Sunteți pe pagina 1din 11

Carmen Lidia Chiescu & Anca icolau Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

Year 4, o. 2. ov. 2010

Contaminarea produselor alimentare cu reziduuri de antibiotice din clasa


sulfonamidelor, un risc ce poate fi evitat

Contamination of food with residues of antibiotics in the sulphonamide


class, risk can be avoided
1 2
Carmen Lidia Chiescu , Anca Nicolau
1 2
S.C. Pasteur, Filiala Filipesti, Universitatea Dunarea de Jos, Galati

Rezumat

Sulfadimetoxina, sulfametoxazolul, sulfaquinoxalina si sulfadiazinele sunt cele mai folosite sulfonamide in


medicina veterinara. Daca perioada de asteptare nu este respectata, produsele de origine animala pot fi
contaminate cu reziduuri din aceste substante. Interesul pentru detectarea acestor reziduuri este foarte actual.
In acest studiu este dezvoltata o metoda pentru analiza simultana a acestor patru substante in tesut muscular
de pui, prin cromatografie de lichide de presiune inalta.
Criteriile de validare ale metodei: specificitate, acuratete, liniaritate, limite de detectie si cunatificare
respecta recomandarile Deciziei Comisiei Europene 2002/657/EC, si demonstreaza ca metoda poate detecta
si cunatifica reziduuri din sulfonamidele amintite fara analiza prin spectrofotometrie de masa sau derivatizarea
fluorescenta a analitilor. Totodata, metoda este simpla si economica.
Sulfonamidele au fost extrase din matricea biologica cu acetonitril, acetona si diclormetan. Indepartarea
grasimilor s-a realizat prin extractie cu n-hexan.
Separarea cromatografica s-a realizat cu ajutorul unei coloane de separare tip C18, folosind o faza
mobila compusa din 75:25 = di-natriumhydrogenphosphat solutie 6 g/ 1000 ml (pH = 8.5) : metanol.
Detectorul UV a fost setat la 254 nm. Curbele de calibrare arata o buna liniaritate, pe domeniul de
concetratie 0.320 la 1.5 g /mL. Limita de cuantificare (LOQ) este sub MRL, iar coeficientul de recuperare
pentru matrice imbogatita in intervalul 50-150 g/kg, este mai mare de 70%. Coeficientul de variatie al
repetabilitatii pe domeniul de concetratie 50-150 g /kg este de sub 15%.
Aplicabilitatea metodei a fost demonstrata.
Cuvinte cheie: sulfonamide, analiza HPLC, reziduuri, hipersensibilitate, perioanda de asteptare.

Abstract

Sulfadimethoxine, sulfamethoxazole, sulfaquinoxaline and sulfadiazine are the most common used
sulfonamides in veterinary practice. The recommended withdrawal periods if not observed before slaughtering
of the medicated animals, the products may obtain from such animals may be contaminated with residue. The
interest in having reliable methods able to detect low amounts of sulfonamides in food is very actual. In this
study, a multiresidue analysis was performed to simultaneously determine those four sulfonamides in chicken
muscle tissue by the Waters LC.
Criteria of validation: specificity, accuracy, precision, limit of detection, limit of quantification, and linearity,
according to the European Commission Decision 2002/657/EC, show that the method can detect different
kinds of sulfonamides within one run, without mass spectrometry analyses, or Fluor metric derivatization of
analyts.
The method is accurate, simple, economical in both time and cost, capable of detecting sulfonamides
residues below the maximum residue limits (MRL) and easy to perform to routine samples, in normal condition
of laboratory.
The sulfonamides were extracted with acetonitrile and acetone and dichloromethane. N-hexane was
added for defeating the sample. Separation was carried out on a Zorbax SB- C18 analytical column, using as
mobile phase a mixture of 75:25 = di-natrium-hydrogenphosphat solution 6 g/1000 ml (pH = 8.5) : methanol.
The detection wavelength was set at: 254 nm Calibration graphs were linear with very good correlation
coefficients in the concentration range from 0.320 to 1.5g /mL. The limits of quantification (LOQ) for the
sulfonamides were in the range of 6.60.34 g /kg. The recovery for spiked chicken muscle with 50150 g
/kg ranged more than 70%. The relative standard deviation (Reds) of the sulfonamides for six measurements
at 50 go/kg, 100 g /kg and 150 g /kg was less then 15%.
The applicability of the method to the analysis of chicken muscle tissue was demonstrated.
Cuvinte cheie: sulfonamides, HPLC analyses, residues, hypersensitivity, withdrawal times.

Introducere administrare si eficacitatii lor. Insa, odata cu


utilizarea acestora a aparut posibilitatea
Substantele antibacteriene din clasa introducerii de reziduuri din medicamentele
sulfonamidelor sunt folosite pe scara larga in folosite in lantul alimentar.
medicina veterinara, in vederea mentinerii Depasirea limitei maxime de reziduuri
starii de sanatate a efectivului de animale, pentru sulfonamide este frecventa si astazi in
datorita costului scazut, usurintei in toata lumea (4, 5).

1
Carmen Lidia Chiescu & Anca icolau Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

Year 4, o. 2. ov. 2010

Cea mai mare depasire a nivelului legal cu imbunatatirea metodelor analitice, limitele
de sulfonamide in tesuturi a fost raportata in de toleranta au scazut din ce in ce mai mult,
1970 in SUA, insa in ultimii 25 ani obligand producatorii la perioade de asteptare
sulfonamidele au produs mai multe incalcari foarte lungi.
ale limitei maxime de reziduuri admise, decat Pentru a corecta aceasta problema s-a
oricare alt grup, cu incidenta cea mai mare la adoptat notiunea de toleranta neglijabila.
porcine, urmata de bovine si pasari (2). In lumina acestei noi politici, datele cerute
In 1988 intr-un studiu facut pe probe de pentru aprobarea fabricatiei de medicamente
lapte in America, 71% din probele testate din se limitau la studii subcronice pe caini si
ferme si magazine au fost pozitive pentru soareci. In general limita de toleranta era
antibiotice din care 63% au fost tetracicline si fixata la 0,1 ppm in toate tesuturile
sulfonamide (10). comestibile (1).
Intre 1992-1995 s-a inregistrat o depasire La fel ca politica toleranta zero si politica
a nivelului maxim cu 2,2-5,4% in Elvetia toleranta neglijabila nu era bazata pe
(Roland et al. 1996, cit. 18), cu 5,2-11,3 in UK analiza riscului medicamentului respectiv.
(Kay and Penny, 1996, cit.18), cu 0,2-1,3% in Aceasta discordanta a fost remediata prin
Canada (Neidert and Sachenbrecker, 1996, adoptarea de proceduri pentru analiza
cit. 18) si 0,3-5,6 in USA (18). riscului, bazate pe studii de toxicologie,
Un raport al Comisiei Europene din 2003 farmacocinetica.
a indicat grupul sulfonamidelor ca fiind cel In iunie 1990 in Europa Council
mai contaminant pentru produsele alimentare. Regulation (EEC) No 2377/90 adopta
Nu intotdeauna cauza este nerespectarea procedura pentru stabilirea limitelor maxime
timpului de asteptare la animalele tratate. de reziduuri in produsele alimentare de
Cercetarile au aratat ca si cantitatile origine animala si MRL pentru aproximativ 80
foarte mici 1g sulfametazina / tona de hrana substante (22).
produc reziduuri in ficat, 2 g sulfametazina/ Se definesc in lumina acestui regulament
tona de hrana produc depasiri ale nivelului notiunile de: reziduu si limita maxima de
maxim admis in ficat iar 8 g sulfametazina/ reziduuri (23).
tona de hrana produc depasiri ale nivelului Pe plan international, Codex Alimentarius
maxim admis in muschi si peste 400 g/kg in Comision adopta Code of Practice for
ficat (18). Control of the Use of Veterinary Drugs
Contaminarea hranei poate conduce (CAC/RCP 38-1993), Guidelines for the
asadar la prezenta reziduurilor de Establishment of a Regulatory Programme for
sulfonamide in carne si organe. In 2003 o Control of Veterinary Drug Residues on
monitorizare a nivelului concetratiei pentru Foods (CAC/GL 16-1993), Codex Maximum
diferite antibiotice in lapte au aratat ca dupa Residue Limits for Veterinary Drugs, precum
antibioticele -lactamice, cele mai multe si alte recomandari privitoare la monitorizarea
depasiri ale incalcarii nivelului maxim admis o reziduurilor, metodele oficiale de analiza,
au sullfonamidele, iar la monitorizarea principii si ghiduri de analiza a riscului (24,
antibioticelor in carne, sulfonamidele s-au 27, 29).
situat pe locul trei dupa peniciline si Totodata EMEA (European Medicines
tetracicline. Studiul a fost realizat in America Agency) impune fabricantilor de medicamente
de FDA Milk Drug Residue, si FSIS Meat prin Notice to applicants Veterinary medicinal
Residue Monitoring (10). products - 2004 efectuarea de teste de
Cerintele si recomandarile in ceea ce siguranta si reziduuri pentru fiecare produs
priveste siguranta alimentara s-au schimbat medicamentos in parte, tinand cont nu numai
de-a lungul anilor. Initial producatorilor de de substanta activa ci si de formula
medicamente veterinare li s-a impus farmaceutica si excipientii acestuia,
conceptul de zero reziduuri, iar timpul de determinarea timpului de asteptare si
asteptare impus era foarte mare. Metodele de inscrierea acestor informatii pe eticheta si
analiza nu erau insa la fel de performante ca prospectul produsului, transpus in practica
azi, asa incat limita zero era de fapt, limitele prin Ordinul nr. 187/2007 din 31/10/2007,
de detectie si cuantificare ale metodei (1). pentru aprobarea Normei sanitare veterinare
Acest concept a fost imbratisat atat de privind Codul produselor medicinale
consumatori, cat si de politicieni, dar mai veterinare (26).
putin de fabricantii de medicamente In tara noastra Ordinul nr. 95 din 2 aprilie
veterinare si de crescatorii de animale. Odata 2007, privind Aprobarea Normei sanitar

2
Carmen Lidia Chiescu & Anca icolau Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

Year 4, o. 2. ov. 2010

veterinare i pentru siguranta alimentelor - prima faza a metabolismului implica


privind msurile de supraveghere i control a monooxigenazele citocromului P450 care
unor substane i a reziduurilor acestora la catalizeaza reactii de N- si C- hidroxilare.
animalele vii i la produsele de origine Aceste enzime insereaza atomi de oxigen
animala, stabilete msuri concrete pentru in molecula substantei folosind electroni
monitorizarea reziduurilor (25). donati de NADPH via citocrom NADPH
Prin definitie sulfonamidele sunt reductaza. Sistemul enzimatic este localizat
substante care contin in molecula lor o in membrana reticolului endoplasmatic si este
grupare sulfanil si o grupare aminica. alcatuit din mai multe componente proteice
Sulfonamidele antimicrobiene (sulfanil- dintre care cea mai importanta este CYP 450
amidele) sunt derivati ai p-aminobenzen datorita rolului sau in activarea oxigenului si
sulfonamidei substituiti la functia amidica (N4) legarea substratului.
sau la functia aminica (N1). Explicatia Reactiile catalizate de citocromul P450
biochimica a actiunii antibacteriene o sunt: hidroxilarea alifatica, hidroxilare
reprezinta similitudinea structurii chimice cu aromatica (cu obtinerea de obicei a unor
ac. paraaminobenzoic, care determina produsi fenolici), reactii de epoxidare si
inhibitia competitiva a tetrahidropteroic acid dezalchilare, desaminare, reducerea
sintetazei bacteriene (fig. 1). nitroderivatilor cu formarea anilinei, reactii de
Aceasta enzima catalizeaza reactia dintre hidroliza;
acidul paraaminobenzoic si dihidropteroat - n faza a doua a metabolismului
fosfatul cu formarea acidului dihidropteroic, predomina reactiile de conjugare cu compusi
care este transformat apoi in acid dihidrofolic. polari ca glutationul, acidul glucuronic, acetil
Acesta este redus la acid tetradidrofolic, coenzima A, fosfoadenozilfosfat, cu
esential pentru diviziunea celulara a bacteriei, participarea unor enzime ca:
prin implicarea in sinteza purinei si pirimidinei. glutationtransferazei, N-acetiltransferazei, etc,
Datorita unei bune liposolubilitati, in care realizeaza conjugarea n vederea
general, absorbia sulfonamidelor se face eliminarii xenobioticului din organism.
aproape complet dup 3-6 ore de la Din pcate, n timpul acestor reacii se
administrare (dupa administrare oral). formeaza compui reactivi care cresc
Pe msura absorbiei crete concentraia toxicitatea si carcinogenitatea sulfonamidelor.
sulfamidei n sange si se mentine o perioada In principal, metabolizarea sulfonamidelor
mai mare sau mai mica la nivel terapeutic. in organismul animal se realizeaza cu
Biodisponibilitatea este intre 80-100%, concursul N-acetiltransferazei cu
valorile mai mari fiind pentru administrara transformarea intr-un compus acetilat netoxic.
parentala. Reactia de acetilare presupune initial
Distributia se face rapid n toate esuturile acetilarea enzimei, urmata de aditia
i fluidele organismului, incluznd SNC, bila, substratului si apoi de transferul grupei acetil
lichid sinovial prin legarea cu proteinele la substrat.
plasmatice. O parte din doza absorbita se
Oricum distributia unei sulfonamide in metabolizeaza sub forma unor metaboliti
mod individual depinde de mai multi factori: hidroxilaminici reactivi implicati in reactiile
constanta de disociere, liposolubilitatea adverse si in toxicitatea acestor compusi.
substantei, capacitatile de legare cu Proportia metabolitilor este diferita de la o
proteinele (specifice speciei). specie la alta. De exemplu, in timp ce la
Concentratia plasmatica la mamifere este pasari doar 6-20 % din sulfonamide se
intre 6-8.5g/dL. metabolizeaza prin acetilare, la porc calea
Metabolizarea sulfonamidelor in majoritara de biotransformare este acetilarea
organismul animal include conjugari la pozitia (5, 12, 16).
N4 (grupari acetil, sulfat, acid glucuronic, Excretia se face prin rinichi sub forma
glucoza) sau la pozitia N1 (sulfat sau acid nemodificata sau metaboliti prin filtrare
glucuronic), formarea de desaminometaboliti glomerulara.
prin indepartarea gruparii p-amino (hidroliza) Eliminarea sulfonamidelor este variabila
si apoi conjugarea produsilor de hidroliza (9). in timp, in functie de compus, forma
Reaciile enzimatice care servesc farmaceutica si specia animalului.
metabolizarii xenobioticelor sunt n general Totodata proportia de metaboliti si
impartite in doua faze: substanta netransformata eliminata este
diferita de la specie la specie.

3
Carmen Lidia Chiescu & Anca icolau Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

Year 4, o. 2. ov. 2010

La psri sulfonamidele se pot elimina i capacitatea de acetilare a fiecarui organism


prin ou, att n albu ct i n glbenu (16). (si aici se deosebesc fenotipul uman al
Deasemenea, laptele animalelor tratate acetilatorilor lenti si cel al acetilatorilor rapizi),
contin reziduuri de sulfonamide (2). o parte din cantitatea absorbita este
Variatia parametrilor farmacocinetici metabolizata pe cale oxidativa prin
(timpul de injumatatire, volumul distributiei, intermediul citocromului CY450, la nivelul
clereance, biodisponibilitate, etc) poate fi limfocitelor si microzomilor ficatului (figura 1).
evaluata prin modelare matematica. Pe aceasta cale se produc metaboliti
Efectul toxic pentru oameni se explica hidroxilaminici si nitrozoderivati reactivi, toxici,
prin mecanismul de metabolizare a acestor identificati prin studii in vivo, in urina a unui
substante. grup de voluntari (subiecti umani sanatosi)
Sulfonamidele sunt metabolizate in primul tratati cu sulfametoxazol.
rand prin acetilare, insa in functie de
O

H2N S NH R
Metabolit acetilat non-toxic
O NAT
Sulfonamide

CYP 450

NAT
N-acetoximetabolit reactiv

Legaturi covalente

Metabolit hidroxilaminic reactiv


Heptene

Conjugare

Metabolit non-toxic Toxicitate celulara

Nitrozo-sulfonamide
Raspuns imunologic IgE

Eliberarea mediatorilor histaminici

Toxicitate celulara Simptome clinice

Carcinogenitate

Figura 1. Metabolizarea sulfonamidelor cu formarea de metaboliti reactivi toxici

Citotoxicitatea acestor compusi rash-uri tegumentare minore (inclusiv maculo-


hidroxilaminici asupra limfocitelor umane a papulare si reactii de tip pruriginos care apar
fost demonstratea prin studii in vitro (13). tipic dupa o saptamana de tratament), pana
Acesti compusi se detoxifica si se elimina la reactii severe sau care pun uneori in
prin conjugare in special cu glutation insa pericol viata pacientilor cum ar fi: eritemul
anumite categorii de populatie (pacientii cu multiform, sindromul Stens-Johnson i
HIV, copii), poseda cantitati mai mici de necroliza epidermica toxica.
glutation, asa incat acesti compusi reactivi se Reactiile severe de hipersensibilitate au
acumuleaza si apare efectul toxic. aparut mai frecvent dupa administrarea
Lista reactiilor adverse posibile la oameni sulfonamidelor cu actiune lunga.
este foarte lunga. Sulfonamidele folosite pentru profilaxia
Acesti compusi produc ocazional un malariei, pot da reactii alergice severe,
numar de reactii alergice (hipersensibilitate incluzand toxicitate hepatica si hematologica,
de tip I mediata de imunoglobulinele E), de la pe langa toxicitatea dermatologica (11, 14,

4
Carmen Lidia Chiescu & Anca icolau Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

Year 4, o. 2. ov. 2010

17). Si reactiile de fotosensibilizare sunt fenomen mai pregnant la prematuri. Ca


relativ frecvente la sulfonamide. urmare, sulfonamidele se acumuleaza in
Aproximativ 3% din populatie este organismul copilului si determina
afectata de reactii alergice la sulfonamide. hiperbilirubenie sau pot interfera cu glucoza-
Pacientii cu HIV manifesta in proportie de 6-fosfat de hidrogenaza in formarea NADPH
60% aceste reactii. si GSH (glutation).
Nu s-a raportat nici un caz de alergie la De asemenea metabolitii acetilati formati
sulfonamide datorat alimentelor de origine in corpul mamei sunt transmisi in lapte si
animala, insa manifestarile specifice ar fi greu contribuie la cresterea toxicitatii
de recunoscut la doze atat de mici. sulfonamidelor la prematuri (3).
In raportul JECFA 1995 se mentioneaza S-au raportat si cazuri mortale de icter
ca informatiile despre reactiile de (icter nuclear) la nou nascuti prematuri dupa
hipersensibilitate rezultate prin ingestia de administrarea la mama de sulfonamide, prin
tesuturi animale contaminate cu reziduuri de urmatorul mecanism: concentratia plasmatica
sulfonamide sunt extrem de dificil de obtinut. a bilirubinei (pigmentul biliar) este mentinut la
Totusi Comitetul recomanda ca MRL sa niveluri normale prin conjugare metabolica cu
fie standardizat la valori cat mai mici posibile, proteinele plasmatice (glucuronidare cu
in acord cu Ghidul de buna practica albumina)(3, 9).
veterinara. Se evalueaza in continuare riscul La nou nascuti acest mecanism nu este
de determinare a unor reactii alergice si complet dezvoltat (3).
efectele asupra sistemului imunitar al Bilirubina libera patrunde in sistemul
sulfonamidelor (22, 28). nervos central al nou nascutului si determina
Sulfonamidele pot produce de asemenea leziuni cerebrale.
complicatii hematologice severe, cuprinzand Administrarea sulfonamidelor face ca prin
agranulocitoza, anemia hemolitica si natura lor acida sa scoata bilirubina din
megaloblastica si trombocitopenia. Aceste combinatia cu albuminele, iar plasma cu
efecte pot fi mai mari la pacientii cu niveluri mari de bilirubina sa ajunga in SNC.
insuficienta renala (2, 13, 17). Totodata sulfonamidele impiedica
Anemia hemolitica este mai frecventa la glucuronidarea bilirubinei, conducand
pacientii cu deficit de glucozo-6-fosfat- deasemeni la niveluri crescute ale acesteia in
dehidrogenaza si la compusii cu durata lunga plasma. Intr-un studiu realizat la Centrul
de actiune. pentru Prevenirea si Controlul Bolilor din
Granulocitopenia este frecventa in special Atlanta au comparat 13.155 de femei care au
la pacientii infectati cu HIV, aparand la 10- nascut copii cu malformatii cardiace cu 5.000
50% dintre subiecti (13, 17). de mame ai caror copii au fost sanatosi (3).
Nu este permisa administrarea de S-au studiat efectele folosirii unui
sulfonamide la mamele nou nascutilor antibiotic inainte cu o luna de a ramane
prematuri sau la nou nascutilor cu insarcinata si la sfarsitul primului trimestru de
biperbilirubinemie sau deficit de glucoza-6- sarcina.
fosfat. Antibioticele cele mai folosite au fost:
Sulfonamidele trec prin bariera placentara penicilinele, eritromicinele, nitrofurantoinele,
in toate stadiile gestatiei, echilibrul intre sulfonamidele, cefalosporinele i quinolonele.
sangele mamei si al copilului se stabileste in Rezultatele studiului arata ca
general dupa 23 ore, iar concentratia in sulfonamidele sunt implicate in cel mai mare
sangele fatului este de 70-90% din numar de malformatii congenitale.
concentratia in sangele mamei (3, 20). Astfel, riscul de anencefalie, hipoplazia
Niveluri semnificative se gasesc in ventriculului stang, de a prezenta anomalii ale
sangele fatului si la cateva zile dupa nastere membrelor sau hernia difragmei este de 3,4
daca administrarea la mama s-a facut in ori mai mare, in cazul administrarii de
preajma termenului. sulfonamide la mama, dupa cum sustin
S-a demonstrat ca sulfonamidele trec in cercetatorii.
laptele mamei, chiar daca sunt absorbite de Unele sulfonamide inhiba prin mecanism
aceasta in cantitati mici, si pot afecta nou competitiv lactoperoxidaza si tiroid
nascutul prin alaptare (3, 20). peroxidaza, mediatori in sinteza hormonilor
Nou nascutul nu poate elimina tiroidieni, putand conduce la hipertiroidism.
medicamentul prin mecanisme metabolice de In plus fata de problemele precedente,
conjugare (acetilare si glucuronidare), sulfonamidele pot da uneori febra

5
Carmen Lidia Chiescu & Anca icolau Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

Year 4, o. 2. ov. 2010

medicamentoasa, boala serului si lupus - Guidelines for the Establishment of a


eritematos sistemic (hipersensibilitate de tip Regulatory Programme for Control of
III mediata de imunoglobulinele G) sau Veterinary Drugs Residues in Foods
toxicitate hepatica (inclusiv necroza). (CAC/GL 16-1993) (23).
Pe de alta parte datorita prezentei anilinei - Guidance for the Validation of Analytical
in structura lor sulfonamidele determina Methods Used in Residue Depletion Studies
toxicitate hemolitica. Methemoglobinemia si VICH GL49 (23, 30).
anemia hemolitica sunt principalele efecte O varietate de metode au fost utilizate
toxice ale derivatilor de anilina. pentru msurarea reziduurilor sulfonamide n
Derivatii hidroxilaminici patrund in materiale biologice, inclusiv:
globulele rosii, reactioneaza cu - cromatografia n strat subire (TLC),
oxihemoglobina, cu reducerea oxigenului la - cromatografia lichid de nalt
oxigen activ, transformand astfel gruparile performan (HPLC),
sulfhidril ale hemoglobinei in radicali liberi. - cromatografia de lichid - spectrometrie
Acestia reactioneaza cu proteinele de mas (LC/MS),
membranei celulare si modifica suprafata - electroforeza capilar de nalt
eritrocitelor, asa incat determina o reactie performan (HPCE),
imunologica din partea organismului, care - cromatografia n faz gazoas (GC), i
fagociteaza (in splina) globulele rosii - testul enzimatic imunosorbant (ELISA),
imbatranite si declanseaza astfel anemia - determinarea imuno biosenzor (BIA) si
hemolitica (8). - metodele microbiologice.
Inca din 1970 US Food and Drug Metodele instrumentale, cum ar fi
Administration (FDA) a trecut la studierea HPLC/MS si HPLC/MS-MS sunt sensibile i
toxicitatii acestor compusi. In 1990 acelasi specifice, dar sunt laborioase i necesita
organism a initiat procedurile de determinare aparatura foarte costisitoare.
a timpului de asteptare pentru sulfadimidina. Aceste metode sunt adecvate pentru
In februarie 1994 la sedinta Joint FAO / WHO confirmare, dar nu i pentru screening-ul de
Expert Committee on Food Additives un numr mare de probe.
(JECFA) au fost revazute studiile toxicologice Metodele microbiologice nu necesit
disponibile pana in acel moment si s-au echipamente atat de specializate, dar ele nu
recomandat limitele maxim admise pentru au o sensibilitate si o precizie suficienta. n
acesti compusi in produsele de origine prezent, TLC a fost aproape nlocuit cu alte
animala (27). analize instrumentale.
Metodele imunochimice, cum ar fi ELISA
Limita maxima de reziduuri pot fi simple, rapide i eficiente, cu
Limita stabilita pentru sulfonamide este sensibilitate i specificitate suficiente pentru a
de: 100 g/kg, pentru toate speciile si toate detecta molecule mici (18).
tesuturile. Metoda Oficiala (AOAC), folosete
Pentru evitarea contaminarii alimentelor derivatizarea i cromatografia de lichide cu
de origine animala fabricantii de detecie prin fluorescen (6, 7, 15).
medicamente de uz veterinar au obligatia sa Obiectiv
efectueze studii de depletie a reziduurilor si n acest studiu, este prezentata o analiz
de determinare a timpului de asteptare. multireziduu, efectuata pentru a determina
In sprijinul acestor studii exista o simultan patru sulfonamide n esutul
multitudine de metode de analiza a muscular de pui cu ajutorul cromatografiei de
reziduurilor de sulfonamide (18). lichide pe inalta performanta (HPLC) cu
Validarea acestora se realizeaza in detectie UV.
conformitate cu legislatia in vigoare: Sulfonamidele determinate au fost:
- Notice to applicants, Veterinary - sulfametoxazol sulfadimethoxina,
medicinal products, volume 6B, (29). - sulfaquinoxalina i
- Commission Decision 2002/657/EC - sulfadiazina, unele dintre cele mai
concerning the performance of analytical utilizate sulfonamide n uzul curent veterinar.
methods and the interpretation of results (19). Metoda este exact, simpla, economica
- Council Directive 96/23/EC, Concerning att n timp i costuri, capabila s detecteze
the performance of analytical methods and reziduuri de sulfonamide sub limitele maxime
the interpretation of results (21). de reziduuri (LMR).

6
Carmen Lidia Chiescu & Anca icolau Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

Year 4, o. 2. ov. 2010

MATERIALE I METODE Proba se agita 3 min pentru extragere si


se centrifugheaza la 3500 rpm pentru 10 min.
Aparatura: Supernatantul se colecteaza iar reziduul se
- Cutter/mixer, extrage din nou cu 10 ml de acetona.
- balanta electronica (KERN, Germany), Dupa omogenizare si agitare timp de 3
- centrifuga (Centra MP 4R, USA), minute, proba se centrifugheaza din nou.
- filter unit 0,45m i 0,2m (Whatman) Supernatantul se aduce peste acetonitril,
- piston-operated pipette 100-1000l iar faza organica se evapora aproape de sec
(Transferpette Brand, USA).
la 30C.
Sistem HPLC cu: Reziduul se reia cu 5 ml de diclormetan si
- detector UV (Waters m 96, USA), se extrage.
- auto sampler (Waters 717 Plus, USA), Se centrifugheaza la 3500 rpm, 10 min.
- doua pompe (Waters 510 i 590, USA). Se separa diclormetanul si se repeta
Coloana se separare: extractiile de inca doua ori unind extractele de
- Zorbax SB-C18, 5 m 4.6 250 mm, 5 diclormetan.
(Agilent Technologies, USA).
Se evapora extractele reunite la sec la
Standarde: 40C.
- sulfadimetoxina, Reziduul se reconstitute intr-un 1mL de
- sulfametoxazol (Sigma Chemical Co USA), 50% metanol in di-natriumhidrogenphosphat
- sulfaquinoxalina, i solutie 6 g/1000ml. Se adauga 2 ml hexan
- sulfadiazina (EDQM). pentru indepartarea pigmentilor si grasimilor,
Reactivi: se agita, se centrifugeaza la 3500 rpm, timp
- Acetonitril, de 15 min si se indeparteaza hexanul.
- HPLC grade (Lab-Scan, Poland), Solutia ramasa se filtreaza printr-un filtru
- metanol (Merck, Germany), de 0,2 - 0,45m si se injecteaza in sistemul
- n-hexane (Fluka- Switzerland), HPLC.
- di-natriumhydrogenphosphat HPLC Analiza HPLC:
grade (Merck, Germany), Faza mobila: 75 : 25 = soluie di-natrium-
- diclorometan HPLC grade(Chimactiv, Romania) hydrogenphosphat 6 g/1000ml (pH = 8.5):
- acetona HPLC grade (Chimactiv, Romania) i metanol (v/v).
- N-dymethilformamida (Fisher Scientific, UK). Debitul fazei mobile: 1 mL/min.
Prepararea solutiilor standard: Volumul de injectie: 20 l
Solutia standard stoc a fost preparata prin Lungime de unda detector: 254 nm.
dizolvarea a 100 mg din fiecare SA standard Durata analizei: 10 min
cu 100 ml N-dymethilformamida.
Solutiile standard sunt stabile 30 zile la Formula de calcul aplicat:
4C. Solutia standard continand amestecul g/kg sulfonamida = C x 1000 x 100 / R
celor patru substante active a fost preparata unde:
din cate 1ml din fiecare solutie stoc in 50ml C = concentratia masurata (g/kg).
solutie 50% metanol in solutie di- R = coeficientul de recuperare (%).
natriumhidrogenpospat 6 g/1000ml. Solutiile Validarea procedurii analitice:
de lucru au fost preparate in domeniul de Metoda propusa a fost validata in acord
concentratie 0.1-2 g/mL, prin dilutii cu faza cu prevederile Notice to applicant and
mobila. Solutiile s-au preparat in ziua folosirii. Guideline veterinary medicinal products, Vol
Matricile blanc au provenit de la pui care 8 si Commission Decision (EEC) No.
nu au primit anterior vreun tratament 657/2002, urmarind urmatoarele criteii:
medicamentos, proveniti de la Biobaza S.N. specificitate, precizie, acuratete, linearitate,
Institutul Pasteur. limita de cuantificare, limita de detectie.
Probele: depozitate in stare congelata la -
17C, pana la utilizare Curba de calibrare
Prepararea probelor: Pentru fiecare component s-a trasat in
Extractia sulfonamidelor s-a realizat domeniul de concentratie 0,320-1,50 g/ml.
utilizand o metoda modificata dupa Furusawa Pentru fiecare component s-a trasat
si Hanabusa, Stoev si Michailova (9, 10, 17). curba de regresie lineara.
Zece grame de proba omogenizata se Coeficienii de corelatie au avut valori
cantaresc intr-un tub de centrifuga si se cuprinse intre: 0.996760.999795, asa cum
adauga 20 ml acetonitril. reiese si din Tabelul 1

7
Carmen Lidia Chiescu & Anca icolau Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

Year 4, o. 2. ov. 2010

Specificitatea Repetabilitatea
a fost studiata analizand matrice blank si S-a demonstrat prin analizarea a cate 6
matrice imbogatita cu trei niveluri de probe de matrice imbogatita la trei niveluri de
concentratie (0.5, 1, 1.5 x MRL), pentru toti concetratie: 0.5, 1, 1.5 x MRL, calculandu-se
analitii, verificand existenta interferentelor in coeficientul de variatie, asa cum reiese din
fiecare regiune de interes. Tabelul 2. Coeficientul de variatie al
Peak-urile fiecarui analit, masurate la repetabilitatii pentru matricele imbogatite la
jumatatea inaltimii picului au fost in limitele 50 g/kg, 100 g/kg si 150 g/kg s-a situat
90-110% fata de picurile solutiilor standard, intre 7,8 si 13,5%.
iar timpul de retentie a fost identic cu o Acuratetea (regasirea) a fost determinata
toleranta de 5%. folosind matrice blanc imbogatita pe cele trei
niveluri de conentratie amintita, raportandu-se
REZULTATE I DISCUII cantitarea regasita la cantitatea cu care s-a
realizat imbogatirea probei.
Figurile de la 2 la 4 demonstreaza
Coeficientul de recuperare s-a situat in
specificitatea metodei prin suprapunerea
domeniul 69,8 84,23%, fata de concetratia
cromatogramelor probelor de matrice blank si
initiala, asa cum reiese si din Tabelul 3.
cele de matrice imbogatita.
Tabel 1
Ecuatii si coeficienti de corelatie
Retention Correlation
Component Equation
time coefficient, R
Sulfadiazine 2.5-2.6 Y = 8.30 . 104 . X + 3.22 . 102 0.998122
Sulfadimethoxine 3.8-3.9 Y = 7.58 . 104 . X + 1.38 . 104 0.999795
Sulfamethoxazole 2.7-2.9 Y = 6.15 . 104 . X + 1.57 . 103 0.996763
Sulfaquinoxaline 6.8-6.9 Y = 1.53 . 105 . X - 3.35 . 103 0.999749

0.020
s ulfadiazina - 2.700

s uldaquinox alina - 6.567

0.015
s ulfadim etox ina - 3.983
s ufam etox az ol - 3.159
AU

0.010

0.005

0.000

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.0 0 10.0 0
Minutes

Figura 2. Cromatograma unei solutii standard ce contine cei patru analiti: sulfadiazina, sulfametoxazol,
sulfadimetoxina and sulfaquinoxalina.

0.0003

0.0002
AU

0.0001

0.0000

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
Minutes

Figura 3. Cromatograma unei matrice blank.

8
Carmen Lidia Chiescu & Anca icolau Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

Year 4, o. 2. ov. 2010

s ulfadim etox ina - 3.983

suldaquinox alina - 6.567


s ufam etoxaz ol - 3.159
s ulfadiazina - 2.700
0.06

0.04
AU

0.02

0.00

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.0 0
Minutes

Figura 4. Cromatograma unei probe de matrice imbogatita cu 150g/kg si cromatograma unei matrice blank

Linearitatea: de trei ori deviatia standard, iar limita de


- 6 probe au fost imbogatite cu: 0.5, 0.75, cuantificare ca find media concentratiei
1, 1,25, 1,5 i 1,75 g/ml, din fiecare analitilor plus de zece ori deviatia standard.
analit. Limita de cunatificare a fost in limita a
- probele au fost analizate, calculandu-se 6.6-0.34 g/kg, mult sub MRLs. (Tabelul 5).
concetratia de analiti in fiecare proba. Limita de decizie (CC) si capacitatea
- -s-a trasat curba de lineritate de detectie (CC)
(concentratia practica, fata de Au fost calculate ca fiind media
concetratia teoretica). aritmetica:
Ecuatiile de linearitate si coeficientii de - a concentratiei analitului la nivel MRL plus
corelatie sunt prezentati in Tabelul 4. 1.64 x deviatia standard a repetabilitatii la
Limitele de detectie si de cuantificare = 5%(CC) si respective,
S-au determinat prin analizarea a unui - media aritmetica a concetratiei analitului la
numar semnificativ de matrice blanc (>20) cu nivel CC plus 1.64 x deviatia standard a
masurarea semnalului din zonele de interes. repetabilitatii la = 5%(CC) (Tabel 6).
Limita de detectie s-a determinat ca fiind
media artmetica a concentratie analitului plus
Tabel 2
Media si coeficientul de variatie al repetabilitatii
Tipul sulfonamidei
Nivelul de
Sulfadiazina Sulfadimetoxina Sulfamethoxazol Sulfaquinoxalina
imbogatire
Media Media Media Media
g/kg srel % srel % srel % srel %
(g/kg) (g/kg) (g/kg) (g/kg)
50 47.5 17.1 38.7 19.8 27.9 6.5 26.4 2.1
100 80.3 1.3 67.9 8 64.7 10.6 60.7 13
150 124.7 14.5 108.5 12.9 124.1 10 121.2 8.5
Media Srel (%) 10.9 13.5 9 7.8
Tabel 3
Media si deviatia standard relativ a recuperarii
Tipul sulfonamidei
Nivelul de Sulfadiazina Sulfadimetoxina Sulfamethoxazol Sulfaquinoxalina
imbogatire Media Media Media Media
g/kg recuperarii srel % recuperarii srel % recuperarii srel % recuperarii srel %
(g/kg) (g/kg) (g/kg) (g/kg)
50 86.1 9.05 83.4 10.3 73.08 8.1 75 6.8
100 80.3 1.3 67.9 8 64.7 10.6 60.7 13
150 86.3 10.05 80.58 8.8 71.6 17.5 79.3 8.92
Mean recovery 84.23 77.29 69.8 71.66
Tabel 4
Ecuatiile de linearitate si coeficientii de corelatie
Coeficienti
Component Ecuatie linearitate
corelatie,R
Sulfadiazina Y = 0.8242 X + 0.0245 0.9958
Sulfadimetoxinea Y = 0.00873 X - 0.0488 0.9834
Sulfamethoxazola Y = 0.8551 X 0.0652 0.9913
Sulfaquinoxalina Y = 0.8043 X 0.0806 0.9800

9
Carmen Lidia Chiescu & Anca icolau Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

Year 4, o. 2. ov. 2010

Tabel 5
Limita de detectie si cuantificare pentru cei patru analiti
Valoarea determinata
Tipul
Media LD LQ
sulfonamidei S
(g/kg) (g/kg) (g/kg)
Sulfadiazina 0.06 0.028 0.144 0.34
Sulfadimethoxina 0.15 0.07 0.36 0.75
Sulfametoxazol 0.45 0.045 0.58 0.9
Sulfaquinoxalina 6.5 0.01 6.53 6.6
Tabel 6
Limita de decizie (CC) si capacitatea de detectie (CC)

Sulfadiazina Sulfadimetoxina Sulfametoxazol Sulfaquinoxalina


CC / CC
104.64 109.02 111.31 112.95
108.5 121 119.3 125

CONCLUZII 5. Cordle, M.K. (1989). Sulfonamide Residues in


Pork: Past, Present and Future, J. Anim. Sci., 67:
1. In momentul de fata in Uniunea 2810-2816.
Europeana siguranta alimentului se 6. Furusawa, N., Hanabusa, R. (2002). Cooking
effects on sulfonamide residues in chicken thigh
bazeaza pe o evaluare cuprinzatoare a muscle. Food Res. Int. 35: 37-42.
riscului pe intregul lant alimentar. In cazul 7. Furusawa, N., Kishida, K (2002). A High-
alimentelor expunerea este subinteleasa performance chromatographic procedure for
iar riscul contaminarii acestora cu routine residue monitoring of seven sulfonamides
sulfonamide este evident datorita intensei in milk. Fresenius, J. Anal. Chem., 1002,
folosiri a acestor substante in practica 371(7):1031-3.
8. Hess, D. A., Sisson, M. E., Suria, H. Wijsman,
veterinara. J., Puvanesasingham, R., Madrenas, L. (1999).
2. Metoda prezentata a fost dezvoltata Cytotoxicity of sulfonamide reactive metabolites:
pentru a determina simultan reziduuri de apoptosis and selective toxicity of CD81 cells by
sulfadiazina,sulfametoxazol, the hydroxylamine of sulfamethoxazole. The
sulfadimethoxina si sulfaquinoxalina in FASEB Journal, Vol. 13, (October).
muschiul de pui prin analiza HPLC, dupa 9. Loghin, Felicia (2002) Toxicologie generala, Ed.
Medicala Universitara Iuliu Hateganu Cluj
extractie cu solventi organici. Napoca.
3. Metoda este simpla, rapida si economica. 10. Moller, G. (2000). Animal Drug Residues in Food,
4. Criteriile de validare impuse: specificitate, Food Toxicology, University of Ihado.
precizie, acuratete, limita de detectie si de 11. Montanaro, A. Naisbitt, D.J., Farrell, J.,
cuantificare, linearitate, au respectat Gordon, S.F. (1998). Sulfonamide allergy.
conditiile impuse de Decizia comisiei Immuno.l Allergy Clin. North Am., 18:843.
12. Reea, J.C. (1993). Preventing Sulfa Residues in
Europene 2002/657/EC, cu privire la Pork, University of Missouri Extension.
validarea metodelor de analiza. 13. Singh, H. Purnell, E., Smith, C. (2007).
5. Metoda poate detecta reziduuri de Mechanistic study on aniline-induced erythrocyte
sulfonamide, fara utilizarea toxicity, Arh. Hig. Rada Toksikol.; 58:275-285.
spectrofotometriei de masa sau 14. Slatore, C. G., Tilles S. A. (2004). Sulfonamide
derivatizarea fluorimetrica a componentilor hypersensitivity. Immuno. Allergy Clin. of North
Am. Vol. 24, Issue 3 (August).
6. Metoda propusa este foarte potrivita 15. Stoev, G., Michailova, A. (2000). Quantitative
pentru utilizare in studii de depletie si determination of sulfonamide residues in foods of
determinare a timpului de asteptare pentru animal origin by high-performance liquid
oricare din analitii prezentati. chromatography with fluorescence detection. J.
Chromatogr. 871:37-42.
BIBLIOGRAFIE 16. Tansakul, N. (2008). A sulfadimidine model
evaluate pharmacokinetics and residues various
1. Barlow, S.M. Greig, J.B. Bridges, J.W., concentration in hens, Inaugural Dissertation,
Carrere, A. (2002). Hazard identification by Hanover, 2008
methods of animal-based toxicology, Food and 17. Verdel, B.M. Souverein, P.C. Egberts, A.C.G.
Chemical Toxicology 40, 145-191. Leufkens, H.G.M. (2004). Diference in Risk of
2. Bevill, R.F. (2008). Sulfonamides residue in Allergic Reaction of Sulfonamide Drugs based on
domestic animals Journal of veterinary Chemical Structure, The Annals of
Pharmacology and Therapeutics, 1368-2885. Pharmacotherapy.
3. Blackburn, S.T. (2007). Maternal, fetal & 18. Wang, S., Zhang, H.Y. Wang, L. Duan, Z.J.,
neonatal physiology: a clinical perspective, Kennedy, I. (2006). Analysis of sulphonamides
Saunders Elsevier. residues in edible animal products: A review.
4. Cochrane, B., Doyle, E.M., Steinhart, C.E. Food Additives and Contaminants.
(1995). Food Safety, New York USA, p. 247.

10
Carmen Lidia Chiescu & Anca icolau Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

Year 4, o. 2. ov. 2010

19. ***Commission Decision 2002/657/EC concerning 25. ***ORDIN nr. 95 din 2 aprilie 2007, privind
the performance of analytical methods and the aprobarea Normei sanitare veterinare i pentru
interpretation of results. siguranta alimentelor privind msurile de
20. ***Committee on Drugs, American Academy of supraveghere i control al unor substane i al
Pediatrics. The transfer of drugs and other reziduurilor acestora la animalele vii i la
chemicals into human milk. Pediatrics; 93:13750. produsele de origine animala.
1994 26. ***Ordinul nr. 187/2007 din 31/10/2007, pentru
21. ***Council Directive 96/23/EC, Concerning the aprobarea Normei sanitare veterinare privind
performance of analytical methods and Codul produselor medicinale veterinare.
interpretation of result. 27. ***Recommended international Code of practice
22. ***European Union Regulation 1990. for control of the use of veterinary drugs
Establishment of Maximum Residue Levels of CAC/RCP 38-1993.
Veterinary Medical Products in foodstuffs of 28. ***Sulfathiazole (WHO Food Additives Series 25)
animal origin. Council Regulation (EEC) No. 29. ***The rules governing medicinal products in the
2377/90. Official Journal of the European European Union October 2005, Volume 8-Notice
Communities. No. L 224, Brussels, 1990. to applicants and Guideline-Veterinary medicinal
23. ***Guidance for the Validation of Analytical products: Establishment residue limits (MRLs) for
Methods Used in Residue Depletion Studies residues of veterinary medicinal products in
VICH GL49, U.S. Department of Health and foodstuffs of animal origin.
Human Services Food and Drug, Administration 30. ***Validation Requirements for Testing for
Center for Veterinary Medicine, April 9, 2010. Residues of Veterinary Drugs, James D. McNeil,
24. ***Guidelines for the Establishment of a Saskatoon, Saskatchewan, Canada. Joint FAO-
Regulatory Programme for Control of Veterinary WHO Technical Workshop on Residues of
Drugs Residues in Foods (CAC/GL 16-1993). Veterinary Drugs without ADI-MRL - Bangkok, 24-
26 August 2004.

11