10.12.

2014

ADN ARN Proteine

Northern- Western-
Secvențiere
blot blot

PCR RT-PCR Secvențiere

Southern- Hibridarea Analiza

blot in situ histochimică

Hibridarea Analiza
in situ funcției

Utilizarea tehnicilor de analiză

a acizilor nucleici
Analiza ADN:
• depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al bolilor genetice
(prenatal, postnatal precoce);
• identificarea polimorfismului individual → dactiloscopie genomică
(analiza filiaţiei);
• depistarea ADN străin (bacterian, viral) → diagnosticul bolilor
infecţioase şi gradului de infectare.
Analiza ARNm:
• analiza expresiei genice ţesut-specifică;
• evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice;
• Depistarea ARN străin (viral) → diagnosticul bolilor infecţioase şi
gradului de infectare.

1
 10.12.2014

Izolarea acizilor nucleici

ADN
Colectarea materialului biologic
• (celule nucleate din orice ţesut)

Izolarea nucleilor (opţional)

• prin lezarea celulelor în soluţii hipotonice

Lezarea celulelor (nucleilor)

• prin acţiunea detergenţilor

Deproteinizarea:
• prin acţiunea proteazelor, urmată de prelucrarea
cu solvenţi organici (fenol, cloroform)

Precipitarea acizilor nucleici

• în prezenţa alcoolilor şi a sărurilor (70% etanol)

Izolarea acizilor nucleici

ARN
Colectarea materialului biologic
• din ţesutul de interes la stadia de interes

Lezarea celulelor
• în prezenţa detergenţilor şi a inhibitorilor de ARN-
aze

Deproteinizarea
• cu utilizarea solvenţilor organici

Precipitarea selectivă a ARN

• în prezenţa sărurilor (LiCl, CH3COONa)

Precipitarea ARN
• în prezenţa alcoolului.

ADN
ADN recombinant – recombinant
moleculă de ADN obţinută
din segmente de origine
diferită, capabilă să
funcţioneze

2
 10.12.2014

Scopul tehnologiei ADN rec

Clonarea • multiplicare;
genei/secvenţei de • izolare şi formare a bibliotecilor de ADNrec;
interes cu scop de: • analiză moleculară.

Expresia genică cu • analiză a funcţiei genei clonate;

scop de: • obţinerea produsului proteic.

Etapele obţinerii ADN recombinant

Izolarea ADN de cercetat şi a vectorilor de clonare

Clivare enzimatică a ADN de cercetat şi vectorului de clonare

Ligarea fragmentului de ADN de interes cu vectorul de clonare – obţinerea ADN

recombinant

Introducerea ADN recombinant într-o gazdă de clonare – transformare

Clonarea genei de interes prin replicarea vectorului

Expresia genei de interes prin sinteza proteinei

Selecţia celulelor transformate prin tratare cu antibiotice şi utilizînd marcherei

radioactivi sau fluorescenţi

Etape necesare pentru manipularea

ACIZILOR NUCLEICI
- Cum se izolează ADN sau ARN dintr-o celulă?
- Cum se obţin fragmente de ADN de cercetat?
- FR (ER, SR, RFLPs, hărţi de restricţie)
- ADNc (ADN complimentar unei mol. ARNm);
- Cum se separă fragmentele de AN şi cum se apreciază
lungimea → comparare a ADN la diferite persoane
(electroforeza AN)?;
- Cum se vizualizează ADN, având dimensiuni
submicroscopice?
- Principiile clonării ADN in vivo (vectori de clonare,
gazde de clonare) şi clonării ADN in vitro;
- Denaturarea ADN in vitro
- Hibridizarea mol. ADN (ADN/ADN; ADN/ARN)

3
 10.12.2014

Componentele necesare pentru

tehnologia AND rec = clonarea ADN in vivo:

ADN de clonat (de cercetat): FR, ADNc

Vector de clonare

Enzime de restricţie = restrictaze

Gazdă de clonare compatibilă cu vectorul

Sistem de selecţie a clonelor analizate

Set de enzime pentru manipularea ADN

Dimensiunile inserţiilor clonate în diferiţi

vectori
Vectorul Dimensiunile fragmentului Gazda de
inserat clonare
Plasmide Până la 10 kb (ADN Bacterii,
genomic, ADNc) Drojdii
Bacteriofagi Până la 25 kb (ADN Bacterii
genomic, ADNc)
Cosmide 30-45 kb (ADN genomic) Bacterii

BAC (Cromozom artificial Până la 300 kb (ADN Bacterii

al bacteriilor) genomic)
YAC (Cromozom artificial 0,2-2.0 Mb (ADN genomic) Drojdii
al drojdiilor)

Vectorul:
-se replică autonom în celula gazdă (conţine punct ori)
-are capacitate să insereze şi să transfere ADN străin (conţine situsuri de
restricţie)
-conţine gene de rezistenţă la antibiotice (capacitate de a fi selectate)

4
 10.12.2014

Celula bacteriană

Cromozom artificial
Vector plasmidic al drojdiilor (YAC)

Ligarea inserţiilor în vector

5
 10.12.2014

Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin

acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)

Situsuri recunoscute de enzime de restricţie

6
 10.12.2014

RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z

• edonuclează situs specifică de origine

ER bacteriană care recunoaşte un SR şi clivează
ADN bicatenar
• secvenţă palindromică de nucleotide,
SR recunoscută şi clivată de enzimele de
restricţie
• fragment ADN bicatenar obţinut prin clivare
FR
cu ajutorul restrictazelor
• Polimorfismul Lungimii Fragmentelor de
RFLPs Restricţie, ce identifică diferenţele
individuale ale moleculelor de ADN

Hărţi de • dispunerea relativă a situsurilor de restricţie

restricţie într-o moleculă de ADN

-
12 kb

10 kb 10 kb

8 kb

6 kb 6 kb
2,5 kb

10 kb 5 kb
6 kb 4 kb
5 kb
2,5 kb
2 kb

+
M

7
 10.12.2014

Vizualizarea ADN

Colorarea specifică Vizualizare cu sonde marcate

Fuxnă bazică Fluorescente Radioactive

(in situ) (reci) (calde)

Bromură de
etidiu
(În geluri)
Este necesar de ştiut

Sunt necesare structura secvenţei

cantităţi mari de ADN ADN de cercetat

8
 10.12.2014

Clonarea in vivo, într-o cel

bactreriană, a unei gene umane

Probleme:
• Genele umane sunt mari;
• Conţin secvenţe reglatoare
diferite de cele a bacteriilor;
• Conţin introni ce nu pot fi
înlăturaţi ce celula
bacteriană.

Soluţie:
Obţinerea unui ADNc pe baza
ARNm caracteristic genei
ţintă

Izolarea ARN poli(A)+

Hibridarea poli(A) cu oligo(dT)

Sinteza ADNc cu ajutorul revertazei

(ARN-polimerază-ADN-dependentă)

Hidroliza ARN
(ARN-aza H)

Sinteza ADN bicatenar

(ADN-polimeraza)

Etapele obţinerii ADNc (ADN

complementar)

Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor nucleici:

Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul

expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinţelor
mutaţiilor.

Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii - prenatal sau postnatal,

cu scop de prevenire a naşterii copiilor cu anomalii genetice sau
manifestării unor patologii severe.

Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea vectorilor de gene

etc.).

Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în diagnosticul bolilor

infecţioase.

Identificarea polimorfismelor individuale în analiza filiaţiei, în criminalistică.

9
 10.12.2014

Molecule
ADN

Clonare Analiză
ADN moleculară

Clonare in Clonare in Hibridare

vivo vitro (PCR) moleculară

Clonarea ADN
= multiplicarea unei mol ADN prin replicare repetată

in vivo in vitro

Tehnologia ADN recombinat

Utilizarea celulei – gazdă de Tehnica PCR
clonare
Este realizată în eprubetă
Replicarea într-un vector de
clonare cu utilizarea aparatului Replicarea unei secvenţe de
de replicare a celulei gazdă interes cu ajutorul unui aparat
de replicare artificial
Cu posibilitatea obţinerii
produsului proteic

Clonarea in vitro – PCR

(reacţia ciclică de polimerizare a
noilor copii de ADN)

10
 10.12.2014

Componentele necesare pentru

clonarea in vitro (PCR):
- ADN de cercetat
- Primeri specifici secvenţei de clonat –
complimentari secvenţelor flancante
- Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă
- Dezoxinucleozidtrifosfaţi (dNTP)
- Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii:
- tº de denaturare ADN
- tº de renaturare (ADN+primer)
- tº de polimerizare (elongarea catenelor
noi de ADN)

Etapele tehnicii PCR

A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante
B. Repetarea automată a procedurelor de denaturare-
renaturare-elongare de 30-35 ori
•Denaturarea ADN la 96oC
•Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor
•Elongarea catenelor ADN la 72oC
C. Analiza produşilor PCR
- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor

11
 10.12.2014

Biblioteci de gene
Biblioteci genomice – conţin secvenţe de ADN
genomic, obţinut prin digestie enzimatică

Biblioteci ADNc – conţin secvenţe de ADNc,

obţinute în baza setului de ARNm

Biblioteci cromozomiale – conţin secvenţe

caracteristice unui cromozom

Etapele obţinerii
bibliotecii genomice

•Izolarea ADN genomic

•Restricţia ADN genomic
şi vectorial

•Ligarea ADN vectorial cu

fragmente ADN genomic

•Introducerea moleculelor
recombinate în gazdă

•Selecţia clonelor

12
 10.12.2014

Etapele obţinerii bibliotecii ADNc

•Izolarea ARNm
•Sinteza ADNc

•Ligarea linkerilor
la capetele ADNc

•Restricţia ADNc şi
a vectorului
•Ligarea ADNc -
vector
•Transformarea
gazdei potrivite
•Selecţia clonelor

13