 1 mg/ml, de uz farmaceutic. Aceast substan este un neurotransmitor (sau un neurohormon) din familia catecolaminelor. Ambele denumiri provin fie din latinescul adrenes fie din grecescul epi-nephros i nseamn literal acelai lucru: pe rinichi, sugernd prin aceasta, glanda suprarenal care secret acest neurotransmitor. Din punct de vedere chimic adrenalina, C9H13NO3, conine un lan aromatic (catecol), la care se leag un grup ce conine nitrogen (amina), fig.10.12.b.

(a)

(b)

Fig.10.12. Structura biodispozitivului, (b) formula chimic a epinefrinei ca ion.

Cei doi electrozi metalici, Met1 i Met2, au fost denumii surs i dren (notai S i D), iar tensiunea pe biodispozitiv a fost notat cu V DS. Volumul de biolichid utilizat a fost de aproximativ 0,2 ml (1 pictur), iar distana dintre electrozi d=1mm. Izolatorul 1 a fost plexiglassul, iar izolatorul 2 aerul. Cei doi electrozi metalici au fost realizai din aliajul Sn 60 Pb38 Cu 2 ISO 9453 (25), [78].

n figura 10.13 sunt prezentate rezultatele experimentale. Biodispozitivul nseriat cu o rezisten de valoare mare, R=110 k, a fost alimentat la o surs de tensiune US. n figura 10.13.a sunt prezentate rezultatele msurtorilor n curent continuu, sub forma caracteristicilor I D VDS. Apariia regiunilor cu rezisten diferenial negativ demonstreaz amorsarea unei surse interne de tensiune invers, bazat pe reacia electrochimic de reducere a adrenalinquinonei n adrenalin, [79]:

Pe poriuni, caracteristica poate fi modelat cu relaia Butler Volmer, dac predominant este procesul de electrod sau cu legile de difuzie ale lui Fick, dac predominant este procesul de difuzie a ionilor de analit. Oricum ambele relaii descriu dependene neliniare, exponeniale pe poriuni ale caracteristicii statice a biodispozitivului, care prin logaritmare dau relaia Tafel de legtur dintre curent i potenialul pe dispozitiv:
ln I D ln I 0 + z q VDS kT

(10.6)

unde: ID este curentul prin biodispozitiv, VDS tensiunea ntre Surs i Dren, (0,1) este coeficientul de transfer, q sarcina electric elementar, z numrul de electroni schimbai n reacia de oxido reducere (z = 2 n cazul de fa), k constanta lui Boltzmann, I 0 curentul de saturaie pentru reacia de oxido-reducere, sau curentul limit pentru procesul de difuzie (ce depinde de constanta de difuzie a moleculei de epinefrin). Presupunnd procesul redox predominant, se poate determina rata reaciei de oxidare a adrenalinei, KAdr+ , din relaia, [62]:

350 NaCl 300 Curent [uA], (Adr1, NaCl) 250

Adr1

25 Adr2
Tensiune sursa Us ( V )

20

20 15 10 5 0 0 1 Potential, [ V ] 2

1500 1000
10

150 100 50 0

Curent [uA], (Adr2)

200

500 0
0

-500 400 timp ( s ) 900

-100

Fig. 10.13. (a) Caracteristicile ID -VDS ale biodispozitivului cu 2 terminale n curent continuu; (b) Curbele de comutaie.
I 0 = F z K Adr [c Adr + ]

(10.7)

La nivelul sinapsei neuronale aceti neurotransmitori asigur transmiterea impulsului nervos (care este o supratensiune de la -30mV la 70mV). Aadar, fiziologic predomin un regim de comutaie. De aceea, n fig.10.13.b au fost studiate curbele VDS timp n regim de comutaie pentru dou biolichide: soluii apoase de adrenalin (caz n care V DS s-a notat cu Uadren) i de NaCl cu aceeai concentraie de 1mg/ml (caz n care V DS s-a notat cu UNaCl n figura 10.13.b). Adrenalina este mult mai sensibil la variaii de tensiune electric dect clorura de sodiu. Astfel, se observ n fig.10.13.b c atunci cnd tensiunea sursei externe US a comutat de la 0V la 2V, tensiunea pe biodispozitivul cu soluie de adrenalin a atins 320mV, n timp ce tensiunea pe biodispozitivul cu soluie de NaCl a atins doar 90mV, [79]. Semiconductoarele organice tind s nlocuiasc clasicele jonciuni pn pe Siliciu, n msura n care prezint conducie electric neliniar. Biolichidele i n special cele utilizate de sistemul nervos n propagarea influxului nervos pot fi candidai demni de luat n seam, aa cum rezult experimental. ntruct n biodispozitive conducia electric prin soluie este i ionic i electronic, se poate pune problema obinerii unor separri de sarcini prin aciunea unui al treilea electrod.

Tensiune biodispozitiv ( m V )

Us(V) U adren. U NaCl

2000

20 -20 0 I d ( u A) )

Vg(V) 10 20
Vd=1V Vd=2V

30

-60

-100

Met3

-140

-180

(a) (b) Fig.10.14. (a) Structura biodispozitivului de test cu trei terminale; (b) caracteristica ID VGS n curent continuu.

n fig.10.14.a este prezentat un biodispozitiv de caracterizare cu trei terminale ce utilizeaz aceleai materiale ca i cel anterior prezentat. Metalul de poart Met 3 a fost Al plasat pe spatele izolatorului1, iar biolichidul soluie de epinefrin 1mg/ml. n fig. 10.14.b sunt prezentate curbe ID VGS msurate la tensiunile VDS= 1V, 2V. Liniaritatea acestor curbe n gama de msur abordat, infirm instalarea unor canale de inversie/acumulare; dar dezalinierea lor pentru cele dou valori distincte ale lui VDS probeaz experimental c al treilea terminal influeneaz curentul prin biodispozitiv, probabil datorit segregrii ionilor pozitivi i negativi care circul prin soluia lichid.

10.7. Biodispozitive pentru furnizarea de substane active

Toate biodispozitivele utilizate ca proteze auditive, ca implant sub-retinal, biostimulatoare cardiace, detectoare de uree declanatoare de dializ, detectoare de glucoz declanatoare de insulin, micropompe de dozare/microdozare de medicamente reprezint cteva exemple de biodispozitive concepute n scopul substituirii unor deficiene organice. De cele mai multe ori ele includ un sistem de biosenzori multifuncionali, integrat cu circuitul electronic de prelucrare ntr-un biocip, sau structuri MEMS obinute prin micro ori nanotehnologii. n prezent, convergena dintre tiina materialelor biocompatibile i microtehnologii au direcionat aceste biodispozitive spre aplicaii in vivo. Aa au aprut biodispozitivele implantabile n esut, oferind platforme pentru terapeutic, precum livrare de substane active la momentul oportun.

n fig.10.15 este prezentat un biodispozitiv implantabil pentru furnizarea insulinei. El face parte dintr-o clasa mai larg, bazat pe aa numitele biomicrocapsule, care au scopul de a asigura un spaiu sigur pentru o specie de celule nchise ntr-o cavitate i plasate n interiorul unui organism gazd. Se creeaz o camer imunoizolant reprezentat de dou membrane semipermeabile, care s permit schimbul de nutrieni cu exteriorul. Urmeaz nchiderea camerei dup introducerea celulelor. Materialele membranei trebuie s asigure o funcionare normal a celulelor ncapsulate, fr s permit recunoaterea lor din partea corpului, deci evitarea funciilor de respingere. Din punct de vedere tehnologic se pornete de la corodarea anizotrop a dou plachete de siliciu pn la obinerea unor membrane subiri cu grosimi de circa 10 m. Aceste membrane sunt porozificate astfel nct se obin microcanale cu lungimi ntre 6-9 m i diametre nanometrice. Se creeaz camera imunoizolant. Se acoper marginile plachetelor cu colagen sau albumin seric, se introduc celulele n cavitate i apoi se lipesc plachetele de siliciu, nchiznd camera. Membranele semipermeabile din Si poros permit celulelor s funcioneze normal (absorb nutrieni din exterior i furnizeaz insulin prin membrana poroas), fig.10.15, [80]. S-a demonstrat c celulele productoare de insulin au o viabilitate de aproximativ 8 zile pe substrat de Si poros, dar prezint o proliferare superioar n aceste 8 zile pe Si poros fa de substratul de latex, clasic utilizat n biochimie, [81].

Fig.10.15. Dispozitiv de furnizare a insulinei prin ncapsularea celulelor secretoare de insulin ntre dou membrane de Si-poros.

10.8. Biodispozitive pentru prelevare individual a celulelor vii

Principiile de funcionare ale acestor biodispozitive sunt bazate pe legi fizice, chimice i biologice n general. Dar fabricaia lor este posibil doar prin utilizarea micro i nanotehnologiilor. Acesta a fost motivul esenial, pentru care dezvoltarea acestor biodispozitive a putut fi pus n practic mai mult de ctre ingineri microelectroniti dect de ctre biologi. 1. Biodispozitive pentru ncapsulare individual a celulelor vii n acest domeniu s-a cutat un material suport, biocompatibil cu celulele vii, prelucrabil prin metode MEMS/NEMS, pentru a furniza locauri individuale pentru celule. O celul izolat n aceast capsul poate fi alimentat cu nutrieni, iar n final i se pot msura unii parametri biologici precum: ratele de asimilaie/dezasimilaie, timpul de via, proliferarea. Unul dintre mediile de implantare unicelular a fost siliciul nanoporos cu pori de dimensiuni cuprinse ntre 7 i 49nm, [81, 82]. Celulele depuse pe acest substrat au fost celulele secretoare de insulin (insulinome). n paralel s-a studiat comportamentul acestor celule pe suporturi binecunoscute n biologie: (a) suport din latex i (b) suport dintr-un material de referin (petri dishes). Dup 8 zile, procentajul de supravieiure al celulelor insulinome a fost cuprins ntre 90-100% pe materialul de referin, dar i pe membrana de siliciu poros, iar pe membrana de latex de doar 70%. Dup 4 zile proliferarea celulelor insulinome a fost de acelai ordin de mrime, 5105celule/ml, pe membranele de Si-poros i de petri dishes i mult mai mic pe suportul de latex, 2104celule/ml. Dup nc 4 zile (deci 8 zile n total), proliferarea pe suportul de referin a ajuns la 4,5106celule/ml, pe Si-poros a ajuns la 2106celule/ml, iar pe latex a ajuns doar la 2,2104celule/ml, [81]. Urmtorul pas a fost cutarea unor substraturi cu microcapsule, cu ajutorul crora s se studieze in vitro celulele vii, meninndu-le aceeai stare morfofuncional ca n mediul in vivo. Au fost studiate trei tipuri de substraturi: (a) siliciu, (b) strat de Au depus peste Si, (c) sticl, toate cu forme ce mimeaz cuiburile in vivo, n care cresc celulele eucariote. n cele 3 substraturi s-au realizat microcaviti de 1-40m prin tehnici de corodare anizotrop, [83].

Membrana Citoplasma Nucleu

Fig.10.16. Comportarea celulelor pe substrat de Siliciu.

S-au folosit mti hexagonale, ptrate i circulare pentru creearea unor capsule cu diverse forme. Celulele au fost plasate n caviti i introduse ntr-un incubator, unde au fost alimentate cu nutrieni, astfel nct condiiile lor de via s fie ct mai apropiate de cele in vivo. Celulele depuse n aceste mirocaviti au fost celulele fibroblaste dermice, prelevate prin biopsia pielii, [83]. Experienele au demonstrat c: - celulele fibroblaste ader bine la toate cele 3 materiale utilizate; - comportamentul celulelor nu depinde de forma capsulei (haxagonal, circular, etc.); celulele caut s ia forma capsulei; - comportamentul celulelor n timp a dovedit ns o dependen de materialul substratului. Cultura de fibroblaste s-a nmulit i a supravieiut cel mai mult pe suportul de sticl; - prin microscopie optic s-a observat c histologia (structura) membranar i citoplasmatic a celulei a fost identic cu cea observat la culturile aflate pe materialul de referin petri dishes; - tendina general a celulelor a fost s ias puin din alveole pentru a genera un film coerent peste substrat; n special zona celulei ce coninea nucleii se bomba deasupra substratului. 2. Micro i nano instrumente de manevrare celular n acest scop au fost mprumutate o serie de dispozitive din diverse domenii i adaptate, miniaturizate pentru scopuri biologice: micropompe cu difuzor/confuzor [77], microdoze, microgrippere mecanice [84], micropipete [85], pulsuri laser pentru aducerea/eliminarea celulelor din microcaviti [86].

Fig. 10.17. Seciune transversal printr-un microgripper tactil.

Gripperele sunt instrumente de manevrare i asamblare utilizate n tehnic. Microgripperele utilizate n domeniul biologic trebuie s manipuleze materiale de dimensiuni micronice sau submicronice. n aceste cazuri actuarea se face utiliznd fore electrostatice sau piezoelectrice, care erau inutilizabile la scar macroscopic. Adugnd sistemului micromecanic un senzor piezoelectric, ce sesizeaz atingerea i eventual o microcamer de luat vederi, se poate obine un microgripper ca n figura 10.17, care nu numai c manevreaz microelementele, dar i pipie i vede, [84]. Principiul de funcionare al actuatorului bio-termic se bazeaz pe coeficienii de dilatare diferii ai aluminiului i siliciului. Cnd structura este nclzit consola se ncovoaie. Datorit senzorului piezorezistiv incorporat, rezistena electric a stratului de siliciu este puternic dependent de stresul mecanic. Astfel, fora tactil mecanic este citit cu uurin, graie unei puni Wheatstone integrat n consol. De asemenea au fost mprumutate din electrochimie tehnici de separare a unor componente celulare: electroforeza, electroosmoza, dielectroforeza, [87]. Proteinele sunt formaiuni globulare aranjate n aa manier nct zonele hodrofobe sunt orientate spre interior, iar zonele hidrofile sunt n contact direct cu mediul apos exterior. De asemenea, aranjamentul gruprilor acide i bazice ale proteinei este puternic influenat i de pH-ul mediului exterior, adic de concentraia ionilor de H+. Toate aceste considerente duc la modelarea globular a proteinelor. Lanul proteic are diverse dimensiuni i diverse ncrcturi electrice. Electroforeza proteinelor este influenat de sarcina electric, de dimensiuni, de solubilitate i de activitatea biologic, fig.10.18.a, [87]. Mobilitatea , se definete similar, ca fiind raportul dintre viteza unui segment proteic v, per intensitatea cmpului electric aplicat din exterior, E, deducndu-se formula:

 = v/E = Q/{6() r}

(10.8)

unde se poate constata c mobilitatea crete cu sarcina global Q, i scade cu raza r a proteinei globulare, depinznd de asemenea de coeficientul de vscozitate . Ca aplicaie la acest studiu se poate observa electroforeza Acidului Dezoxiribo Nucleic (ADN) n fig.10.18.b.

(a)

(b)

Fig. 10.18. (a) Electroforeza unui lan proteic este influenat i de ncrctura electric a segmentelor proteice, dar i de masa lor; (b) exemplu electroforeza ADN-ului.

Micropipetele sunt alte intrumente clasice miniaturizate, fig.10.19.

Fig. 10.19. Micropipete: (a) de dimensiunea firului de pr; (b) pentru manevrri ale organitelor celulare

Pentru a manevra membrana unei celule vii, se utilizeaz o micropipet ca n fig. 10.19.b. Dup o nclzire bine controlat a unui tub capilar de sticl sau cuar cu diametrul de aproximativ 1 m se plaseaz pe membran. Dup rcire, prin conracia aerului din capilar se poate trage de celul. Pentru a msura activitatea celular a celulelor miocite prelevate de la broasc, cercettorii au utilizat o micropipet ca n figura 10.20, [87]. Este necesar un contact foarte bun pipet-celul pentru msurtori corecte (spre exemplu msurtori ale deschiderii canalelor ionofore de pe pereii celulari). Acest contact este obinut prin suciune, cnd celula miocit (prezentat n stnga) este prins de pipet.

Fig. 10.20. Micropipete ce acioneaz asupra membranei unei celule miocite.

10.9. Analiza rspunsurilor neliniare ale biosenzorilor

Deoarece biosenzorii conin elemente traductoare active n combinaie cu receptori biologici, este de ateptat ca rspunsul lor s fie neliniar. n figura 10.21. este prezentat rspunsul tensiune - concentraie de uree a unui senzor cu Ir/Pd pe capacitor MOS, raportat de Winquist n 1985, [88]. Analitul msurat aici este ureea sangvin. Se observ c rspunsul senzorului prezint o pant de aproximativ 0,7mV/mol/l ntre 1...20mol/l concentraie de analit. La concentraii mari de uree se constat o drastic scdere a sensibilitii senzorului (explicat prin creterea pH-ului n stratul de receptori enzimatici). ntruct nsi productorii acestui senzor constat comportri diferite la nivele "mari" i nivele "mici" ale concentraiei de analit, ar fi de dorit: 1) modelarea acestui rspuns neliniar; 2) stabilirea unei granie (unei concentraii de prag) ntre cele dou nivele. Pentru a nu fi tributari nici unei convenii, cea mai general metod, pentru aflarea concentraiei de prag, ar fi aplicarea teoremei conduciei electrice neliniare.

35 Tensiune ( mV ) 30 25 20 15 10 5 0 0 50 100 150 200 250 300 Conce ntratie ure e (um ol / l ) V_experim. V_analitic

Fig. 10.21. Dependena experimental tensiune-concentraie de uree (dup Winquist [88]); alegerea unui model analitic prin metoda celor mai mici ptrate (curba punctat).

n acest scop, pentru rspunsul experimental din fig. 10.21, a fost ales ca model de fitare relaia (2.81):
V ( c) = a c 1 + c

, c>0

(10.9)

unde V este tensiunea msurat, c - concentraia de analit (uree), - are semnificaia unui factor de atenuare a sensibilitii la nivele mari ale concentraiei de analit, - un parametru ce caracterizeaz neliniaritatea receptorului i a - un factor ce caracterizeaz nivelele mici ale concentraiei de analit. Observaie: Curba experimental din figura 10.16 a fost trasat prin interpolare (cu funcii splain de gradul I), iar curba analitic a fost trasat prin metoda curbelor de regresie, adoptnd criteriul celor mai mici ptrate. ntrebare: n ce const interpolarea i n ce const metoda curbelor de regresie? Cnd se folosete fiecare metod pentru trasarea unei curbe? Indicaie: Interpolarea traseaz graficul funciei prin punctele date, dar ne foreaz mna la anumite forme standard pentru funcie. Regresia traseaz graficul printre punctele date i putem alege noi modelul funciei. Alegnd un criteriu de regresie (spre exemplu metoda celor mai mici ptrate), obinem parametrii modelului ales de noi. Din criteriile de regresie ale curbei analitice au rezultat urmtoarele valori pentru parametrii de model: a=0,95mV/mol/l, =0,098(mol/l)-0,78, =0,78. Deoarece modelul (10.9) ales pentru rspunsul biosenzorului se supune condiiilor TCEN (vezi clasa acestor funcii prezentate n paragraful

2.7) se poate aplica direct rezultatul (2.85) pentru determinarea concentraiei de prag:
1 cT =
1/

(10.10)

Rezult cT=19,01717mol/l. Aflarea unei granie cT, poate fi un avantaj pentru descompunerea domeniului de msur n dou game: una cu sensibiliti mari (pentru c<cT) i una cu sensibiliti mici (pentru c>cT). n figura 10.22 sunt prezentate rspunsurile curent-concentraie de Oxigen nregistrate de un Microbial-FET ce conine microorganisme productoare de oxigen: Bacillus Subtilis i Trichosporon Cutaneum, [89].
600 1400

500

1200

1000 400

Curent Id ( n A )

Curent Id ( nA )

300

I(nA) Bacillus Subtillis

800

I calc(nA) Bacillus Subtillis 200

600 Im as(nA) Trichosporon cutaneum 400 Icalc(nA) Trichosporon cutaneum

100 200

0 0 50 100 150 200 250

0 0 50 100 150 200 250

mg

O2/l

mg

O2/l

(b) (a) Fig. 10.22. Curbe experimentale i analitice pentru rspunsul unui microbial-FET: (a) necesar depistrii Bacillus S.; (b) necesar depistrii Trichosporon C.

Celulele de Bacillus S. i Trichosporon C. au fost fixate cu un strat de nitroceluloz n poarta tranzistorului. Aceste microorganisme au fost puse n contact cu o soluie coninnd glucoz. Prin metabolismul lor, ele au generat oxigen, a crui cantitate a fost msurat. S-a adoptat tot modelul analitic (10.9). Au rezultat urmtorii parametri de model de fitare: Pentru Bacillus S. : a=18nA/mg, =2,8*10-2(mg/l)-1, =1. Pentru Trichosporon C.: a=15nA/mg, =9,9*10-3(mg/l)-0,94, =0,94.

Prin aplicarea rezultatului (2.85) au rezultat conform TCEN urmtoarele concentraii de prag: cT-BacillusS=35,71mgO2/l, cT-TrichosporonC=135,61mgO2/l. Aceste exemple vor s arate c teorema conduciei electrice neliniare poate fi aplicat i n cazul biosenzorilor. Valorile concentraiilor de prag ce rezult din aceast teorem pot reprezenta granie utile, ce despart domeniile de msur n dou game - cu sensibilitate mare i cu sensibilitate mic.

10.9. Perspective de cercetare n domeniul bioelectronicii

O direcie vizeaz continuarea combinaiei de succes dintre biotehnologie i microelectronic. Se urmrete integrarea pe acelai cip a biosenzorului i a sistemului digital de prelucrare a semnalului. Scopul ar fi obinerea unor actuatoare integrate complet i controlate de nivelul analitului n snge. S-ar putea realiza actuatoare, care s furnizeze automat anumite medicamente n snge, sau micropompe de declanare a dializei, [2]. O alt direcie de cercetare se bazeaz pe observaia fcut de Scheller [2] n legtur cu procesarea de semnal fcut la nivel enzimatic. Exist dou tipuri distincte de enzime ce pot realiza suma matematic a semnalelor generate de doi senzori distinci [2]. De asemenea, s-a realizat diferena i produsul de convoluie a dou semnale cu ajutorul a dou enzime distincte. Dac acest lucru va fi fcut n viitor la o scal mic de integrare i cu o vitez de rspuns superioar circuitelor digitale, vom asista n viitor la dezvoltarea biocalculatoarelor. Modelarea rspunsurilor biosenzorilor prezentat aici este doar o provocare. Dac un biosenzor are un comportament neliniar, cu att mai mult un organism viu are. Modelarea rspunsurilor n lumea biologic i n special n medicin este un teren neatins nc. Utilitatea lor ar fi imens. Un exemplu: medicul analizeaz rspunsul unui electrocardiograf doar calitativ. Acest rspuns s-ar putea modela cu parametri ce ar indica elasticitatea vaselor de snge, timpi de comutaie, amplitudini - parametri ce ar putea duce la un diagnostic optimizat. Aplicaii ale TCEN sunt interesante mai ales n analiza rspunsurilor lumii vii. Spre exemplu, dozarea medicamentelor ar putea fi fcut pe baza stabilirii concentraiei de prag. Organismul uman prezint o anumit reactivitate biologic la un medicament. Dac se administreaz n concentraii prea mici, organismul nu "simte" nimic. Peste o doz "prag"

reactivitatea ncepe s se fac simit. n viitor s-ar putea dovedi o reactivitate chiar i sub prag. Parial s-a demonstrat acest lucru. Scznd concentraia medicamentului foarte mult, s-a ajuns la stabilirea unor diluii foarte nalte (homeopatice), la care reactivitatea organismului crete din nou. Aceste concentraii, sau n cellalt caz, diluii prag, ale unor medicamente, ar putea fi extrase cu TCEN. Dezvoltri n direcia electrofiziologiei. Proprietile fundamentale ale neuronilor constau n generarea i conducerea impulsurilor electrice nervoase. Un stimul cu intensitatea sub prag nu se propag. Asemnarea conduciei electrice intraneuronale cu dispozitivele MOS este frapant. ntre doi neuroni conducia se face prin intermediul mediatorilor chimici i a neurotransmitorilor (substane ca acetilcolina, dopamina etc). Iat de ce aceste substane sunt att de intens cercetate cu ajutorul biosenzorilor. Dar nu numai neuronii, ci toate celulele au comportamente electrice: conducia prin canalele ionofore, ncrctura electric a mediului micelar, electroforeza proteinelor sunt doar cteva exemple. De asemenea, deosebit de interesant ar fi modelarea n domeniul electronicii celulare i a transmiterii semnalelor biologice. Exist o transmisie la nivel intracelular (prin mesagerii secunzi spre receptorii nucleari), o transmisie intercelular (prin circulaia sangvin a analiilor) i apoi o transmisie global ntre organe. Electrofiziologii au avansat mult n ultimele decenii, reuind prin observaii directe s explice unele fenomene electrice ce apar n funcionarea celulelor. i instrumentele puse la dispoziie de nanotehnologii i-au ajutat. ns ceea ce lipsete n acest domeniu este modelarea. O stpnire cantitativ a fenomenului la nivel celular i apoi global, ar fi cheia unei medicini moderne. Este de ateptat ca aceast modelare s fie extrem de dificil, ntruct organismul are diverse metode de adaptare printr-un numr extrem de mare de feed-backuri. De aceea ele trebuie s debuteze treptat: mai nti la nivel celular i n cele din urm la nivelul ansamblului organismului viu. Prerea personal a autorului acestei cri este c n viitor vom asista la o convergen a tiinelor ntr-un mod surprinztor. Dac n trecut, materia acestei lumi a fost studiat din unghiul chimistului, al fizicianului, al biologului, al electronistului, astzi asistm la o superspecializare pe domenii extrem de nguste: electroniti specializai doar pe tranzistoare SET, sau doar pe nanotuburi de carbon, ori biologi care studiaz doar un anumit organit celular. Ironia soartei este c electronistul care aprofundeaz mult nanotuburile le redescoper printre proteinele din canalele ionofore celulare, iar biologii sunt forai s dea explicaii despre fenomene electrice

celulare. Probabil c doar conlucrarea acestor cercettori va asigura succesul n viitor.