LITIUL Terapeutic PDF

UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
TEZA DE DOCTORAT
REZUMAT
RSPUNSUL GLIAL LA LITIU I APA MINERAL

LITINIFER MARIA DE LA MALNA-BI
RELEVANA ACESTUIA N TERAPIA MANIACO-DEPRESIEI
Conductor tiinific:
Prof. Dr. Lotus Meter
Doctorand:
Constantin Munteanu
Bucureti
2009
Constantin Munteanu 2009 Rspunsul glial la litiu i apa mineral litinifer MARIA de la Malna-Bi
INTRODUCERE........................................................................................................................................................ ......................................3
TULBURAREA BIPOLAR................................................................................................................................................................................14
Introducere ......................................................................................................................................................................................................... 15
Definiia bolii ..................................................................................................................................................................................................... 16
Neurobiologia afeciunii bipolare ....................................................................................................................................................................... 21
Maniaco-depresia i semnalizarea intracelular ................................................................................................................................................. 30
Aspecte genetice ale maniaco depresiei........................................................................................................................................................... 31
Ritmurile circadiene i tulburarea bipolar......................................................................................................................................................... 34
Modelarea matematic a psihozei bipolare II printr-un oscilator armonic.......................................................................................................... 36
Diagnostic........................................................................................................................................................................................................... 38
Evoluia clinc a maniaco-depresiei ................................................................................................................................................................... 41
Morbiditate, mortalitate i comorbiditate ........................................................................................................................................................... 42
Tratament i profilaxie ....................................................................................................................................................................................... 43
LITIU ................................................................................................................................................................................................................. 44
Introducere ......................................................................................................................................................................................................... 45
Proprietile fizice i chimice ale ionilor de litiu ................................................................................................................................................ 47
Litiul ca element secundar n organism .............................................................................................................................................................. 50
Transportul ionilor de litiu prin membrana celular. .......................................................................................................................................... 53
Litiul i activitatea electric a membranei celulare............................................................................................................................................. 56
Litiul i ciclul fosfo-inositidic ............................................................................................................................................................................ 58
Litiul i GSK-3 ................................................................................................................................................................................................. 62
Aciunea litiului asupra altor ci de semnalizare ................................................................................................................................................ 65
Implicarea litiului n neuroprotecie. .................................................................................................................................................................. 66
Litiul i neurotransmitorii ................................................................................................................................................................................ 67
Efectele litiului n embriogenez. ....................................................................................................................................................................... 68
Influena litiului asupra ritmului circadian ......................................................................................................................................................... 69
Litiul i expresia genic...................................................................................................................................................................................... 73
Proprieti clinice ale litiului .............................................................................................................................................................................. 77
Efecte secundare adverse ale litiului................................................................................................................................................................... 82
CELULA GLIAL ............................................................................................................................................................................................ 83
Introducere ......................................................................................................................................................................................................... 84
Caracterizarea celulelor gliale ............................................................................................................................................................................ 85
APA MINERAL LITINIFER MARIA ......................................................................................................................................................... 92
MATERIALE I METODE ............................................................................................................................................................................... 97
Determinarea proprietilor chimice i fizice ale apei minerale............................................................................................................................98
Cultura primar de celule gliale........................................................................................................................................................................ 101
Tratamentul cu clorur de litiu ......................................................................................................................................................................... 101
Testarea apelor minerale litinifere Maria de la Malna-Bi.............................................................................................................................. 101
Obinerea preparatului MARIASOL ................................................................................................................................................................ 102
Tratamentul culturilor de celule gliale cu preparatul MARIASOL................................................................................................................... 102
Microscopia n contrast de faz ........................................................................................................................................................................ 103
Coloraia May-Grunwald-Giemsa i coloraia cu hematoxilin-eozin............................................................................................................ 103
Evidenierea imunohistochimic a proteinelor (Van Noorden,1986)................................................................................................................ 104
Dozarea proteinei celulare cu Amido-black (Sheffield et all 1987).................................................................................................................. 106
Dozarea proteinelor prin Metoda Bradford....................................................................................................................................................... 107
Analize biochimice........................................................................................................................................................................................... 108
Analiza statistic............................................................................................................................................................................................... 111
Electroforeza SDS-PAGE................................................................................................................................................................................. 111
Western blotting ............................................................................................................................................................................................... 112
REZULTATE I DISCUII ............................................................................................................................................................................ 114
Obinerea, cultivarea i caracterizarea morfologic a culturilor de celule gliale .............................................................................................. 115
Efectele litiului asupra morfologiei culturilor de celule gliale.......................................................................................................................... 138
Efectele apei minerale MARIA asupra morfologiei culturilor de celule gliale................................................................................................. 161
Efectele preparatului MARIASOL asupra morfologiei culturilor de celule gliale..............................................................................................195
Analize biochimice ale culturilor de celule gliale tratate cu apa minerala MARIA, litiu i soluii saline de diferite concentraii .................... 225
Analiza profilului electroforetic al celulelor gliale dup tratament................................................................................................................... 242
Modificri induse de litiu i apa mineral MARIA asupra expresiei lamininei ................................................................................................ 265
Modificrile induse de litiu i apa MARIA asupra expresiei vimentinei .......................................................................................................... 270
Modificrile induse de litiu i apa MARIA asupra expresiei SHIP2 ................................................................................................................ 276
Modificrile induse de litiu i apa MARIA asupra expresiei GFAP................................................................................................................. 281
Modificrile induse de litiu i apa MARIA asupra expresiei GSK-3 .............................................................................................................. 298
Tratamentul cu litiu i apa mineral MARIA a culturii de celule gliale modificata patologic prin ritmicitate metabolic indus.....................309
CONCLUZII .................................................................................................................................................................................................... 330
BIBLIOGRAFIE................................................................................................................................................................................................ .333
2
2009 Rspunsul glial la litiu i apa mineral litinifer MARIA de la Malna-Bi Constantin Munteanu
INTRODUCERE
Litiul strnete un deosebit interes tiinific pentru c, dei are o structur att de simpl, o
chimie uor de analizat i proprieti fizice bine stabilite, pleiada de efecte asupra sistemelor
biologice prin influenarea numeroaselor procese celulare i moleculare i mecanismul su de
aciune nc neelucidat genereaz un mister pe care tiina modern ncearc s l descifreze.
Observaia c litiul poate fi gsit n apele minerale utilizate n nsntoire a dus la ideea c
litiul ar putea fi responsabil de vindecarea celor ce utilizau aceste ape (Fieve, 1984). Rspndirea
larg i comercializarea haotic a srurilor de litiu n poiuni i ape minerale, mai ntotdeauna la
concentraii neadecvate, pentru o varietate de boli, au contribuit la deziluzia general asupra
ipotezelor medicale empirice privind rolul terapeutic al litiului (Lenox i Watson, 1994).
Srurile de litiu au fost folosite prima dat terapeutic n 1850, n ameliorarea simptomelor
gutei, reumatismului, litiazei renale. n 1949, Cade are meritul de a fi descoperit efectul sedativ al
srurilor de litiu n starea de agitaie maniacal, dar terapia este nsoit de frecvente cazuri de
intoxicaie. n perioada anilor 60 s-a artat c litiul previne recurenele att maniacale ct i
depresive. Acest efect profilactic a fost mai nti demonstrat ntr-un studiu deschis, utiliznd
metoda oglinzii, i mai apoi (dup 1970) confirmat printr-un numr de studii controlate placebo
- dublu orb. Profilaxia litiului a fost similar eficace la pacienii bipolari i unipolari. n 1967, se
determina valoarea terapeutic a litemiei, situat n intervalul: 0,5-1,5 mEq/l.
Studii in vivo i in vitro au demonstrat c litiul exercit multiple efecte asupra semnalizrii
receptor mediate prin neurotransmitori, transportului ionic, cascadelor de semnalizare, reglrii
hormonale, ritmicitii circadiane i expresiei genice (Cyrus et all, 2006).
Din pcate, mecanismele moleculare responsabile pentru toate aceste efecte sunt nc un
subiect de dezbatere. Mecanismele biochimice ale aciunii litiului apar ca fiind multifactoriale i
inter-corelate cu funcionarea mai multor enzime, hormoni i vitamine, ca i cu factori de cretere
i transformare (Schrauzer, 2002).
MANIACO DEPRESIA
Afeciunea bipolara este o afeciune psihiatric sever, comuna, caracterizat prin asocierea
unor episoade depresive cu episoade recurente maniacale sau mixte. Simptome cognitive,
comportamentale i psihice apar ntotdeauna n timpul episoadelor afective, iar rata de suicid n
afeciunea bipolar este printre cele mai ridicate dintre toate bolile psihiatrice.
Manifestrile comportamentale i fiziologice ale tulburrilor bipolare sunt complexe i
trebuie privite nu numai din perspectiva schimbrilor de dispoziie ale pacienilor, dar i din
prisma constelaiei de simptome (manifestri) neurovegetative psihomotorii. Pato-fiziologia este
cu certitudine mediat de o vast reea de interconexiuni ale circuitelor neuronale permise de
neurotransmitori de la nivel limbic, striatal i fronto-cortical, i din acest punct de vedere,
interaciunea sistemelor de neurotransmitori colinergici, catecolaminergici i serotoninergici
reprezint un candiat sustenabil pentru investigaii.
O adevrat nelegere a tulburrilor bipolare trebuie s conceptualizeze neurobiologia
acestora la diferite nivele fiziologice: molecular, celular, sistemic i comportamental.
n general, orice leziune a creierului este, mai degrab, determinant pentru inducerea unei
depresii, dar leziuni care induc mania se produc frecvent n lobii temporal i frontal, iar
subcortical, la nivel talamic i caudat.
Mai muli cercettori au sugerat c pacienii cu tulburri afective au ventriculi cerebrali
mai mari dect n cazurile normale, un aspect mult mai evident la pacienii cu schizofrenie.
Mrirea ventricular este o caracteristic a pierderilor celulare, aa cum ar fi neurodegenerarea
observat n cazul maladiei Alzheimer, sau alterri ale circuitelor neuronale.
3
Reducerea semnificativ a celulelor gliale n aceste regiuni este n mod particular

interesant sub aspectul rolurilor critice pe care celula glial le are n creterea i dezvoltarea
neuronilor, n reglarea concentraiilor post-sinaptice ale glutamatului, n homeostazia energetic a
sistemului nervos central, precum i n eliberarea factorilor trofici care particip la dezvoltarea i
meninerea reelelor sinaptice formate de procesele neuronale i gliale. Anomaliile funcionarii
gliale se pot dovedi prin urmare determinante pentru condiiile patofiziologice i de plasticitate
structural ale tulburrilor afective
Recent, cercetrile patofiziologice i tratamentul tulburrilor afective i-au mutat atenia de
la neurotransmitori sau receptori de pe suprafaa celular la componente ale cascadelor de
semnalizare intracelular.
Date preliminare sugereaz de asemenea implicarea sistemului de semnalizare controlat de
protein kinaza C (PKC) n declanarea unora din simptomele ce apar n maniaco-depresie. Ionii de
calciu joac un rol critic n reglarea sintezei i eliberrii neurotransmitorilor, excitabilitii
neuronale, efectelor neuroplastice pe termen lung i nu este surprinztor ca dereglri de la alte
nivele, prin interconexiune, s se coreleze cu modificri funcionale la nivelul cascadelor de
semnalizare Ca2+-dependente.
Calea de semnalizare a inozitol fosfailor, calat pe IP3 i DAG, implicat n numeroase
procese intracelulare este de asemenea vizat de reprecursiuni ale diferitelor cauze declanatoare
ale bolii maniaco-depresive. Dovada implicrii acestei ci de semnalizare n patofiziologia
maniaco-depresiei rezult din capacitatea litiului de a bloca aceast cale de semnalizare,
cunoscnd capacitatea acestuia de a interveni terapeutic n tulburarea bipolar.
Recent, P. Klein a descoperit implicarea proteinei GSK-3 n mecanismul de aciune al
litiului la nivel celular. Cunoscnd o parte din detaliile complexitii proceselor modulate prin
semnalele angajate pe cale de transmitere coordonat de aceast protein, printre care merit
menionat ritmul circadian, nu putem exclude implicarea funcionrii acesteia n instalarea unora
dintre simptomele specifice maniaco-depresiei.
LITIU
Aciunea terapeutic a srurilor de litiu n bolile bipolare pare a fi rezultatul unui cumul de
evenimente care modific activitatea neuronal la nivele multiple.
Trei mecanisme care interacioneaz par a fi mai afectate:
1) modularea neurotransmitorilor de ctre ionii de litiu pare a modifica raportul dintre
activitile lor excitatorii i inhibitorii iar descreterea activitii glutamatergice poate contribui la
efectul litiului de neuroprotecie;
2) ionii de litiu moduleaz semnalele cu impact asupra citoscheletului, un sistem dinamic
care contribuie la plasticitatea neuronal la nivele multiple, inclusiv glicogen sintetaz kinaza-3,
protein kinaz cAMP dependent i protein kinaza C;
3) ionii de litiu modific activitile de semnalizare care implic mesagerii secundari,
factorii de transcripie i deci expresia genelor (Jope, 1999).
n cele ce urmeaz prezentm succint cteva din aciunile biologice ale srurilor de litiu:
-inhib adenilat ciclaza (Schimmer, 1973; Geiser et all, 1988; del Rio et all, 1998; Singh et all,
1998; Subbash et all, 1999).
-inhib inozitol monofosfataza (Ragan et all, 1988; Chang et all, 1998; Belmaker et all, 1998)
-interfer cu legarea altor cationi (Klemfuss et all, 1991)
-depolarizeaz neuronii (Grafe et all, 1983)
-blocheaz canalele ionice (Reiser et all, 1982)
-altereaz compoziia lipidelor (Shears, 1988; Einat et all, 1998; Dixon et all, 1997; Singh et
all, 1998; Belmaker et all, 1998)
-inhib sinteza cGMP (Geiser et all, 1988; Avissar et all, 1988; Berridge et all, 1989)
4
-desensibilizeaz receptorul pentru serotonin (Geisser et all, 1988)

-scade nivelul potasiului intracelular (Grafe et all, 1983; Birch et all, 1991)
-stimuleaz Na+-K+ATP-aza (Zachariah et all, 1991; Dixon et all, 1997)
-altereaz neurotransmitorii (Cowburn et all, 1988)
-afecteaz funcionarea proteinelor G (Dixon et all, 1997; del Rio et all, 1998; Jakobsen et
all,1998)
-determin activarea protein kinazei C (Jope, 1999; Chen et all, 1998; Chang et all, 1998)
-regleaz homeostazia calciului (Nonaka et all, 1998; del Rio et all, 1998; Singh et all, 1998)
-reduce nivelul mioinozitolului (Jakobsen et all, 1998; Manji et all, 1995)
-mrete nivelul tirozin hidroxilazei (Chen et all, 1998)
-stimuleaz sinteza ADN la concentraii de 0,5 - 7,5 mM (Toback, 1980)
-inhib fosfolipaza A2 i reduce turnoverul acidului arahidonic (Chang et all, 1998; Rintala et
all, 1999)
-altereaz fosforilarea proteinelor (Singh et all, 1998; Manji et all, 1995).
Litiu se gsete n cantiti infime n toate tipurile de sol, mai ales n fracia luteic
(argiloas), i mai puin n fracia de sol organic, n cantitti situate ntre 7 i 200 g/g. Este, de
asemenea, prezent n apele de suprafa, la nivele ntre 1 i 10 g/L, iar n apa mrii la o
concentraie de 0.18 g/L. Concentraiile de litiu n apele subterane ajung la 500 g/L. n unele
ape de ru se ajunge la o concentraie de litiu de pn la 8 mg L. Exist ape minerale naturale cu
cantiti mari de litiu, cu nivele ce ating pn la 100 mg/L.
Litiu se gsete n cantiti variabile n hran: sursele alimentare principale sunt grnele i
zarzavatul; n anumite regiuni, apa potabil, de asemenea, furnizeaz cantitti semnificative ale
elementului. Aportul de litiu n dieta uman depinde de amplasarea i tipul de hran consumat i
varieaz cantitativ ntre 650 i 3100 g.
Concentraia de litiu n ser este aproximativ proporional cu aportul de litiu. La adulii
primind 0. 25 mM (1,74 mg) de litiu sub form de clorur per zi pentru cteva sptmni, de
exemplu, nivelul seric al litiului crete de la un nivel de baz 0. 14 0.03 mol/L la 3.90.08
mol/L (sau de la 0.970.21 la 27.05.5 g/L).
Nivelul seric bazal al litiului la aduli se ncadreaz n domeniul cuprins ntre 7 i 28 g/L,
corespunznd unor admisii de litiu zilnice de 385-1540 g. Concentraia de litiu din pr reflect
admisiile medii de litiul disponibil ntr-o perioad de la cteva sptmni pn la cteva luni i
reprezint o metod neinvaziv de a determina aportul necesar de litiu n diet.
Litiu poate fi transportat prin membrane n cinci moduri diferite. Dintre acestea, fluxul
pasiv este cea mai important cale de intrare pentru litiu n celule, iar co-transportul sodiu-litiul
pentru expulzarea litiului din celule. Cele cinci componentele ale transportului de Li+ sunt (Reiser
i Duhm, 1982):
1. Sistemul de transport antiport Na+ - dependent transport Li+ n ambele direcii prin
membrana plasmatic.
2. Pompa de Na+/K+ mediaz preluarea Li+ dar nu i eliberarea sa din celulele cu coninut
fiziologic de Na+ i K+. Att Na+ ct i K+ extern inhib preluarea de Li+ de ctre pomp n medii
cu colin.
3. Li+ poate s intre n celul prin canalul de Na+ voltaj-dependent . Intrarea litiului prin
aceast cale este stimulat cu veratridin i toxina de scorpion, stimularea fiind blocat de
tetrodotoxina;
4. Cile reziduale cuprind o component saturabil, care este comparabil la preluarea
bazal de Na+, i,
5. o component ouabain-rezist care determin o expulzare a Li+ mpotriva gradientului
electrochimic n mediile cu colin.
5
Mecanismul molecular de aciune al litiului nu este cunoscut. Exist mai multe ipoteze
privind aciunea litiului la nivel molecular. Fiecare ipotez implic o enzim int, asupra creia
litiul exercit o aciune direct. Aceste enzime sunt exprimate pe suprafee ntinse, folosesc un ion
metalic pentru cataliz i sunt inhibate de ctre litiu ntr-o manier necompetitiv prin nlocuirea
unui cation bivalent (Klei i Phiel, 2001).
Una dintre enzimele int este inozitol monofosfataza. Aceast enzima este implicat n
regenerarea inozitolului (Klein i Phiel, 2001).
Monofosfataza ocup o poziie cheie n mecanismul homeostatic al inozitolului deoarece se
afl la confluena a dou ci distincte implicate n meninerea nivelelor intracelulare de inozitol:
refacerea inozitolului datorit scindrii activate a inozitidelor i o cale separat pentru sinteza de
novo a inozitolului din glucoz (Fig. 2).
Srurile de litiu inhib necompetitiv enzimele ceea ce nseamn c se leag numai de
complexul enzim-substrat (Berridge et all, 1989).
Tratamentul cu litiu produce schimbri similare activrii ectopice a cii de semnalizare
Wnt (Klein i Melton, 1996; Klein i al., 1997; Klein i Phiel, 2001). Enzima considerat ca int a
aciunii litiului este glicogen sintetaz-kinaza 3 (GSK-3). Litiul inhib direct enzima in vivo i in
vitro.
Calea de semnalizare Wnt este implicat n formarea mezodermului la vertebrate, inducia
neural i n modelul de formare al membrelor. Componentele cii de semnalizare sunt: ligandul
Wnt, receptorul Frizzled i mediatorii intracelulari: dishevelled, GSK-3 i -catenin (Hedgepeth
et all, 1997).
Litiul i realizeaz funcia antiapoptotic prin intermediul cii de semnalizare mediat de
protein Kinaza B (Akt). Akt este o serin-treonin kinaz i o proto-oncogen ce prezint un
domeniu de legare a fosfolipidelor utilizat pentru ancorarea acestora la membrana plasmatic.
Ritmuri circadiene (zilnice) exist la toate eukariotele i sunt dirijate de oscilatori biologici
endogeni, auto-ntreinui; n absena unor intervenii de timp externe, ritmul se va derula cu o
perioad de aproape 24 h. Perioada circadian a activitii locomotorii a mamiferelor este
controlat de un ceas circadian localizat n nucleul suprachiasmatic hipotalamic. n condiii de
sincronizare, toate ritmurile circadiene au periodicitate identic dar au amplitudini i peak-uri de
timp diferite (acrofaze).
Tratamentul cronic (dar nu i acut) cu litiu prelungete perioada de oscilaie la aproape toate
sisteme biologice studiate, inclusiv specia uman. Efectele litiului n condiii de sincronizare sunt
specific variabile, cu ntrzieri sau avansuri semnificative ale fazelor. Efectele depind de asemenea
de momentul aplicaiei sale, astfel, administrarea hidroxibutiratului de litiului seara timp de 10 zile
stabilizeaz ritmurile circadiene la obolan, n contrast cu o administrare n cursul dimineii (
Ikonomov i Manji, 1999).
Baza biochimic pentru ritmicitatea circadian nu a fost nc descris pentru orice organism,
i nici nu s-au gsit explicaii pentru mecanismul prin care oscilatorul primete informaii din
mediu prin semnalul luminos albastru.
Metabolismul fosfo inositolic a fost propus ca o componenta potenial att a oscilatorului
circadian ct i a foto-transduciei luminii albastre (Lakin-Thomas, 1993).
Sindromul maniaco-depresiv i durerea de cap cluster sunt tulburri nervoase periodice;
exist dovezi care leag litiul i de iniierea altor procese ritmice normale.
Comportarea organismelor uni-i pluricelulare este corelat cu funcionarea ceasurilor
biologice intrinseci. ntr-adevr, aciunile litiului n schimbarea frecvenelor de oscilare a
sistemelor fiziologice sugereaz c ciclul fosfoinositidic este parte a mecanismului de reglare a
ceasurilor biologice (Berridge et all, 1989).
6
CELULA GLIAL
Proliferarea celular este un proces cheie n timpul dezvoltrii neurale i de asemenea joac
un rol important n rspunsul regenerativ al esutului nervos lezat.
n timpul embriogenezei, proliferarea glioblatilor i diferenierea lor n cteva tipuri de
celule gliale pare a fi strns coordonat cu dezvoltarea neuronilor. Astroglia direcioneaz
migrarea i creterea neuronilor spre inte i determin ce tip de neuron va deveni celul cerebral
neangajat. n timpul dezvoltrii postnatale timpurii a creierului de roztor, proliferarea glial
continu la un nivel semnificativ dup ce proliferarea neuronal a fost stopat.
La organismele mature, dou tipuri de glie, celulele Schwann din sistemul nervos periferic i
oligodendrocitele din creier i mduva spinrii produc tecile de mielin care nconjur neuronii i
permit propagarea rapid a impulsului electric. Alt tip de glie, microglia servete ca celul imun a
creierului. Aceste celule sunt parteneri intimi cu neuronii din vecintate asigurnd nutrienii
cruciali pentru sntatea neuronilor i ajut la transmisia semnalelor neuronale prin ndeprtarea
ionilor i neurotransmitorilor din spaiul sinaptic (Aschner et all, 1999).
Celulele gliale formeaz majoritatea elementelor celulare din sistemul nervos. Aceste celule
se mpart n 3 grupe care au funcii specifice diferite n creier:
1) astrocitele care formeaz o reea de filamente n creier, particip la formarea barierei
hematoencefalice i reglez mediul intern;
2) oligodendrocitele, celule formatoare de mielin;
1) celulele microgliale (denumite de ali autori mezoglia sau celule Hortega) care sunt
celule imunoefectoare intrinseci ale creierului (Alarcon et all, 2005).
APA MINERAL LITINIFER MARIA

factor natural terapeutic
Apa mineral medicinal cunoscut sub denumirea Maria este mbuteliat n staiunea
balneoclimateric Malna-Bi. Staiunea Malna-Bi este situat n defileul care desparte Munii
Bodoc de Munii Baraolt, la cca 22 Km de Sf. Gheorghe. Climat fr amplitudini termice mari,
temperatura medie anual este de 70 C iar cantitatea medie anual de precipitaii de 600 mm.
Formarea staiunii dateaz nc din anul 1759, iar dupa 1865 renumele su ajunge si peste hotare.
Sub aspect hidrologic, n zona Malna exist dou orizonturi acvifere suprapuse, unul
inferior cantonat n sistemul fisural i zonele fracturate ale formaiunilor calcaroase-gazoase de
vrst cretacic i altul superior n depozitele acoperitoare granulare de vrst policen i
cuaternar. Hidrostructurii policen-cuaternare i aparin sursele Ileana, Mioara, Bile Reci, Baia
Cald, forajele nr.8 i 9 ISPIF, exploatabile n scopuri terapeutice, n timp ce, de hidrostructura din
depozitele cretacice sunt legate sursele Maria, Principal, forajele 2, 1, 4, i 10-11, 801-802
utilizate pentru mbuteliere.
Apa mineral Maria este o ap bicarbonatat, clorurat, sodic, carbogazoas, hipoton,
utilizat pentru cur intern i mbuteliere.
Apa mineral medicinal Maria este mbuteliat nc din anul 1904, de cnd a fost
recomandat la tratarea diferitelor boli digestive, cum ar fi afeciuni ale tubului digestiv (gastrite
cronice hiperacide, ulcere gastrice i duodenale, colite cronice, constipaia cronic), aciuni
hepatobiliare (dischinezia biliar, hepatita cronic, pancreatita cronic, colecistita cronic
necalculoas sau calculoas), boli asociate: nevroz astenic, migren, tulburri afective.
Apa medicinal Maria de la Malna-Bi, cu un coninut de 8,03 mg litiu la litru, va fi
utlizat n cercetri clinice i experimentale n tratamentul migrenei i tulburrilor afective,
afeciuni care nu au intrat n spectrul terapeutic al apei pn n prezent.
7
MATERIALE SI METODE
Determinarea proprietilor chimice i fizice ale apei minerale

1. Determinarea clorului s-a fcut printr-o metod volumetric n mediu de HNO3 (pentru
a nlesni disocierea clorurilor) n prezena indicatorului de alaun de fier. Se adaug dup necesitate
o soluie de azotat de argint n exces, care se titreaz cu sulfocianur de amoniu.
Cl- (din ap) + AgNO3(exces) AgCl(precipitat) + NO3-
AgNO3(surplus) + NH4SCN AgSCNH + NH4NO3
NH4SCN + Fe (NH4)2(SO4)2 FeSCN +2(NH4)2SO4
2. Determinarea bromului (Br-)
Bromul, detaat din combinaiile sale de oxidani este dozat colorimetric cu ajutorul
specolului.
3. Determinarea iodului se realizeaz volumetric, n prezena urmtorilor reactivi:
carbonat de sodiu, acid clorhidric, perhidrol, sulfur de carbon, tiosulfat de sodiu.
Reaciile care au loc:
2I- +H2O2I2
2I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6
4. Determinarea compuilor cu azot (ionul amoniu, amidogenul, ionul nitric)
Metoda se bazeaz pe titrarea amoniacului rezultat din distilarea probei n diferite faze prin
titrarea succesiv a apei cu carbonat de magneziu i aliaj Dervada. Se folosete aparatul Aubin.
Dup distilarea fiecrei faze, dozarea se face n prezen de rou de metil i surplus de H2SO4 care
se titreaz cu NaOH.
5. Determinarea ionului nitros (NO2-)
Metoda const n dozarea colorimetric a compusului de culoare roie care rezult n urma
dizolvrii unei amine aromatice cu azotii n mediu acid.
6. Determinarea ionului sulfuric (SO42-)
Se realizeaza prin metoda gravimetric. Aceast metod se bazeaz pe precipitarea ionului
SO42 cu clorur de bariu (BaCl2) n exces n mediu de HCl.
7. Determinarea ionului bicarbonic (HCO3.-)
Pentru determinarea ionului HCO3.- se folosete metoda volumetric n prezena indicatorului
de metilorange. Se titreaz cu o soluie de acid clorhidric.
HCO3- (din ap) + HCl CO2 + H2O + Cl-
8. Determinarea ionilor de sodiu, potasiu i litiu
Pentru determinarea acestor ioni se folosete metoda flamfotometric (analiza cantitativ
spectral).
9. Determinarea ferului (Fe2+) se face dup reducerea Fe3+ la Fe2+.
Reactivi folosii: soluie de ortofenantrolin dizolvat n alcool etilic, clorhidrat de
hidroxilamin, soluie tampon de acetat de amoniu, acid clorhidric, amoniac concentrat.
Determinarea Fe2+ se face spectrofotometric.
10. Determinarea ionilor de Ca2+ i Mg2+ - se realizeaz prin metoda complexo-metric.
Aceast metod se bazeaz pe proprietatea pe care o are sarea disodic a acidului etilen-diamino-
tetracetic, numit i complexan III, de a da combinaii complexe cu cationii srurilor de calciu i
magneziu.
11. Determinarea substanelor oxidabile
Metoda se bazeaz pe oxidarea acestora cu permanganat de potasiu, n mediu acid sau bazic
n funcie de coninutul de cloruri al apei.
Reactivi necesari: permanganat de K, soluie de acid sulfuric, acid oxalic.
8
12. Determinarea CO2- dozarea dioxidului de carbon se face prin metoda volumetric.
Reactivi necesari: NaOH, fenoftalein, acid clorhidric. Reaciile care au loc: CO2 + H2O + NaOH
Na2CO3 + H2O
NaOH(surplus) + HCl NaCl + H2O
13. Determinarea acidului metasilicic (H2SiO3)
Acidul metasilicic se determin colorimetric.
Reactivi folosii: soluie de sare Mohr, molibdat de amoniu, soluie tampon de acetat de
amoniu.
14. Metode fizice de analiz a apelor minerale
Densitatea apei minerale se determin cu ajutorul balanei Morh-Westphal, cu care de
msoar fora arhimedic pe care lichidul o exercit asupra unui plutitor cu volum constant.
Deoarece densitatea este influenat sensibil de temperatur este necesar corelarea cu acest
parametru a densitii apei minerale.
Conductivitatea, exprimat n S/m, TBS (totalul de substane dizolvate) exprimat n mg/L i
salinitatea se determin cu ajutorul conductivimetrului.
Determinarea pH-ului se face cu ajutorul unui pH-metru.
Cultura primar de celule gliale
Pentru a obine cultura primar de celule gliale s- au folosit pui de obolan de 1-4 zile.
Dup decapitare, creierul a fost plasat n soluie tampon fosfat salin (TFS) pe ghea. Dup
ndeprtarea meningelui, creierul a fost pasat printr-un nytex de 60 m (McCarthy et all, 1980).
Celulele au fost crescute n mediu Dulbeccos Modified Eagles Medium cu 4500mg/l glucoz, 25
mM HEPES, 100 U/ml penicilin, 100 g/ml streptomicin i 50 g/ml neomicin. Mediul a fost
suplimentat cu 15% ser fetal de viel. Dup 24 ore s-a schimbat mediul de cultur pentru a
ndeprta celulele moarte i resturile celulare. Ulterior schimbarea mediului s-a efectuat la fiecare
3 zile. Celulele au fost cultivate pe plci Petri de sticl cu diametrul de 50 mm (Schott).
Tratamentul cu clorur de litiu
Pentru toate experimentele, tratamentul cu sruri de litiu al culturilor celulare s-a fcut n
mod continuu, acestea fiind adugate n mediul de cultur la concentraiile specificate ncepnd
din ziua a 6-a a culturii de celule gliale.
Clorura de litiu (Sigma) a fost dizolvat n DMEM la o concentraie de 20 mM pentru a
obine soluia stoc i s-a pstrat la 40C. Soluiile de lucru (1mM i 2mM) au fost obinute prin
diluarea soluiei stoc cu mediu de cultur.
Testarea apelor minerale litinifere Maria de la Malna-Bi
Testarea eficaciti apelor minerale bogate n litiu s-a realizat prin compararea celulelor
gliale martor, cultivate n mediu de cultura standard, cu cele cultivate n mediu cu apa mineral
litinifer MARIA, sau n prezena de clorur de litiu de diferite concentraii. Caracterizarea
comportamentului celulelor gliale n prezena apelor minerale i a clorurii de litiu s-a realizat att
din punct de vedere morfologic ct i imunohistochimic. Pentru evaluarea imunohistochimic s-au
folosit o serie de markeri pentru celulele gliale de tipul GFAP, vimentin si laminin, precum i o
enzim a crei activitate este modificat n prezena litiului, de tipul GSK-3.
Simularea artificial a compoziiei apei MARIA i evaluarea efectelor acestei soluii saline
asupra morfologiei culturilor de celule gliale
Verificarea ipotezelor privind efectele apei minerale Maria de la Malna-Bi a fost
realizat experimental prin utilizarea unei soluii saline avnd o compoziie ionic asemntoare
celei a apei minerale. Astfel, utiliznd datele obinute n Bultinul de analize al apei Maria, se
prepar o soluie stoc concentrat 100X ce conine 0,287 g % NaCl, 0,65 g %, KCl, 2,9 g % CaCl2
i 1,17 g % MgCl2X6H2O.
9
Microscopia n contrast de faz

Microscopia n contrast de faz permite studiul celulelor vii, nefixate i necolorate (Cotrutz
et all, 1994).
Dup ndeprtarea mediului de pe placa de cultur s-a examinat cultura n contrast de faz
utiliznd un microscop inversat de tip NIKON Ti.
Coloraia May-Grunwald-Giemsa i coloraia cu hematoxilin-eozin
In cazul coloraiei May Grunwald-Giemsa componentele bazice din soluiile May
Grunwald i Giemsa coloreaz n violet sau albastru acizii nucleici iar componentele acide ale
soluiilor coloreaz citoplasma celulelor n nuane diferite de roz.
In cazul coloraiei cu hematoxilin-eozin nucleul se coloreaz n albastru-violet datorit
hemalaunului care este colorant bazic iar citoplasma n roz-rou datorit eozinei care este un
colorant acid.
Evidenierea imunohistochimic a proteinelor (Van Noorden,1986).
Pentru detectarea imunohistochimic a proteinelor GFAP, fibronectin vimentin,
laminin, SHIP i GSK-3 s-a folosit metoda imunoperoxidazic indirect. Dup blocarea
peroxidazei endogene cu 3% H2O2 si a legarii nespecifice cu 2% albumina seric bovin, celulele
gliale au fost incubate, peste noapte la 40C, cu urmatorii anticorpi primari: (a) anticorp de capra
anti GFAP, diluat 1:100; (b) anticorp monoclonal de oarece anti vimentin, diluat 1:200; (c)
anticorp de capr anti laminin, diluat 1:100; (d) anticorp de capr anti GSK-3, diluat 1:100. Toi
anticorpii au fost diluai n tampon fosfat salin cu 2% albumin seric bovin. Dupa spalarea cu
tampon fosfat salin, celulele gliale au fost incubate cu anticorpi secundari cuplai cu peroxidaza, o
ora, la temperatura camerei. Pentru detectarea anticorpilor de capr s-a folosit un anticorp
secundar de iepure anti capr, cuplat cu peroxidaza i diluat 1:150 n tampon fosfat salin.
Anticorpii primari de oarece au fost detectati cu un anticorp secundar de iepure anti oarece,
diluat 1:350 cu tampon fosfat salin. Dupa spalare cu tampon fosfat salin complexul imun a fost pus
in eviden n prezena de 0,05% 3,3 diaminobenzidina si 0,003% H2O2 in tampon fosfat salin.
Dozarea proteinei celulare cu Amido-black (Sheffield et all 1987).
Cantitatea de Amido-black legat la proteine este direct proporional cu concentraia
proteinei. Metoda este sensibil pentru analiza unor probe care conin 0,01mg protein.
Dozarea proteinelor prin metoda Bradford
Metoda Bradford se bazeaz pe proprietatea colorantului Coomassie Blue G-250 de a se
lega de proteine, n special la nivelul resturilor lizil i arginil, formnd un complex care prezint
maxim de absorbie la 595 nm.
Determinarea activitii lactat dehidrogenazei
Principiul metodei
Lactat dehidrogenaza catalizeaz reacia :
LDH
Piruvat + NADH + H + lactat +NAD+
Electroforeza SDS-PAGE
Electroforeza este o metod analitic i preparativ de separare a particulelor i
ansamblurilor de particule ncrcate electric, sub aciunea unui cmp electric uniform aplicat din
exterior. Metoda are la baz fenomenul fizico-chimic de deplasare sau migrare diferenial a
diferitelor particule ntr-un cmp electric (Popescu, 1990).
Western blotting
Aceast tehnic este folosit cu succes cnd un anticorp recunoate o secven de
aminoacizi sau un miez hidrocarbonat dar este inadecvat pentru anticorpii care recunosc un
epitop conformaional de pe protein.
10
Tehnica de imunobloting, cunoscut ca Western blotting a fost descris de Towbin et all

(1979) care a utilizat un curent electric pentru transferul polipeptidelor de pe geluri de
poliacrilamid pe nitroceluloz.
Tehnica Western blotting const n separarea polipeptidelor pe gel (n condiii denaturante
sau nedenaturante, uni- sau bidimensional, focusare izoelectric) urmat de transferul
polipeptidelor separate pe o membran sau matrice care imobilizeaz (cea mai uzual este
membrana de nitroceluloz). In acest fel replica profilului de separare a polipeptidelor de pe
electroforeza n gel este creat pe membran o polipeptid poate fi evideniat cu un anticorp
(Burnette, 1981).
Buletin de analize al apei minerale MARIA

Localitatea: Malna-Bi, Judeul: Covasna, Sursa: Izvorul Maria
Data recoltrii: aprilie 2004 pH: 6,5
Temperatura apei: C Rezistivitatea electric: 97,9527 cm
Temperatura aer: C Conductivitatea electric: 0,0102 cm-1-1
3
Densitatea la 20C: 1,0060 g/cm
Salinitate: 5,8
COMPOZIIA CHIMIC A APEI sing. Margareta Musta
CONINUT LA 1Kg APA
mg mM m.eq. mg % m eq. %
-
Clor Cl 1.009,1 28,460 28,460 10,922 24,866
Brom Br- 2.,9 0,036 0,036 0,031 0,032
ANIONI
Iod I- 0,7 0,006 0,006 0,008 0,017

Nitric NO3- 9,9 0,160 0,160 0,107 0,139
Sulfuric SO4- 25,1 0,261 0,261 0,272 0,457
Bicarbonic HCO3- 5202,0 85,256 85,256 56,304 74,489
114,455 100,000
Sodiu Na+ 2263,8 98,441 98,441 24,503 86,009
Potasiu K+ 70,5 1,803 1,803 0,763 1,575
Litiu Li+ 8,03 1,152 1,152 0,087 1,007
CATIONI
Amoniu NH+ 0,7 0,039 0,039 0,008 0,034

Calciu Ca2+ 212,6 5,304 5,304 2,301 9,269
Magneziu Mg2+ 28,3 1,164 1,164 0,306 2,033
Fier Fe2+ 2,2 0,039 0,039 0,024 0,070
Mangan Mn2+ 0,1 0,002 0,002 0,001 0,003
114,455 100,000
Acid metasilicic H2SiO3 21,5 0,275 0,233
Acid metaboric HBO2 372,2 8,492 4,029
Amidogen NH2 7,0 0,437 - 0,076 -
Subst. Organice O2 2,4 0,150 0026
Dioxid de carbon CO2 748,0 17,000
determinat n laborator
Mineralization 9239,0 231,477 228,909 100
Caracterizarea apei: ap mineral litinifer, bicarbonatat, clorurat, sodic, carbogazoas,
hipoton
11
Obinerea, cultivarea i caracterizarea morfologic a culturilor de celule gliale

Obinerea culturilor de celule gliale are loc n spaiul steril, creeat n boxa de lucru a
Laboratorului de Culturi Celulare (fig.19), sub hota steril, cu flux de aer vertical.
Fig. 19 Spaiul steril din boxa de lucru a Laboratorului Culturi Celulare, INRMFB
Sacrificarea puilor de obolan Wistar de 2 pn la 4 zile are loc prin decapitare i plasarea
extremitii cefalice ntr-un vas Petri de 10 cm diametru.
Fig. 20 Pui de obolan Wistar de 3-4 zile, provenii de la Biobaza INRMFB
Prelevarea encefalului se realizeaz n condiii de sterilitate, cu instrumentar chirurgical.
Fig. 21 Encefalul prelevat de la pui Wistar de 3-4 zile
Dup ndeprtarea meningelui, creierul este pasat printr-un nytex de 60 m. Mediul se

suplimenteaz cu 15% ser fetal de viel. Dup 24 ore se schimb mediul de cultur pentru a
ndeprta celulele moarte i resturile celulare. Ulterior schimbarea mediului se realizeaz la fiecare
3 zile. Celulele se cultiv pe plci Petri cu diametrul de 50 mm (Schott).
Fig. 22 Schimbarea mediului de cultivare a culturilor de cellule gliale

12
0 zile 1 zi 2 zile
3 zile 4 zile 5 zile
13
n primele 24 de ore de cultur, celulele din inocul se aeaz pe suprafaa de cultur n

sensul imprimat de fora gravitaional, dar numai elementele viabile ader de aceast suprafa i
se aplatizeaz. Apar primele diferenieri celulare, celulele dobndind procese celulare specifice
acestui tip de celule.
Dup 48 de ore de cultivare, numeroase celule ncep un proces de difereniere celular,
celulele dobndind procese celulare specifice i aplatizndu-se pe suprafaa de cultivare. Nu sunt
observate procese de diviziune, ceea ce nsemn c celulele provin doar din inoculul iniial.
Dup o perioad de lag de circa 48 72 de ore, se observ o cretere treptat a densitii
celulelor, observndu-se acum un numr mare de diviziuni celulare.
Dup patru zile ncepe perioada de difereniere celular, caracterizat prin apariia
treptat a prelungirilor celulare. Un numr din ce n ce mai mare de celule prezint 1-5 prelungiri,
dintre care unele au o lungime ce depete de 2-4 ori diametrul corpului celular din care emerg.
Numeroasele diviziuni celulare desfurate ncepnd din a treia zi de cultivare au ca
rezultat formarea unor insule celulare constituite din cateva mii de celule.
Insulele celulare se extind, ocupnd un spaiu de cultur din ce n ce mai semnificativ. La
nivelul spaiului dintre insulele celulare se observ stabilirea unor conexiuni intercelulare.
n cea de a aptea zi de cultivare a celulelor gliale continu procesul de cretere a
insulelor celulare formate, nregistrndu-se un nivel ridicat al diviziunilor celulare. Se observ
microscopic numeroase celule aflate n diferite etape mitotice.
Ziua a opta este marcat de instituirea unui nivel de preconfluen a insulelor celulare i
de apariia primelor procese de resorbie celular. Nivelul de diviziune celular este n continuare
foarte ridicat, fapt demonstrat de celulele aflate n diferite etape ale diviziunii mitotice. Existena
unor procese de resorbie n paralel cu procesele de diviziune indic nevoia unui echilibru ntre
cele dou aspecte ale creterii culturii de celule gliale.
Observaiile microscopice efectuate n ziua a zecea au relevat un nivel maxim al
confluenei ntre insulele celulare. Sunt detectate numeroase diviziuni.
Observaiile microscopice din ziua a 11 au relevat apariia unor structuri de organizare
supra-celulare, sub forma unor falduri. Nivelul resorbiilor celulare este superior nivelului de
diviziune celular.
ncepnd din cea de a 12-a zi de cultivare se nregistreaz confluarea insulelor de celule
gliale. La nivelul de confluen apar numeroase fenomene de resorbie celular. Diviziunea
celular continu la un nivel optim.
Culturile de celule gliale izolate din creierul de obolan nou-nascut de 3-4 zile au o
compoziie glial heterogen reprezentat de celule progenitoare gliale, astrocite i oligodendrocite
imature si mature.
Fig.37. Cultura martor dupa 10 zile de cultivare. Se observa astrocite cu numeroase prelungiri
citoplasmatice. Coloratie Hematoxilina-eozina. X400.
14
Efectele litiului asupra morfologiei culturilor de celule gliale

Tratamentul cu clorur de litiu a nceput din ziua a 4 de cultivare a celulelor gliale, dup
faza de lag, moment ce corespunde startului multiplicrilor celulare, a formrii insulelor celulare i
a diferenierii celulare pronunate.
Tratamentul cu LiCl 1mM determin, dup 24 de ore, apariia unor vacuole celulare,
uoare mriri ale volumui celular, creterea proceselor celulare i o cretere a ratei de diviziune,
fapt demonstrat de dimensiunea insulelor celulare, n comparaie cu culturile martor.
Diviziunile celulare se produc i n cea de a opta zi, ns apar numeroase procese
patologice, caracterizate prin creteri n volum semnificative ale unor celule, aflate ntr-un proces
de moarte celular (astroglioz).
n ziua a 9-a, culturile tratate cu 1 mM LiCl prezint numeroase celule cu caractere
patologice, reprezentate de creteri exagerate n volum, anucleaie sau polinucleaie, resorbii
celulare, moarte celular programat, vacuolizri. Creterea diametrului insulelor celulare indic
un nivel ridicat al diviziunilor, fiind de altfel observate numeroase celule n diferite etape mitotice.
n ziua a 10-a, culturile tratate cu 1 mM LiCl prezint un nivel maxim al plasticitii.
Golurile rmase n urma resorbiilor celulare sunt mrginite de un strat celular ce delimiteaz golul
format. Numeroase celule ce prezint caractere patologice, reprezentate de creteri exagerate n
volum, anucleaie sau polinucleaie, resorbii celulare, moarte celular programat, vacuolizri.
Cultura de celulele gliale de 11 zile tratate cu 1 mM LiCl prezint un proces de
suprastructurare a arhitecturii culturale, fiind mimate structuri tisulare complexe. Apar cu o
frecven crescut resorbii celulare. Multiplicrile celulare pot fi observate microscopic. Se
observ numeroase procese morfopatologice.
n ziua a 12-a, cultura de celulele gliale tratat cu 1 mM LiCl prezint un avansat proces de
suprastructurare a arhitecturii culturale, fiind mimate structuri tisulare complexe. Apar cu o
frecven crescut resorbii celulare.
Tratamentul cu LiCl 2mM determin, dup 24 de ore, intensificarea nivelului diviziunilor
celulare, fapt demonstrat de dimensiunea insulelor celulare i de numeroasele celule surprinse n
diferite etape ale fazei mitotice a ciclului celular. Apar caractere morfopatologice reprezentate de
creteri n volum, apariia mai multor nucleoli i vacuolizri ale citoplasmei celulare.
Ziua a 8-a este marcat de un nivel crescut al multiplicrilor celulare, nsoite ns de
numeroase procese patologice, caracterizate prin creteri n volum semnificative ale unor celule,
aflate ntr-un proces de moarte celular.
Multiplicrile celulare nceteaz n cea de a noua zi, cnd procesele morfopatologice
predomin n observaiile microscopice. Celulele capt o form poligonal neregulat a
conturului.
n cea de a zecea zi procesele morfopatologice avanseaz. Practic se observ o destrmare
a monostratului. Apar celule individuale aflate n diferite stadii necrotice. Aspectul general al
culturii este caracterizat prin starea de dezintegrare a culturii.
i n cea de a 11-a zi continu procesele morfopatologice. Din ce n ce mai multe celulele
cresc n volum i intr n moarte celular. Se observ dezintegrarea insulelor celulare i
intensificarea vacuolizrii celulelor.
n cea de a 12-a zi procesele morfopatologice ating un nivel maxim. Se observ
dezintegrarea integral a unor insule celulare, care capt acum aspectul unor fantome insulare, dat
de spargerea celulelor i profilarea unor membrane celulare nc aderate la substratul de cretere.
15
LITIU 1mM Ziua 7 LITIU 1mM Ziua 8 LITIU 1mM ziua 9
LITIU 1mM ziua 10 LITIU 1mM ziua 13 LITIU 1mM Ziua 15
LITIU 2 mM ziua 7 LITIU 2 mM Ziua 8 LITIU 2 mM Ziua 9
LITIU 2 mM Ziua 10 LITIU 2 mM Ziua 11 LITIU 2 mM Ziua 15
16
Efectele apei minerale MARIA asupra morfologiei culturilor de celule gliale
Tratamentul cu apa mineral Maria presupune prepararea mediului de cultivare nlocuind o

parte din apa bidistilat necesar n procesul de obinere cu apa mineral litinifer Maria. Modelul
experimental presupune utilizarea unor medii de tratament cu 50% i 25% ap mineral Maria.
Tratamentul cu apa Maria a nceput din ziua a 4 de cultivare a celulelor gliale, dup faza de lag,
moment ce corespunde startului multiplicrilor celulare, a formrii insulelor celulare i a
diferenierii celulare pronunate.
n primele 72 de ore de tratament cu apa minerala Maria 50%, cultura de celule gliale nu
prezint modificri morfologice semnificative fa de martor. Spre deoseibire de tratamentul cu
litiu 2 mM, care provoaca vacuolizri, n acest caz, acestea nu se produc. Se observ o cretere n
lungime a prelungirilor celulare. Crete de asemenea nivelul interconexiunilor ntre celule.
Al doilea tratament cu ap mineral Maria 50% administrat n ziua a 7-a duce la apariia
unor modificri morfopatologice observate dup 24 de ore, respectiv n ziua a 8-a a culturii de
celule gliale. Modificrile morfopatologice induse celulelor gliale sunt de tipul hipertrofierilor,
pierderea prelungirilor celulare i vacuolizare. Multiplicrile celulare se produc cu o rata crescut.
n a 9-a zi de cultivare a celulelor gliale are loc al treilea tratament cu ap mineral Maria
50%. Acest fapt conduce la stoparea oricrei diviziuni celulare. Observaiile microscopice
efectuate dup 4-5 ore de la tratament au artat o reducere semnificativ a numrului de celule.
Cele mai multe celule s-au desprins de pe suprafaa de cultivare fiind distruse. Sunt observate de
asemnea numroase procese morfopatologice care dau celulelor un aspect amoebidal, i pierd
prelungirile celulare specifice, cresc n volum, apar vacuolizri citoplasmatice. Fenomenul
necrotic confer culturii un aspect murdar, datorit resturilor celulare formate.
Din a 10-a zi de cultivare a celulelor gliale se observ c celulele supravieuitoare se
adapteaz mediului modificat al apei minerale Maria 50%. Dei sunt observate foarte puine
multiplicri celulare, se reformeaz insule celulare mai mici, formate din zeci sau sute de celule
gliale. Unele celule, probabil dintre cele aprute n urma diviziunilor celulare prezint prelungiri
celulare tipice celulelor gliale dar mai groase.
Aplicarea celui de-al patrulea tratament cu ap mineral Maria 50% n ziua a 11-a are
efecte majore asupra celulelor gliale, provocnd o stare necrotic profund caracterizat prin
creteri foarte mari n volum, vacuolizri, apariia celulelor cu mai muli nuclei. Sunt nc celule
care supravieuiesc ocului i care vor fi lizate n vederea obinerii schiei electroforetice i a
expresiei unor proteine prin tehnica Western blotting.
n primele 72 de ore de tratament cu apa minerala Maria 25%, cultura de celule gliale
ajuns n ziua a 7-a nu prezint modificri morfologice semnificative fa de martor. Aspectele
interesante observate n acest caz in de o anumit orientare a prelungirilor celulare.
Al doilea tratament cu ap mineral Maria 25% duce la apariia unor modificri
pozitive ale celulelor gliale. Astfel se observ formarea unor prelungiri celulare mult mai lungi
dect n cazul martor, interconexiuni celulare mult mai numeroase, apariia unor structurri
arhitecturale care mimeaz structura esutului nervos. Multiplicrile celulare sunt frecvente. Se
pstreaz de asemenea orientarea prelungirilor celulare.
Tratamentul numrul 3 cu ap mineral Maria 25% administrat n ziua a noua, conduce
la apariia unor destructurri ale monostratului celular. Se observ un fel de pliere a foiei
celulare reprezentat de monostrat. Reducerea aderenei la substrat a celulelor gliale duce la
moartea unora dintre celule. Formarea sulurilor celulare din foia monostratului mpiedic ntr-o
mare masur observaiile asupra morfologiei celulare i asupra prelungirilor celulare.
n varianta experimental a tratrii culturii de celule gliale cu ap mineral Maria i cu 1
mM LiCl, dei culturile au avut un aspect normal a existat o proporie de celule hipertrofiate,
neobservate n culturile martor i cele cu ape minerale litinifere.
17
M50-ziua 7 M25-ziua 7 M25 + Li 1 mM-ziua 7
18
Simularea artificial a compoziiei apei MARIA i evaluarea efectelor acestei soluii saline
asupra morfologiei culturilor de celule gliale
Verificarea ipotezelor privind efectele apei minerale Maria de la Malna-Bi a fost realizat
experimental prin utilizarea unei soluii saline avnd o compoziie ionic asemntoare celei a apei
minerale. Astfel, utiliznd datele obinute n Bultinul de analize al apei Maria, se prepar o
soluie stoc concentrat 100X ce conine 0,287 g % NaCl, 0,65 g %, KCl, 2,9 g % CaCl2 i 1,17
g % MgCl2X6H2O. Sunt astfel refcute concentraiile ionilor de Na+, K+, Ca2+ i Mg2+ care
corespund unei proporii de 50 % a apei minerale Maria n mediu, concentrat de 100X.
Celulele gliale cultivate n prezena soluiei saline cu compoziia chimic descris mai sus,
reprezint modelul experimental pentru verificarea ipotezelor privind rolul acestor elemente
chimice n mbuntirea parametrilor de cretere i dezvoltare a celulelor gliale in vitro.
Dup 72 de ore de la tratamentul cu soluie salin S 50%, cultura de celule gliale ajuns n
ziua a 7-a nu prezint modificri morfologice semnificative fa de martor. Spre deoseibire de
tratamentul cu litiu 2 mM, care provoaca vacuolizarea celulelor i primele apecte morfopatologice,
n acest caz nu se observ caractere patologice la nivelul celulelor gliale. Se observ o cretere n
Al doilea tratament cu soluie salin S 50% administrat n ziua a 7-a nu modific
morfopatologic celulele gliale, aa cum se ntmpl n cazul tratamentului cu litiu sau ap mineral
Maria, observate dup 24 de ore, respectiv n ziua a 8-a a culturii de celule gliale. Prelungirile
celulelor gliale nu sunt mai lungi i mai groase, ca n cazul tratamentului cu litiu, ceea ce
demonstreaz c acest efect poate fi atribuit litiului i nu altor elemente chimice din apa Maria.
Culturile de celule gliale aflate n a 9-a zi de cultivare i dup al treilea tratament cu soluie
salin S50% ating stadiul de confluen al monostratului de celule gliale, fiind acoperit ntrega
suprafa de cultivare furnizat de vasul de cultur Petri. Acest fapt conduce la limitarea
diviziunilor celulare la un nivel care s permit compensarea resorbiilor celulare ce se produc ca
urmare a necesitilor de plasticitate i meninerea astfel a monostratului.
Dup 3 zile de la tratamentul cu soluie salin S 25%, cultura de celule gliale ajuns n ziua a
7-a nu prezint modificri morfologice semnificative fa de martor. Spre deoseibire de
tratamentul cu litiu 2 mM, care provoaca vacuolizarea celulelor i primele apecte morfopatologice,
n acest caz nu se observ nimic patologic la nivelul celulelor gliale. Se observ o cretere n
Multiplicrile celulare se produc cu o rata asemntoare cazului martor, la nivelul insulelor
celulare formate i mai puin n afara acestora. Spaiile interinsulare sunt foarte reduse, dnd
aspectul de preconfluen. n ziua a 7-a se aplic al doilea tratament cu soluie salin S25%.
Culturile de celule gliale aflate n a 9-a zi de cultivare i dup al treilea tratament cu soluie
salin S25% ating stadiul de preconfluen al monostratului de celule gliale, fiind acoperit o mare
parte din suprafaa de cultivare furnizat de vasul de cultur Petri. Acest fapt conduce la
echilibrarea numrului de diviziuni celulare la un nivel care s permit compensarea resorbiilor
celulare ce se produc ca urmare a necesitilor de plasticitate.
Tratamentul culturii de celule gliale cu soluie salin S 25% + Li 1mM determin modificri
morfologice foarte asemntoare cazului de tratament cu 1mM LiCl. Spre deoseibire de
tratamentul cu litiu 2 mM, care provoaca vacuolizarea celulelor i un apecte pronunat
morfopatologic, n acest caz nu se observ dect o frecven mai mare a resorbiilor celulare. Se
observ o cretere n lungime a prelungirilor celulare. Multiplicrile celulare se produc cu o rata
asemntoare cazului martor, la nivelul insulelor celulare formate i mai puin n afara acestora. n
ziua a 7-a se realizaz al doilea tratament al culturii cu S 25% i Li 1mM.
19
S50 ziua 7 S25 ziua 7 S25 + Li 1mM ziua 7
20
Evoluia activitii lactat dehidrogenazei

Tabelul 8. Determinarea evoluiei activitii lactat dehidrogenazei.
PROBA LDH elib. Fig. 97 LDH eliberat de celulele gliale
1 Martor 2,889531
30
25
2 Maria 50% 26,27214 20
3 Maria 25% 15,76703 15
4 Maria 25% + Li 1mM 9,137031 10
5 Li 1mM 7,37804 5
6 Li 2mM 20,52034 0
1
7 S50% 17,03169
2 3
4
5
6 S1
7
8 S25% 18,39938 8
9
9 S25% + Li 1mM 13,71274

Concluzii
Concentraiile de LiCl (0,6-1,2mM) indicate n literatura de specialitate ca avnd
rol terapeutic n sindromul maniaco-depresiv scade nivelul LDH intracelular i deci favorizeaz
morfologia normal a celulelor gliale.
In cazul celulelor gliale tratate cu LiCl 2mM i cu 50% apa mineral Maria apare o
cretere semnificativ a LDH eliberate, fa de tratamentul cu 1 mM LiCl observndu-se chiar
dublarea cantitii eliberate dup 20 de zile de tratament.
Modificarea nivelului de creatinina

Tabelul 9. Determinarea creatininei n mediu de cultur
Media difernelor nivelurilor de Fig. 98 Diferena nivelului de creatinin
PROBA creatinin din mediul de cultur fa de blancul specific n culturile de
fa de mediul de tratament celulele gliale
1 Martor 0,040 0,04
2 Maria 50% 0,014 0,035
0,03
3 Maria 25% 0,015 0,025
4 Maria 25% + Li 1mM 0,015

0,02
0,015
5 Li 1mM 0,035 0,01

0,005
6 Li 2mM 0,025 0
1
7 S50% 0,030 2
3
4
5
8 S25% 0,025
6
7
8
9 S1
9 S25% + Li 1mM 0,030

Concluzii
Apa mineral Maria folosit la prepararea mediilor de cultivare reduce cu 25 i
respect 50 % nivelului iniial de creatinin n funcie de concentraia de ap utilizat de 25 i 50%.
Activitatea metabolic sczut a celulelor se reflect n cazul tratamentului cu ap Maria prin
decalajul dintre diferena nivelului de creatinin a martorului i nivelul de creatinin a culturilor
tratate cu ap Maria;
Modificarea nivelului fosfatazei alcaline
Tabelul 10. Determinarea fosfataze alcaline din mediu de cultur
Media difernelor nivelurilor de fosfataz alcalin din Fig. 99 Diferena nivelului de fosfataz alcalin
PROBA
mediul de cultur fa de mediul de tratament fa de blanc n culturile de celulele gliale
1 Martor 18,1500 35
2 Maria 50% 2,6125 30
3 Maria 25% 10,8625 25
20
4 Maria 25% + Li 1mM 22,8250 15
5 Li 1mM 33,8250 10
5
6 Li 2mM 32,1775 0
7 S50% 19,1125
1
2
3
4
5
8 S25% 20,9000 6
7
8
9
S1
9 S25% + Li 1mM 26,2625
21
Modificarea nivelului ureei

Tabelul 11. Determinarea ureei din mediul de cultur al celulelor gliale
Media difernelor nivelurilor de uree din Fig. 100 Diferena nivelului de uree fa de
PROBA
mediul de cultur fa de mediul de tratament blanc n culturile de celulele gliale
1 Martor 2,4625 2.5
2 Maria 50% 0,3880 2
3 Maria 25% 1,4975 1.5
4 Maria 25% + Li 1mM 0,9950 1

5 Li 1mM 1,8015 0.5
6 Li 2mM 1,0780 0
7 S50% 1,7985 1
2 3
8 S25% 1,7425 4
5
6
7
S1
8
9 S25% + Li 1mM 2,3240
9
Concluzii
Apa mineral Maria determin diferene foarte mici ale nivelului de uree n mediul de cultur fa de
blank, ceea ce arat un nivel foarte sczut al catabolismului.
In cazul celulelor gliale tratate cu LiCl 1mM i n cazul tratamentelor cu soluie salin, diferena nivelului
de uree este uor mai mic dect la martor.
Modificarea coninutului de colesterol din mediu

Tabelul 11. Determinarea colesterolului din mediu
Media difernelor nivelurilor de uree din Fig. 101 Diferena nivelului decolesterol fa de blanc
PROBA
mediul de cultur fa de mediul de tratament n culturile de celulele gliale.
1 Martor 0,0875 0,2
2 Maria 50% 0,1165
3 Maria 25% 0,1740
0,15
4 Maria 25% + Li 1mM 0,0870 0,1
5 Li 1mM 0,0880 0,05
6 Li 2mM 0,0880 0
7 S50% 0,1165 1 2 3 4
8 S25% 0,1745 5
6 7 8
9 S1
9 S25% + Li 1mM 0,1745
Concluzii
Apa mineral Maria folosit la prepararea mediilor de cultivare crete nivelului iniial de colesterol n funcie de
concentraia de ap utilizat de 25 i 50%, diferena de nivel fiind aproape dubl n cazul Maria 50%;
In cazul celulelor gliale tratate cu LiCl 1mM, apa mineral Maria 25% + Li 1mM i LiCl 2mM diferena
nivelului de colesterol este identic cu ce din cazul martor;
Soluia salin crete de asemenea diferena dintre nivelul iniial i cel din mediu de cultur;
Salinitatea mediului de cultur este principalul factor care modific nivelul colesterolului.
Schimbri ale nivelului de trigliceride

Tabelul 11. Determinarea trigliceridelor
Media difernelor nivelurilor de trigliceride din Fig. 102 Diferena nivelului de trigliceride
PROBA
mediul de cultur fa de mediul de tratament fa de blanc n culturile de celulele gliale.
1 Martor 1,275 12
2 Maria 50% 10,758 10
3 Maria 25% 2,562 8
4 Maria 25% + Li 1mM 0,8695 6
5 Li 1mM 2,5535 4
6 Li 2mM 1,641 2
7 S50% 3,374
0
1
2
8 S25% 5,107
3
4
5
6
7 S1
9 S25% + Li 1mM 1,7295

8
9
Concluzii
Apa mineral Maria folosit la prepararea mediilor de cultivare n proporie de 50% cu ap
bidistilat determin o cretere de peste 10 ori a nivelului de trigliceride, ceea ce subliniaz caracterul nociv al
coninutului ridicat de ap mineral Maria;
22
Modificri ale activitii transaminazei glutamic-piruvice (TGP)

Tabelul 11. Determinarea activitii TGP n mediul de cultur
PROBA
Media difernelor nivelurilor de trigliceride din Fig. 103 Diferena nivelului deTGP fa de
mediul de cultur fa de mediul de tratament blanc n culturile de celulele gliale
1 Martor 58,715 100
2 Maria 50% 3,575 90

80
3 Maria 25% 45,22 70

60
4 Maria 25% + Li 1mM 22,499 50

40
5 Li 1mM 37,3545 30
20
6 Li 2mM 1,825 10
0
7 S50% 51,74 1
2
3
4
8 S25% 92,965 5
6
7
8
9 S25% + Li 1mM 48,18

9 S1
Concluzii
Apa mineral Maria la concentraia de 50% i LiCl 2mM au ca efect distrugerea majoritii
celulelor gliale ceea ce demonstreaz nivelul apropiat de 0 al activitii transaminazice.
Soluia salin cu care au fost tratate celulele gliale a dus la o cretere marcant a activitii
transaminazice, maximul de activitate fiind constatat la tratamentul cu soluie salin S25%.
Modificri ale coninutului de magneziu
Tabelul 11. Determinarea magneziului
Media difernelor nivelurilor de Mg din mediul Fig. 103 Diferena nivelului demagneziu fa de blanc
PROBA
de cultur fa de mediul de tratament n culturile de celulele gliale
1 Martor 0,305 0,35
2 Maria 50% 0,221 0,3
3 Maria 25% 0,295 0,25
4 Maria 25% + Li 1mM 0,22 0,2
5 Li 1mM 0,255
0,15
0,1
6 Li 2mM 0,315 0,05
7 S50% 0,315 0
1
8 S25% 0,29
2 3 4 S1
5 6 7 8
9 S25% + Li 1mM
9
0,315
Concluzii
Diferena dintre nivelul de magneziu al mediului prelulat din cultura de celule fa de cel
preparat iniial se situeaz ntre 0,2 i 0,3 mg/dl, fiind determinat de aportul de magneziu provenit
din esutul nervos prelevat de la puii de obolan Wistar utilizai n experiment.
Modificri induse de apa mineral MARIA, clorura de litiu i soluia salin asupra profilului
proteic al culturilor de celulele gliale
Celulele gliale martor i cele tratate cu apa MARIA (50%, 25% i 25% + Li 1mM),
clorur de litiu (1 mM i 2 mM) i respectiv soluie salin (50%, 25% i 25% + Li 1mM) au fost
omogenizate n tampon Laemmli pH 6,8.
Determinarea proteinelor din omogenatul celular a fost realizat prin metoda Bradford.
Rezultatele obinute n urma calibrrii reactivului Bradford (Sigma) sunt urmtoarele:
PROBA Cantitatea de proteine per placa
1- cultur martor de 12 zile 186 g
2- cultur de 12 zile tratat cu 50% ap mineral Maria 120 g
3- cultur de 12 zile tratat cu 25% ap mineral Maria 160 g
4- cultur de 12 de zile tratat cu 25% ap mineral Maria i LiCl 1mM 130 g
5- marker de greutate moleculara Sigma 11 g / 10 l
6- cultur de 12 de zile tratat cu LiCl 1mM 164 g
7- cultur de 12 de zile tratat cu LiCl 2mM 110 g
8- cultur de 12 de zile tratat cu solutie salina corespunztoare coninutului de mediu cu 25%
204 g
ap mineral Maria
278 g
ap mineral Maria
158 g
ap mineral Maria + LiCl 1mM
23
A B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Fig. 104 Schiele electroforetice ale proteinelor din omogenatele celulelor gliale tratate cu apa MARIA, litiu i soluie
salin (A- nemarcat B cu marcarea benzilor)
Track 1 MARTOR cultura celule gliale de 14 zile
1 8 1 9
2 0
2 9 1 5
1 3 5 1 0
1 1 1 3 1 4
4 6 8
7 1 2 1 6 1 7
0 ,1 0 ,2 0 ,3 0 ,4 0 ,5 0 ,6 0 ,7 0 ,8 0 ,9
Fig. 106 Densitograma omogenatului celular la o cultur martor de 14 zile

Track 2 Cultura de celule gliale tratata cu apa minerala MARIA 50% de 14 zile
6
1 12 20
2 7 8 9
5 1 81 9
3 4 13
1011 1 4 1 51 6 1 7
0 ,0 0 ,1 0 ,2 0 ,3 0 ,4 0 ,5 0 ,6 0 ,7 0 ,8 0 ,9 MARTOR ( ) - MARIA 50% ( )

Fig. 109 Densitograma omogenatului celular la o Fig. 110 Comparaie ntre profilul electroforetic al martorului
cultur de 14 zile tratat cu Maria 50% i al culturii de 14 zile tratat cu Maria 50%
MARIA 50% ( ) - MARIA 25% ( ) MARIA 50% ( ) - Li 2 mM ( )

Fig. 111 Comparaie ntre profilul electroforetic al Fig. 113 Comparaie ntre profilul electroforetic al culturii de 14
culturii de 14 zile tratat cu Maria 50 % i cel al zile tratat cu Maria 50 % i cel al culturii de 14 zile tratat cu
culturii de 14 zile tratat cu Maria 25 % Maria 25 % + Li 1 mM
Track 3 Cultura de celule gliale de 14 zile tratat cu apa minerala MARIA 25%
1 3
14 17 26
2 27
20
8 15 21
4 19 22
12
67 9 16 24
11 13 18 23
5 10 25
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
MARTOR ( ) - MARIA 25% ( )
Fig. 115 Densitograma omogenatului celular la o cultur Fig. 116 Comparaie ntre profilul electroforetic al martorului
de 14 zile tratat cu Maria 25 % i al culturii de 14 zile tratat cu Maria 25 %
Track 4 Cultura de celule gliale de 14 zile tratat cu apa mineral MARIA 25% i LiCl 1mM
14
12
1 2
7
13 16 23
9 10 22
3 5 6 8 11
17 18
9 20
4 15 21
0 ,0 0 ,1 0 ,2 0 ,3 0 ,4 0 ,5 0 ,6 0 ,7 0 ,8 0 ,9 MARTOR ( ) - MARIA 25% + Li 1 mM ( )

Fig. 118 Densitograma omogenatului celular la o cultur Fig. 119 Comparaie ntre profilul electroforetic al
tratat cu Maria 25% i Li 1 mM martorului i al culturii tratat cu Maria 25 % i Li 1 mM
24
Track 6 - Cultura de celule gliale de 14 zile tratat cu LiCl 1 mM

2 3 12
9 21
20
6
1 10 1 41 5
4 8 11 16 19
7
5 13
17 18 22
0 ,0 0 ,1 0 ,2 0 ,3 0 ,4 0 ,5 0 ,6 0 ,7 0 ,8 0 ,9 MARTOR ( ) - Li 1 mM ( )
Fig. 121 Densitograma omogenatului celular la o Fig. 122 Comparaie ntre profilul electroforetic al
cultur de 14 zile tratat cu Li 1 mM martorului i al culturii de 14 zile tratat cu Li 1 mM
Track 7 Cultura de celule gliale de 14 zile tratat cu LiCl 2 mM
1 9 12
7
2 14
8
4 6 10 13 15
3 5 11
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 MARTOR ( ) - Li 2 mM ( )
Fig. 124 Densitograma omogenatului celular la o cultur Fig. 125 Comparaie ntre profilul electroforetic al martorului
de 14 zile tratat cu Li 2 mM i al culturii de 14 zile tratat cu Li 2 mM
Track 8 - Cultura de celule gliale de 14 zile tratat cu soluie salin (50%)
20
1
19
2
3 14
12
13 16
4 7
8 10
18
5 6 9 17
21
11 15
MARTOR ( ) - S 50% ( )
0 ,0 0 ,1 0 ,2 0 ,3 0 ,4 0 ,5 0 ,6 0 ,7 0 ,8 0 ,9
g. 127 Densitograma omogenatului celular la o cultur de 14

tratat cu S 50 % Fig. 128 Comparaie ntre profilul electroforetic al martorului
i al culturii de 14 zile tratat cu S 50 %
Track 9 - Cultura de celule gliale de 14 zile tratat cu soluie salin (25 %)

1
22
21
20
2 3
12 18
13 14 1 61 7 23
4 8 11
5 6 7 9 10 19
15 24
0 ,0 0 ,1 0 ,2 0 ,3 0 ,4 0 ,5 0 ,6 0 ,7 0 ,8 0 ,9
MARTOR ( ) - S 25% ( )
R f d i st a n c e d o w n t ra c k
Fig. 131 Comparaie ntre profilul electroforetic al
Fig. 130 Densitograma omogenatului celular la cazul S 25 % martorului i al culturii de 14 zile tratat cu S 25 %
Track 10- Cultura de celule gliale de 14 zile tratat cu soluie salin (25%) i LiCl 1 mM
23
1 2
22
12 21
10
3 6 1516 17
8 9 11 20
7 14
4 5
13 18 19 24 25
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
MARTOR ( ) - S 25% i LiCl 1 mM (

Rf di stance down track
)
g. 133 Densitograma omogenatului celular la o cultur de 14 Fig. 134 Comparaie ntre profilul electroforetic al martorului
tratat cu S 25 % + Li 1 mM i al culturii tratat cu S 25 % + Li 1 mM
Concluzii
Cantitatea total de proteine se reduce la jumtate fa de martor n cazurile Maria 50% i Li 2mM;
Tratamentul cu apa Maria 50% i cel cu 2 mM Li determin creteri ale expresiei acelorai pick-uri ceea ce arat c o
parte din efectele apei Maria sunt determinate de prezena litiului;
Tratamentul cu apa Maria 25% i Li 1mM determin o cretere marcat a pick-urilor de 200, 180, 50 i 47 KDa,
observndu-se un grad ridicat de suprapunere a profilului electroforetic al omogenatului obinut n acest caz cu cel al tratamentului
cu 50% apa Maria;
25
Modificrile induse de litiu i apa MARIA asupra expresiei lamininei
Laminina este un dimer proteic cu masa molecular de 900.000 daltoni, format din trei
subuniti: o subunitate cu masa molecular de aprox 400.000 daltoni i dou subuniti cu
masa molecular de 200.000 - 250.000 daltoni.
Aceste dou subuniti se asambleaz ntr-o molecul cu aspect de cruce. Subunitatea
se dispune la capetele globulare ale fiecrui bra scurt. Ea va forma i braul scurt vertical n
totalitate. Va forma domeniul globular de la captul braului lung i axul central al braului lung.
Dup 10 zile n cultura, astrocitele imature prezint o reacie imunohistochimica
citoplasmatica intensa pentru laminin (Fig.145). n plus, n unele celule, laminina a fost localizat
i n prelungrile citoplasmatice (Fig. 146). La 20 de zile de cultivare nu au fost identificate celule
pozitive pentru laminin.
Fig. 145. Localizarea citoplasmatica a Fig. 146. Localizarea lamininei la nivelul Fig. 147. Localizarea lamininei in toata
lamininei in culturile martor dupa 10 prelungirilor citoplasmatice, in culturile citoplasma celulelor gliale la 10 zile de
zile de cultivare. X400. martor dupa 10 zile de cultivare. X400. cultivare in prezenta apei minerale
bogate in litiu. X400.
Fig. 148. Localizarea laminina in Fig. 149. Localizarea laminina in celule Fig. 150. Localizarea anormala a
celule gliale cultivate 10 zile in gliale cultivate 10 zile in prezenta de 1 lamininei in celule gliale cultivate 10
prezenta apei minerale litinifere mM LiCl. X400. zile in prezenta de 2 mM LiCl. X400.
suplimentate cu 1 mM LiCl. X400.
Modificrile induse de litiu i apa Maria asupra expresiei vimentinei

Vimentina este o protein de 52 kDa exprimat de celulele cu origine mezenchimal care
prezint multe asemanari structurale cu GFAP i desmina dei este distinct din punct de vedere
imunologic. Dupa 10 zile de cultivare vimentina a fost abundent n citoplasma astrocitelor
imature (Fig. 151), pentru ca la 20 de zile de cultivare majoritatea celulelor pozitive pentru
vimentin sa fie reprezentate de celulele gliale progenitoare imature, cu aspect bipolar (Fig. 152).
Apa mineral litinifer Maria nu modific patternul de expresie al vimentinei n celulele
gliale cultivate in vitro, nici chiar n cazul suplimentrii cu 1 mM LiCl.
26
Fig. 151. Localizarea Fig. 152. Localizarea Fig. 153. Localizarea Fig. 158. Localizarea
vimentinei in culturile martor anormala a vimentinei in anormala a vimentinei in vimentina in celule gliale
de 10 zile X400. celule gliale cultivate 10 zile citoplasma celulelor gliale cultivate 10 zile in prezenta
in prezenta de 1 mM LiCl. cultivate 10 zile in prezenta apei minerale litinifere
de 2 mM LiCl. X400. suplimentate cu 1 mM LiCl.
Proteina acid fibrilar glial (GFAP)

GFAP este o protein de 51 kDa care polimerizeaz pentru a forma filamente intermediare
prezente n celulele gliale sau celule de origine glial (Nagle,1994). Anticorpii realizai faa de
GFAP nu interacioneaza cu neuronii, fibroblastele sau celulele musculare, aspect care indica
prezena unor epitopi immunologic distinci care nu se gsesc n vimentina, desmina sau
neurofilamente, dei studiile de secveniere au indicat o omologie relativ mare a acestor structuri.
GFAP purificat din creierul de mamifere se asambleaz in vitro in filamente de 8-9 nm.
Detecia imunohistichimic a proteinei acide fibrilare gliale
Proteina acid fibrilar glial (GFAP), marker pentru identificarea astrocitelor n condiii
normale i patologice, este considerat un indicator sensibil pentru toxicitate. Studiile noastre de
imunodetecie realizate cu anticorp anti-GFAP au evideniat prezena acestei proteine att n
culturile primare de 12 zile (Fig. 159) ct i n cele de 18-20 zile (Fig. 160). Reacia pozitiz se
observ i n cazul culturilor tratate cu litiu (Fig. 161-163).
Fig. 161. Localizarea GFAP in celule Fig. 164. Localizarea GFAP in Fig. 167. Reactie imunohistochimica
gliale cultivate 10 zile in prezenta de culturile martor dupa 20 zile de mai intensa pentru GFAP in celule
1 mM LiCl. X400. cultivare. Se remarca cresterea gliale cultivate 20 zile in prezenta
numarului de prelungiri apei minerale bogate in litiu MARIA
citoplasmatice GFAP pozitive. (25%) . X400.
X400.
27
Imunodetecia prin Western blotting a proteinei acide fibrilare gliale
Control pozitiv: IgG secundar

1; 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1 g
Fig. 171- Analiza imunoblot a expresiei GFAP n culturile gliale de 14 zile
1. MARTOR, 2. MARIA 50%, 3. MARIA 25%, 4. MARIA 25% + Li 1 mM, 5. Li 1 mM,
TRACK PROBA Cantitate %

10
1 MARTOR 0,18 g 4,33
8
2 MARIA 50% 0,05 g 1,75 6
3 MARIA 25% 0,15 g 9,11 4
4 MARIA 25% + Li 1 mM 0,13 g 5,22 2
5 Li 1 mM 0,16 g 5,11 0
1 2
6 Li 2 mM 0,16 g 8,74 3 4 5 6 7 8
S1
9
7 S 50% 0,2 g 5,05
8 S 25% 0,2 g 3,26
9 S 25% + Li 1 mM 0,12g 3,51
Detecia imunohistologic a expresiei GSK-3 la culturile de celule gliale tratate cu

litiu i apa mineral MARIA
GSK-3, o protein de 47 KDa, a fost denumita dupa capacitatea ei de a fosforila si astfel

inactiva glycogen sintaza, proces cheie n sinteza glicogenului. n prezent se cunoate ca GSK-3
este un component important al cailor de semnalizare cuplate cu receptorii pentru insulina, diferiti
factori de cretere i neurotrofine, precum si alte molecule de semnalizare. GSK-3 nu este numai
un component al cilor de semnalizare ci are i un rol important de reglare a unor factori
transcripionali, care la rndul lor controleaza exprimarea unor gene (Grimes si Jope, 2001).
Fig. 187. Reactie Fig. 188. Prezenta Fig. 190. Reactie Fig. 191. Absenta reactiei
imunohistochimica slaba perinucleara a GSK-3 in imunohistochimica slaba pentru imunohistochimice pentru GSK-
pentru GSK-3 in culturile culturile martor dupa 10 zile GSK-3 in celule gliale 3 in celule gliale cultivate 10
martor dupa 10 zile de de cultivare. X400 cultivate 10 zile in prezenta zile in prezenta de 2mM LiCl.
cultivare. X400. apei minerale MARIA X400
25%suplimentate cu Li 1 mM
28
Analiza prin imunodetecie Western blotting a expresiei GSK-3 induse de litiu i apa
MARIA la culturi de celule gliale de 14 zile
Control pozitiv: IgG secundar

1; 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1 g
Fig. 193- Analiza imunoblot a expresiei GSK-3 n culturile gliale de 14 zile
2. MARTOR, 2. MARIA 50%, 3. MARIA 25%, 4. MARIA 25% + Li 1 mM, 5. Li 1 mM,
6. Li 2 mM, 7. S 50%, 8. S 25%, 9. S25% + Li 1mM
TRACK PROBA Cantitate %
0,5
1 MARTOR 0,3 g 7,23
2 MARIA 50% 0,1 g 3,82 0,4
3 MARIA 25% 0,36 g 11,53 0,3
4 MARIA 25% + Li 1 mM 0,41 g 16,57 0,2
5 Li 1 mM 0,46 g 14,69 0,1
6 Li 2 mM 0,33 g 16,36 0
1
7 S 50% 0,37 g 9,5 2 3 4 5 6
S1
7 8
8 S 25% 0,27 g 4,42 9
9 S 25% + Li 1 mM 0,37 g 10,6

Fig. 203 Graficul expresiei GSK-3 pentru fiecare caz al culturii de celule gliale de 14 zile
Detecia imunohistologic a expresiei SHIP2 la culturile de celule gliale tratate cu litiu

i apa mineral MARIA
Inozitol fosfat polifosfatazele sunt enzime care modifica poziia gruprilor fosfat de la
nivelul fosfatidilinozitolilor, ceea ce are ca efect generarea mesagerilor secundari, ca raspuns la
semnale extracelulare.
Celulele gliale martor prezinta o reacie imunohistochimica intensa pentru SHIP2,
observndu-se localizarea cortical a proteinei (Fig.204).
Fig. 205. Reactie imunohistochimica Fig. 207. Reactie imunohistochimica Fig. 209. Reactie imunohistochimica
slaba pentru SHIP2 in celule gliale pentru SHIP2 in celule gliale slaba pentru SHIP2 in celule gliale
cultivate 10 zile tratate cu 1 mM cultivate 10 zile tratate cu 2 mM cultivate 10 zile in prezenta apei
LiCl. X400. LiCl. X400. minerale litinifere Maria 25%. X400.
29
Concluzii generale
1. Apa mineral litinifer MARIA de la Malna-Bi, Judeul Covasna, conine
substane minerale care i confer proprieti terapeutice i care justific valoarea sa
medical, fr s existe pericole pentru sntatea uman, fapt demonstrat de
capacitatea apei de a menine viaa celulelor gliale cultivate n laborator; Singura
atenionare trebuie fcut n legtur cu salinitatea ridicat a apei (5,8 g la litru), ceea
ce necesit integritatea funciei renale i un nivel optim al filtrrii glomerulare;
2. Nivelul litiului din apa mineral MARIA atinge o concentraie de 8,03 mg la litru,
ceea ce face ca nivelul seric atins prin consumul zilnic a unui litru de ap s creasc
cu 0,25 mM. Acest nivel este sub cel al intervalului terapeutic, i de 10 ori mai mic
dect nivelul toxic de 2mM, asigurnd sigurana consumului apei;
3. Studiul morfologiei celulelor gliale demonstreaz c un consum zilnic de ap de
pn la un litru, corespunztor cazului de tratament cu 25% al culturilor de celule
gliale, are efecte pozitive asupra celulelor, mbuntind comunicarea intercelular i
crescnd nivelul interconexiunilor;
4. Testele biochimice efectuate arat c parametrii biochimici ai mediului de
cultivare al celulelor sunt apropiai n cazul tratamentului cu ap Maria 25% de cei
determinai la martor;
5. Profilul electroforetic al omogenatului celular al culturii tratat cu 25% ap
mineral Maria are un grad foarte mare de potrivire cu profilul obinut n cazul
tratamentului cu Li 1 mM i n cazul martor;
6. Detecia imunohistochimic a fibronectinei, lamininei i vimentinei nu arat
diferene semnificative ale distribuiei celulare a acestor proteine la martor, Maria 25
% i Li 1 mM;
7. Detecia prin Western blotting a proteinelor GFAP, GSK-3 i SHIP2 subliniaz
caracterul terapeutic al apei minerale MARIA prin concordana rezultatelor obinute
la cazurile Maria 25% i Li 1 mM, fa de martor;
8. Nivelul de 50% ap mineral MARIA este similar n efecte cu cazul tratamentului
cu Li 2 mM, ns acest nivel nu constitue dect o variant experimental, fr
relevan clinic, deoarece ar presupune un consum zilnic foarte mare de ap mineral
MARIA;
9. Soluia salin care mimeaz coninutul de Na, K, Ca i Mg din apa mineral Maria
are efecte pozitive asupra celulelor gliale, mrind rata de diviziune i difereniere
celular;
10. Rezultatele obinute fundamenteaz proprietile terapeutice i certific rolul apei
minerale MARIA n tratamentul maniaco-depresiei, prin asemnarea modificrilor
produse asupra celulelor gliale cu cele generate de tratamentul cu litiu 1mM.
30
Bibliografie selectiva
1. Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. (1994) Molecular biology of the cell, IIIrd
ed. Garland Publ. New York and London.
2. Angst J. Do Many Patients with Depression Suffer From Bipolar Disorder?, Canadian Journal of
Psychiatry, Vol. 51, No. 1, p: 3-5, 2006;
3. Arenander A.T., De Vellis J. (1994) Development of the nervous system. In: Basic neurochemistry:
Molecular, cellular and medical aspects, 5th ed. Ed. by Siegel G.J. et al., Raven press, New York: 573-606.
4. Berridge M.J., Downes C.P., Hanley M.R. (1989) Neural and developmental actions of lithium: A unifying
hypothesis. Cell 59: 411-419.
5. Bhat N.R. (1995) Signal transduction mechanisms in glial cells. Dev. Neurosci. 17: 267-284.
6. Birch N.J. (1999) Inorganic pharmacology of lithium. Chem. Rev. 99: 2659-2682.
7. Chang C.M.J., Jones C.R. (1998) Chronic lithium treatment decreases brain phospholipase A2 activity.
Neurochem. Res. 23: 887-892.
8. DMello S.R., Anelli R., Calissano P., (1994) Lithium induces apoptosis in immature cerebellar granule cells
but promotes survival of matue neurons. Experimental Cell Research 211, 332-338;
9. Daugherty D., Roque-Urrea T., Roque-Urrea J., Snyder J., Wirkus S., Porter M.A. Mathematical Models of
Bipolar Disorder, 1-24, 2004;
10. Del Rio E., Shinomura T., van der Kaay J., Nicholls D.G., Downes C.P. (1998) Disruption by lithium of
phosphoinositide signalling in cerebellar granule cells in primary culture. J. Neurochem. 70: 1662-1669.
11. Detera-Waldeigh S.Lithium-related genetics of bipolar disorder. Ann. Med. 33, 2001
12. Gorgos C. (1985) Vademecum n psihiatrie. Ed.Medical. Bucureti: 561-565.
13. Grafe P., Reddy M.M. (1983) Effects of lithium on electrical activity and potassium ion distribution in the
vertebrate central nervous system. Brain Res. 279: 65-76.
14. Harwood A.J. Lithium and bipolar mood disorder: the inositol-depletion hypothesis revisited, Molecular
Psychiatry, Vol.10, 117-126, 2005;
15. Ikonomov O.C., Manji H.K. Molecular Mechanisms Underlying Mood Stabilization in Manic-Depressive
Illness: The Phenotype Challenge, American Journal of Psychiatry, Vol. 156, 1506-1514, 1999;
16. Jope R.S. (1999) A bimodal model of the mechanism of action of lithium. Mol. Psychiatry 4: 21-25.
17. Klein P.S., Melton D.A. (1996) A molecular mechanism for the effect of lithium on development. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93, 8455-8459;
18. Lenox R.H., Hahn C.G. (2000) Overview of the mechanism of action of lithium in the brain: Fifty-year
update. J. Clin. Psichiatry 61, 5-15;
19. Lenox R.H., Wang L. Molecular basis of lithium action: integration of lithium-responsive signaling and
gene expression networks, Molecular Psychiatry, Vol. 8, 135-144, 2003;
20. Manji H.C., Potter W.Z., Lenox R.H. (1995) Signal transduction pathways. Molecular targets for lithiums
actions. Arch. Gen. Psychiat. 52: 531-543.
21. Manji H.K., Drevets W.C., Charney D.S. The cellular neurobiology of depression, Nature Medicine, Vol.7,
Nr.5, 541-547, 2001;
22. Manji H.K., Moore G.J., Chen G. Bipolar disorder: leads from the molecular and cellular mechanisms of
action of mood stabilisers, British J. of Psychiatry, 178, 107-119, 2001;
23. McCarthy K., DeVellis J. (1980) Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat
cerebral tissue. J Cell Biol.85: 890-902.
24. Nonaka S., Hough C., Chuang D.M. (1998) Chronic lithium treatment robustly protect neurons in the central
nervous system against excitotoxicity by inhibiting N-methyl-D-aspartate receptor-mediated calcium influx.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2642-2647.
25. Oakley p.W., Dawson A.H., White I.M. (2000) Lithium: Thyroid effects and altered renal handling. Clinical
Toxicology 38, 333-337;
26. Phiel C.J., Klein P. (2001) Molecular targets of lithium action. Annu. Rev Pharmacol. Toxicol. 41, 789-813;
27. Reiser G., Duhm J. (1982) Pathways for transport of lithium ions in neuroblastoma x glioma hybrid cells at
therapeutic concentrations of Li. Brain Res. 252: 247-258.
28. Schrauzer G.N. Lithium: Occurrence, Dietary Intakes, Nutritional Essentiality, Journal of American
College of Nutrition, Vol.21, Nr.1, 14-21, 2002;
29. Timmer R.T., Sands J.M. (1999) Lithium intoxication, J. Am. Soc. Nephrol 10, 666-674;
30. Williams R.S.B., Harwood A.J.-Lithium therapy and signal transduction, TiPS, 21, 2000;
31. Zamfirescu Gabriela, Meter Radu - Celulele gliale componente eseniale ale sistemului nervos, Editura
Academiei Romne, Studii i cercetri de BIOLOGIE, Seria Biologie Animal, Tomul 50, nr.1, p.65-74,
Bucureti, 1998;
31

LITIUL Terapeutic PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

LITIUL Terapeutic PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

RSPUNSUL GLIAL LA LITIU I APA MINERAL

Reducerea semnificativ a celulelor gliale n aceste regiuni este n mod particular

-desensibilizeaz receptorul pentru serotonin (Geisser et all, 1988)

APA MINERAL LITINIFER MARIA

Determinarea proprietilor chimice i fizice ale apei minerale

Microscopia n contrast de faz

Tehnica de imunobloting, cunoscut ca Western blotting a fost descris de Towbin et all

Buletin de analize al apei minerale MARIA

Iod I- 0,7 0,006 0,006 0,008 0,017

Amoniu NH+ 0,7 0,039 0,039 0,008 0,034

Obinerea, cultivarea i caracterizarea morfologic a culturilor de celule gliale

Fig. 20 Pui de obolan Wistar de 3-4 zile, provenii de la Biobaza INRMFB

Prelevarea encefalului se realizeaz n condiii de sterilitate, cu instrumentar chirurgical.

Fig. 21 Encefalul prelevat de la pui Wistar de 3-4 zile

Dup ndeprtarea meningelui, creierul este pasat printr-un nytex de 60 m. Mediul se

Fig. 22 Schimbarea mediului de cultivare a culturilor de cellule gliale

3 zile 4 zile 5 zile

6 zile 7 zile 8 zile

10 zile 11 zile 12 zile

n primele 24 de ore de cultur, celulele din inocul se aeaz pe suprafaa de cultur n

Efectele litiului asupra morfologiei culturilor de celule gliale

LITIU 1mM Ziua 7 LITIU 1mM Ziua 8 LITIU 1mM ziua 9

LITIU 1mM ziua 10 LITIU 1mM ziua 13 LITIU 1mM Ziua 15

LITIU 2 mM ziua 7 LITIU 2 mM Ziua 8 LITIU 2 mM Ziua 9

LITIU 2 mM Ziua 10 LITIU 2 mM Ziua 11 LITIU 2 mM Ziua 15

Efectele apei minerale MARIA asupra morfologiei culturilor de celule gliale

Tratamentul cu apa mineral Maria presupune prepararea mediului de cultivare nlocuind o

M50-ziua 7 M25-ziua 7 M25 + Li 1 mM-ziua 7

M50-ziua 8 M25-ziua 8 M25 + Li 1 mM-ziua 8

M50-ziua 9 M25-ziua 9 M25 + Li 1 mM-ziua 10

M50-ziua 10 M25-ziua 11 M25 + Li 1 mM-ziua 11

M50-ziua 11 M25-ziua 12 M25 + Li 1 mM-ziua 12

S50 ziua 7 S25 ziua 7 S25 + Li 1mM ziua 7

S50 ziua 9 S25 ziua 9 S25 + Li 1mM ziua 9

S50 ziua 11 S25 ziua 11 S25 + Li 1mM ziua 11

S50 ziua 13 S25 ziua 13 S25 + Li 1mM ziua 13

S50 ziua 15 S25 ziua 15 S25 + Li 1mM ziua 15

Evoluia activitii lactat dehidrogenazei

4 Maria 25% + Li 1mM 9,137031 10

9 S25% + Li 1mM 13,71274

Modificarea nivelului de creatinina

2 Maria 50% 0,014 0,035

3 Maria 25% 0,015 0,025

4 Maria 25% + Li 1mM 0,015

5 Li 1mM 0,035 0,01

9 S25% + Li 1mM 0,030

2 Maria 50% 2,6125 30

3 Maria 25% 10,8625 25

9 S25% + Li 1mM 26,2625

Modificarea nivelului ureei

2 Maria 50% 0,3880 2

3 Maria 25% 1,4975 1.5

4 Maria 25% + Li 1mM 0,9950 1

Modificarea coninutului de colesterol din mediu

4 Maria 25% + Li 1mM 0,0870 0,1

5 Li 1mM 0,0880 0,05

Schimbri ale nivelului de trigliceride

2 Maria 50% 10,758 10

3 Maria 25% 2,562 8

4 Maria 25% + Li 1mM 0,8695 6

9 S25% + Li 1mM 1,7295

Modificri ale activitii transaminazei glutamic-piruvice (TGP)