10/20/2017

Nutriia, metabolismul i
cultivarea bacteriilor

Creterea bacteriilor
reprezint mrirea dimensiunilor bacteriei, datorit sintezei
coordonate a tuturor constituenilor celulari, cu utilizarea unor
nutrieni din mediu i cu consum de energie
dependent de factori de mediu (disponibilitatea substanelor
nutritive adecvate, posibilitatea obinerii energiei necesare reaciilor
metabolice)
limitat de atingerea unui raport nefavorabil intre suprafaa si
volumul celular (in cursul creterii bacteriei scade suprafaa
disponibil unei uniti de volum)
volumul celular (reflect masa celular care utilizeaz nutrieni i produce
catabolii)
suprafaa celular (condiioneaz schimburile cu mediul extracelular:
absorbia nutrienilor i eliminarea produilor de catabolism)
este urmat de diviziunea bacteriei, cu restabilirea unui raport
favorabil suprafa/ volum

1
 10/20/2017

Multiplicarea bacteriilor
creterea numrului de celule dintr-o populaie bacterian
consecin a creterii bacteriene
se realizeaz prin diviziune (fisiune binar), din care rezult
dou bacterii identice
etape
1. replicarea cromosomului; ncepe de la originea replicrii (situs
ataat de membrana citoplasmatic) i continu bidirecional
2. separarea cromozomilor la poli opui ai celulei
3. formarea mezosomului septal i acumularea de perete celular,
cu realizarea septului transversal
4. separarea celor dou celule
planul/ planurile de diviziune determin dispunerea caracteristic a
bacteriilor (perechi, lanuri, grmezi etc)

Multiplicarea bacteriilor
creterea numrului celulelor dintr-o populaie bacterian; se
realizeaz n progresie geometric cu raia 2: 21, 22, 23, 24 .
2n (unde 1, 2, 3n nr de generaii)
Timpul de generaie = timpul necesar dublrii populaiei
(timpul dintre dou diviziuni succesive)
in condiii optime de cultivare este caracteristic unei specii
(determinat genetic)
difer de la o specie la alta: 10-20 minute (E. coli), 24 ore
(Mycobacterium tuberculosis)
Rata de cretere = nr de generaii in unitatea de timp
variaz in funcie de timpul de generaie i de condiiile de mediu

2
 10/20/2017

Metabolismul bacterian
cuprinde totalitatea reaciilor biochimice care au loc n
celula bacterian
reacii catabolice desfacerea unor compui organici cu
structur complex in compui simpli, cu eliberare
controlat de energie (stocat n compui macroergici)
reacii anabolice - biosinteza unor componente celulare
(structurale sau funcionale), realizat cu consum de
energie

Catabolismul bacterian
Catabolismul glucidic
Glicoliza
Ciclul acizilor tricarboxilici
Lanul transportului de electroni
Catabolismul lipidic oxidarea acizilor grai, glicerolului
Catabolism proteic

3
 10/20/2017

Nutriia bacterian
Nutriia = asimilarea subst. nutritive din mediul extern
Nutrieni = substane capabile s fie
1. absorbabile (s poat traversa membrana citoplasmic);
unele subst necesit in prealabil o digestie extracelular,
sub aciunea unor hidrolaze eliberate de bacterie
ex. - mecanisme de transport:
Difuzie simpl
Difuzie facilitat (de proteine carrier)
Transport activ, cu consum de energie
2. utilizabile in reacii metabolice

Necesiti nutritive
Clasificarea bacteriilor in funcie de
Sursa de energie
oxidarea unor substane chimice - bacterii chemotrofe
radiaia luminoas - bacterii fototrofe
Sursa de carbon
subst. organice (in principal glucide, dar i lipide, proteine)
bacterii heterotrofe (organotrofe)
bacterii autotrofe unica surs de carbon este CO2
(fotosintez); subst anorganice - bacterii chemolitotrofe

4
 10/20/2017

Clasificarea bacteriilor n funcie de

metabolismul energetic
Tipuri de metabolism energetic (mod de obinere a ATP)
metabolism respirator - fosforilarea oxidativ, care implic un
sistem de transport al electronilor i are ca acceptor final de
electroni
O2 respiraie aerob
alte molecule anorganice (SO4, NO3) respiraie anaerob
metabolism fermentativ fosforilarea unor substrate organice;
dup tipul produilor rezultai: fermentaie alcoolic, lactic,
butiric, propionic, acetoinic, acid mixt etc.

Clasificarea bacteriilor n funcie de

tipul respirator
Strict aerobe utilizeaz exclusiv respiraia aerob;
au enzime care transform H2O2 i O2- (compui
toxici rezultai din metabolismul aerob) n H2O i O2
Superoxid dismutaza 202 + 2H+ O2 + H2O2
Catalaza 2H 2O2 2H2O + O2
Peroxidaza H 2O2 + NADH + H+ 2H2O + NAD
Strict anaerobe utilizeaz exclusiv fermentaie (O2
este toxic pentru c bacteriile nu au superoxid
dismutaza, catalaza)

5
 10/20/2017

Clasificarea bacteriilor n funcie de

tipul respirator
Strict aerobe exclusiv respiraie aerob
Strict anaerobe exclusiv fermentaie
Anaerobe aerotolerante metabolism fermentativ, dar au
superoxid dismutaz, de aceea rmn viabile n prezena O2
Facultativ anaerobe pot utiliza metabolism respirator sau
fermentativ; majoritatea bacteriilor aparin acestui grup
Microaerofile cultiv numai n prezena unor concentraii
reduse de O2 (5-10%);
Carboxifile - cultiv numai n prezena unor concentraii
crescute de CO2 (5-10 %) i concentraii reduse de O2 (15%)

Clasificarea bacteriilor n funcie de

tipul respirator

Tip respirator Exemple

Strict aerob Pseudomonas aeruginosa,
Mycobacterium tuberculosis
Strict anaerob Clostridium perfringens,
Facultativ anaerob Majoritatea bact (ex.
Enterobacteriaceae)
Microaerofil Campylobacter, Helicobacter
Carboxifil Haemophilus influenzae, Neisseria
gonorrhoeae

6
 10/20/2017

Necesiti nutritive
Alte necesiti nutritive surse de
Azot subst organice (peptide, aminoacizi) sau anorganice (N2)
Sulf (sulfai),
P (fosfai anorganici)
Minerale Na, K, Ca, Mg, Cl, Fe, Mn

In funcie de complexitatea necesitilor nutritive bacterii

nepretenioase nutritiv capabile s-i sintetizeze toi compuii
necesari creterii si multiplicrii, pornind de la compui organici
simpli i minerale
pretenioase nutritiv (fastidioase) necesiti nutritive complexe/
specifice necesit mai muli factori de cretere

Factori de cretere
Multe bacterii de interes medical au devenit incapabile s-i
sintetizeze unii metabolii eseniali (aminoacizi, vitamine etc.);
Factor de cretere compus organic pe care bacteria nu l poate
sintetiza, dar care este indispensabil pentru supravieuirea
bacteriei.
factorii de cretere trebuie obinui din mediu, deoarece bacteria
nu are sau a pierdut capacitatea de a-i sintetiza; mutantele care
au pierdut aceast capacitate se numesc auxotrofe, fiind diferite
de tulpinile parentale, prototrofe, care erau capabile s
sintetizeze aceti compui
Ex Haemophilus influenzae necesit factorii de cretere X
(hemina) i V (NAD)

7
 10/20/2017

Cultivarea bacteriilor
proces prin care se asigur meninerea viabilitii i multiplicarea
unor bacterii, n afara mediului lor natural, n scop
diagnostic n laboratorul clinic
industrial n industria alimentar, farmaceutic etc
Supravieuirea, creterea i multiplicarea bacteriilor depind de
prezena n mediu a tuturor substanelor nutritive necesare i a
anumitor condiii fizico-chimice (temperatur, pH, osmolaritate
etc).
Cunoaterea acestor cerine permite alegerea condiiilor adecvate
de cultivare (mediu, condiii de incubare)

Cultivarea bacteriilor
Inoculare/nsmnare: punerea n contact a unui produs patologic sau a unei
culturi bacteriene cu un mediu de cultur;
Mediu de cultur: mediu care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice
necesare creterii i multiplicrii bacteriene;
Cultur bacterian: totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare pe / n
mediul de cultur, aglomerare de bacterii vizibil cu ochiul liber;
Tulpin bacterian: populaia microbian alctuit din descendenii unei
singure izolri n cultur pur;
Clon bacterian: populaia rezultat prin diviziunea unei singure celule; o
colonie bacterian este o clon.
Colonie: conglomerat de bacterii vizibil cu ochiul liber rezultat prin
multiplicarea unei celule bacteriene (sau grup restrans de bacterii = unitate
formatoare de colonii, UFC)
Cultur pur cultur constituit din bacterii de acelai fel
Repicare: trecerea unei singure colonii pe alt mediu de cultur cu scopul de a
obine o cultur pur

8
 10/20/2017

Medii de cultur
Cerinele unui mediu de cultur:
1. ofer substanele nutritive necesare bacteriilor (surs de N, C,
sruri minerale, factori de cretere)
2. ofer umiditatea optim pentru microorganisme
3. asigur condiii optime de aeraie sau condiii de anaerobioz
pentru anaerobi
4. sunt sterile
5. permit studierea caracterelor de cultur ale bacteriilor (ex. s fie
limpezi)

Medii de cultur
Criterii de clasificare
compoziie in nutrieni
simple (minimale) conin numai ingrediente de baz: ex
geloza simpl
imbogaite - cu adaos de snge, ser, ou etc. : ex geloza snge,
geloza socolat

9
 10/20/2017

Medii de cultur
Criterii de clasificare
modul de obinere
sintetice (preparate din ingrediente chimic pure)
empirice (preparate din extracte din produse animale);
peptona amestec de peptide i aminoacizi obinut prin
digestia partiala a unor proteine
Component Cantit Component Cantit
Glucoza 5g Peptona 5g
Fosfat Amoniu monobasic 1g Extract carne 3g
(NH4H2PO4) Clorura Na 8g
Clorura Na (NaCl) 5g Agar 15 g
Sulfat Magnesiu (MgSO4) 0.2 g Apa dist 1 litru
Fosfat K, dibasic (K2HPO4 ) 1g
Apa dist 1 litru

Medii de cultur
Criterii de clasificare
consisten
lichide
semisolide (cu 0,5% agar) pentru studierea mobilitii bact
solide (cu 2% agar) pentru izolarea bacteriilor
Agar - fitocoloid obtinut din alge marine, utilizat deoarece
menine solide mediile in intervalul 0 90 C: se topete la
98C, dar nu se solidific pn la 42 C (poate fi turnat la
temperaturi la care nu se degradeaz celulele);
nu este nutrient pentru bacterii
este clar permite examinarea culturii bacteriene

10
 10/20/2017

Medii de cultur
Criterii de clasificare
utilizare medii de
transport meninerea viabilitii unor bacterii n cursul
transportului probei
izolare izolarea unor bacterii, n general din produse
plurimicrobiene
identificare identificarea unei tulpini bacteriene pe baza
evidenierii unor caractere biochimice
conservare meninerea viabilitii unei tulpini bacteriene n
cursul stocrii pe o perioad limitat de timp

A. Medii de izolare
uzuale (geloza - sange) pt produse monobacteriene sau cu
flor asociat
selective conin ingrediente (antibiotice, colorani, sruri
biliare etc) care inhib multiplicarea unor bacterii i creaz
condiii pentru multiplicarea altora; favorizeaz izolarea
preferenial a anumitor specii din produse pluribacteriene
m cu selectivitate joas agar MacConkey inhib (prin coninutul n
sruri biliare) bact Gram pozitive i permite cultivarea bacililor Gram
negativi, pe care i difereniaz n lactozo pozitivi sau lactozo negativi
m cu selectivitate medie m Hektoen inhib bacteriile Gram pozitive i
unii bacili Gram negativi lactozo pozitivi, permit multiplicarea bacililor
Gram negativi lactozo negativi, pe care i difereniaz n H2S pozitivi sau
negativi

11
 10/20/2017

A. Medii de izolare
Mediile uzuale (ex geloza sange) i selective (ex agar MacConkey,
Hektoen) pot avea i caracter diferenial (tipul hemolizei, respectiv
fermentarea lactozei, producerea de H2S)

geloza sange agar MacConkey Hektoen

A. Medii de izolare
de imbogire m lichide care inhib selectiv flora de asociaie,
permit izolarea unor bacterii patogene existente n numr redus
n produsul pluribacterian
elective nu conin ingrediente inhibitorii, dar au o compoziie
care satisface necesitile nutritive ale unui numr limitat de
specii
difereniale nu conin ingrediente inhibitorii, conin substratul
pentru anumite enzime bact i un indicator care evideniaz
utilizarea substratului; permit diferenierea unor bacterii in
culturi primare

12
 10/20/2017

A. Medii de izolare
Tip Denumire Utilizare

Geloza sange Unele bacterii pretentioase

uzual
nutritiv
Mac Conkey Enterobacteriaceae

ADCL (agar, deoxicolat, Enterobacteriaceae

selectiv citrat, lactoza)
m cu telurit de K Corynebacterium diphteriae

m Chapman Staphylococcus

Bulion selenit Salmonella, Shigella

de imbogire
Apa peptonata alcalina Vibrio cholerae

B. Medii de identificare
conin substratul pentru anumite enzime bacteriene i un sistem
care indic metabolizarea substratului (ex reactiv care
interacioneaz cu un produs de metabolism, indicator de pH
etc)
medii multitest medii care identific simultan mai multe
caractere
TSI (triple sugar iron) evidentiaz fermentarea glucozei cu/fr
producere de CO2, fermentarea lactozei, producerea de H2S

13
 10/20/2017

Cultivarea bacteriilor
Anumii factori de mediu influeneaz metabolismul
bacterian, de aceea aceti parametri trebuie
controlai pentru a se asigura condiiile fizico-chimice
necesare bacteriilor
pH
presiune osmotic
temperatur
atmosfer

Factori de mediu care influeneaz

metabolismul bacterian
pH-ul
majoritatea bacteriilor de interes medical - pH optim 7-7,5
bact acidofile pH 5 5,5 (lactobacili)
Bact bazofile pH 8,5 9 (Vibrio)
Presiunea osmotic
Bact patogene prefer medii izotone cu mediul intern al
gazdei
Bact halofile medii cu concentratii crescute de saruri (ex. NaCl
> 2%): Vibrio parahaemolyticus

14
 10/20/2017

Factori de mediu care influeneaz

metabolismul bacterian
Temperatura - bacterii
mezofile - majoritatea bacteriilor de interes medical au
temperatura optim 30-37 C
psihrofile temp optim 5 15 C
termofile temp optim 50 60 C
hipertermofile temp optim aprox 100C

Factori de mediu care influeneaz

metabolismul bacterian
Atmosfera de incubare
Bact aerobe sau aerob-facultativ anaerobe aer
atmosferic
Bact anaerobe atmosfer cu O2 < 1%, CO2 10%,
recipiente inchise etan,
Bact microaerofile atmosfer cu 5% O2
Bact carboxifile - atmosfer cu 5% CO2

15
 10/20/2017

Cultivarea i izolarea bacteriilor n

cultur pur
Izolarea n cultur pur a bacteriilor din
produse plurimicrobiene prin nsmnare pe m solide, cu
epuizare n 3-4 cadrane
produse monobacteriene (mai ales paucibacteriene) prin
nsmnare n m lichide
bacterii sporulate - nclzire la 80 C (pentru distrugerea
formelor vegetative), apoi insmnare

Cultivarea i izolarea bacteriilor n

cultur pur
Metoda
nsmnarea (depunerea) unui volum redus (inocul) dintr-un
produs plurimicrobian este urmat de dispersia (epuizarea)
acestui inocul pe suprafaa mediului solid
incubare (timp n care au loc creterea i multiplicarea bacteriilor
n locul n care au fost dispersate).
Prin multiplicarea unei celule bacteriene (sau grup restrans de
bacterii = unitate formatoare de colonii, UFC) rezult o colonie.
Acolo unde prin dispersie au ajuns bacterii izolate vor rezulta
colonii izolate.

16
 10/20/2017

Aspectul culturii bacteriene

Medii lichide opacifierea mediului, apariia unui depozit
grunjos, producerea CO2, modificarea pH-ului etc.
Medii solide aparitia de colonii
Form de Aspect pe mediu solid Aspect pe Corelaii cu
cultur mediu lichid patogenitatea
S (smooth) Colonii rotunde, cu margini Suspensie In general produse
regulate, suprafa neted, omogen de bacterii patogene
lucioas
R (rough) Colonii cu margini neregulate, Depozit In general bacterii
suprafa rugoas, uscat grunjos nepatogene*
M Colonii mari, bombate, Bacterii capsulate
(mucous) lucioase, cu aspect mucos si
tendin la confluare
* excepii: Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis

Aprecierea cultivrii bacteriilor

Cantitativ (msurarea biomasei sau a concentraiei
bact) - metode
directe
numrarea bacteriilor (citometru n flux etc) estimeaz
nr total de bacterii
insmnarea unui volum dintr-un ir de diluii
estimeaz nr de bacterii viabile
indirecte
msurarea densitii optice (fotocolorimetru,
spectrofotometru) estimeaz nr total de bacterii
msurarea consumului de O2, a producerii de CO2 sau a
altor catabolii estimeaz nr de bacterii viabile

17
 10/20/2017

Aprecierea cultivrii bacteriilor

Msurarea turbiditii mediului
proportional cu numrul total de bacterii (vii si omorate)
metode
vizual ex comparare cu scala McFarland (set de suspensii
BaSO4 de diferite turbiditi)
automat

Dinamica multiplicrii bacteriene

se estimeaz evoluia biomasei sau a concentraiei
bacteriene in functie de timp
in condiii ideale de mediu multiplicare exponenial
cultur continu
n m lichide cu volum limitat cultur discontinu: 4
faze

18
 10/20/2017

Fazele multiplicrii bacteriene n

cultur discontinu
Laten
etap de adaptare a bacteriilor la un nou mediu de cultur
nr bacteriilor staionar (uneori scade)
crete activitatea metabolic bacterian
cresc dimensiunile celulelor bacteriene
sensibilitate crescut a bacteriilor la ageni antibacterieni
durat - variabil n funcie de specie, starea bacteriilor,
mediu

Fazele multiplicrii bacteriene n

cultur discontinu
Multiplicare exponenial (logaritmic)
are loc diviziunea bacteriilor
Timpul de generatie (n condiii optime de cultivare)
constant, caracteristic speciei
Citoplasm intens bazofil, fr incluzii (nu au subst. de
rezerv)
Sensibilitate crescut la ageni antibacterieni (in aceast
faz se realizeaz testarea sensibilitii la antibiotice)
durat ore (pn la epuizarea unui nutrient sau
acumularea de catabolii toxici)

19
 10/20/2017

Fazele multiplicrii bacteriene n

cultur discontinu
Staionar
Nr bacteriilor vii este constant
bacterii rmn vii dar nu se multiplic (de ex. din cauza
epuizrii unui nutrient)
echilibru dinamic ntre nr bacteriilor provenite din
multiplicare i nr bacteriilor moarte (de ex. din cauza
acumulrii de catabolii toxici, modificrii pH etc)
Morfologia bacteriei - caracteristic speciei (dimensiuni,
incluzii, endospori)
Sensibilitate scazut la ageni antibacterieni

Fazele multiplicrii bacteriene n

cultur discontinu
Declin
se instaleaz dup o perioad variabil
numrul de bacterii vii scade; uneori are loc autoliza (scade
i numrul total de bacterii)
bacterii cu morfologie variabil, uneori alterat (o colonie
poate conine bacterii n diferite faze)
Sensibilitate sczut la ageni antibacterieni

20
 10/20/2017

Cultura bacterian continu

Cultura continu meninerea bacteriilor n faza
exponenial, prin
influx continuu de mediu steril (aport de nutrieni) egal
cu efluxul de mediu de cultur.
Turbidostat - dispozitiv n care mediul de cultur este
permanent nlocuit
concentraia unui nutrient (factor limitant) este
constant, de aceea numrul de bacterii este constant i
proportional cu rata influxului.
Chemostat

Cultivarea bacteriilor
Scopuri
Diagnostic cultura discontinu
Testarea in vitro a sensibilitii bacteriilor la ageni
antibacterieni, monitorizarea terapiei
Industrial obinerea unor produse bacteriene
(antibiotice, vitamine, toxine etc), prepararea unor
vaccinuri cultura continu (culturi meninute n faza
exponenial)

21