IDENTIFICAREA PROTEINELOR PRIN WESTERN BLOTTING

Metoda Western blot este una din metodele de bază utilizate in laboratoarele de
biologie celulară și moleculară. Folosită corect, această metodă duce la rezultate ușor de
interpretat, unice, lipsite de ambiguitate, care pot fi utilizate ca atare sau in completarea altor
metode de imunomarcare, in cercetare sau în diagnosticul de laborator.

1. Noțiuni generale: definiția metodei, denumirea metodei

Definiție: WB, cunoscută și sub denumirea de imunoblot, este o tehnică analitică
pentru identificarea unei proteine specifice dintr-o probă de omogenat tisular sau celular, ori
din probe biologice lichide (ser sau LCR).
Tehnica WB aduce informații concrete și utile care nu pot fi puse la dispoziție prin alte
metode de imunomarcare.
Dacă proteina, deși prezentă în probă, este modificată calitativ sau cantitativ, se poate
observa prin prezența unei benzi mai subțiri, mai groase, poziționată mai sus sau mai jos față
de banda proteinei martor sau chiar prin prezența a doua benzi în loc de una. Aceste
modificări față de o probă martor, cu o proteină normală, ne dă urmatoarele indicații: fie
proteina țintă este degradată, fie este cantitativ redusă sau în exces, fie este glicozilată sau
formează multimeri. De asemenea ne poate ghida către o investigație genetică in cazul unei
deleții parțiale sau duplicații în gena respectivei proteine.
De asemenea metoda WB permite compararea expresiei proteinei tintă în mai multe
probe, fie in același țesut, fie in țesuturi diferite, în scop de cercetare sau diagnostic, indicând
modificări patologice sau ca răspuns la un anumit tratament.
W. Neal Burnette a denumit această tehnică, în 1979, ca un joc de cuvinte derivat de
la tehnica Southern blot, o tehnică utilizată pentru detectarea ADN, pusă la punct de Edwin
Southern (1975). În mod similar, tehnica de detectare a ARN, a fost denumită Northern blot,
iar detectarea modificărilor post-translaționale a proteinelor se numește Eastern blot. Metoda
WB a fost pusă la punct în laboratorul prof. George Stark, la Stanford, de către Harry Towbin
și col., în 1979, iar ulterior a suferit multe modificări și imbunătățiri.
 2.Principiul metodei
Pentru identificarea proteinei tintă, proteinele din proba biologică trebuie întai separate
în funcție de greutatea lor moleculară prin electroforeza în gel de poliacrilamidă, transferate
apoi pe un suport solid, membrană de nitroceluloză sau PVDF, urmând imunodetecția
proteinei urmărite, cu anticorpi specifici.
Odată detectată, sceasta proteina va fi vizualizată printr-una din metodele ce pot fi utilizate în
acest sens, in funcție de posibilitațile și experiența laboratorului: chemiluminiscența chimică,
imagistica.
WB este asadar o tehnică in 4 pași:
Electroforeza în gel a probei care conține proteina de interes
Transferul electroforetic al proteinei ținta de pe gel pe membrană (Blotare)
Imunomarcarea proteinei de interes cu anticorpi specifici
Vizualizarea proteinei țintă


Fig.1 Principalele etape ale metodei Western blot: 1) Electroforeza SDS-PAGE; 2)
Transferul proteinelor de pe gel pe membrană (blotarea); 3) Imunomarcarea și Vizualizarea
proteinei de interes din probele biologice.
 3. Pregătirea probelor biologice
a) Obținerea lizatului tisular
Este esențial ca probele de țesut sa fie păstrate în bune condiții, astfel încat proteinele să nu fie
distruse. Încă de la recoltarea probelor biologice, acestea trebuie păstrate la rece, pe gheată, în
timpul transportului și manipulării, pentru a reduce la maxim proteoliza, defosforilarea sau
denaturarea proteinelor.
- Țesutul se omogenizeaza astfel încat proteinele celulare să fie eliberate și solubilizate.
Se utilizează o solutie tampon de liză, care conține obligatoriu inhibitori de proteaze
și/sau fosfataze, în care se omogenizează țesutul, cu ajutorul unui omogenizator.
Raport optim: 1-5 mg tesut/1 ml tampon de liză.
- Centrifugare la 40C, 20 minute, la 12.000 rpm.
- Se recoltează supernatantul. Se păstrează timp de 2-3 luni la -200C sau pentru mai
mult timp la -800C.
b) Obținerea lizatului celular
- Celulele se recoltează din recipientul de cultură,
- se spală se centrifughează,
- depozitul de celule se resuspendă în tampon de liză cu inhibitori de proteaze. Toate aceste
operații se fac pe gheață.
Denaturarea proteinelor se face pe de o parte prin fierbere (la 95-1000C, 5 minute),
în prezența de SDS (Sodium Dodecyl Sulfat).
Se pierde structura secundară si terțiara a proteinei, se facilitează accesul
anticorpilor la epitopi (secvența de aminoacizi recunoscută de anticorp). SDS este conținut în
reactivul Laemmli, în soluția tampon de electroforeză (de migrare) și uneori se poate adauga
și in soluția tampon de liză (în funcție de reteta utilizată).
 Fig.2 Pregătirea probelor biologice înainte de electroforeză: omogenizarea probei
biologice în tampon de extracție cu un omogenizator Potter; calcularea concentrației proteice;
denaturarea termică a proteinelor.

Electroforeza în gel
Electroforeza SDS-PAGE, este procedeul prin care proteinele migrează, în gel, într-un
câmp electric și se separă în funcție de greutatea lor moleculară. Se utilizează o soluție
tampon de migrare care conține SDS și care se adaugă în tancul de electroforeză.

Fig. 3 Suporturi cu geamuri montate pentru turnarea gelurilor.

 Fig. 4 Electroforeza SDS-PAGE: tanc pentru electroforeza; suport cu electrozi pentru
geluri.

5. Transferul proteinelor (Blotarea)

După ce proteinele s-au separat pe gel, urmează transferul lor pe un suport mai dur si ușor de
manipulat, pentru analiza lor ulterioară. Metoda de blotare în camp electric (Towbin et al.,
1979) este utilizată în cele mai multe laboratoare, fiind rapidă și eficientă. Câmpul electric
este orientat perpendicular pe suprafața gelului și membranei.
Există două sisteme principale de transfer al proteinelor de pe gel pe membrană:
– semi-uscat
– umed
- Gelul și membrana sunt asamblate într-un sistem sandwich, între hârtii de filtru,
eventual bureți, care să le protejeze și să le mențină în contact strâns. Important:
plasarea membranei să se faca între gel și electrodul pozitiv, astfel ca proteinele
încarcate negativ să migreze dinspre gel spre membrană. În timpul montării
sandwich-ului trebuie să se îndepărteze cu grijă bulele de aer.
- Soluția tampon utilizată în acest caz este soluția tampon de transfer, (asemanatoare
celei de la electroforeză), dar nu conține SDS. Conține metanol, care ajută proteinele
să se lege de membrană.
Membranele pentru transfer sunt membrana de nitroceluloza și membrana PVDF
(polyvinylidene difluoride).
 - Transferul se face dinspre catod spre anod. Se menține fie amperajul, fie voltajul
constant.
Transferul umed. Se utilizeaza un tanc plin cu soluție tampon de transfer, în care se
scufundă caseta/casetele cu sandwich-ul gel/membrana/hartie de filtru/bureți, puse într-o
anumită ordine și in conexiune cu poziția fată de catod și anod.

În tanc se pune obligatoriu și un suport care conține gheată (în funcție de tipul de suport se
utilizează apă sau tampon inghețat), deoarece în timpul transferului se degajă caldură.

Fig. 5 Ordinea componentelor sandwich-ului de transfer în cazul modului de

transfer umed

Fig. 6 Transferul umed: tanc de transfer cu capac, suport cu electrozi, suport pentru
sandwich-ul de transfer alcătuit din gel, membrană, hartie de filtru si bureți.
 6. Imunomarcarea

Imunomarcarea proteinei de interes se face cu anticorpi specifici.

Se pot utiliza:
- marcarea directă care utilizează un anticorp primar direcționat contra proteinei țintă,
legat cu o substantă de marcaj.
- Marcarea indirectă, utilizează un anticorp primar anti-proteină țintă și un anticorp
secundar direcționat contra anticorpului primar, acesta fiind legat cu substanța de
marcaj.
Pasii imunomarcării:
 Blocarea: previne legarea nespecifică a anticorpilor pe suprafața membranei,prin
incubarea cu o soluție proteică, neutră în raport cu protocolul de imunomarcare. Se
recomandă lapte degresat 5% în tampon TBS (solutie tampon TRIS), ori BSA
(bovine serum albumine) 3-5% în TBS. Pentru detecția fosfoproteinelor se
recomandă blocarea cu BSA, deoarece laptele conține fosfoproteine (caseina) care
pot interfera cu imunodetecția. Timpul de blocare: 30 minute Dupa blocare,
membrana se spală cu TBST (TBS+Tween20, un detergent), 5 min.
 Incubarea cu anticorpi specifici: se incubează membrana cu soluția de anticorpi
specifici (marcați sau nu), timp de 2 ore la temperatura camerei sau peste noapte la
rece. Peste membrana se toarnă soluție de anticorp de detecție (diluați
corespunzator în TBS. Optimizarea diluției anticorpilor să se facă de fiecare dată
cand se lucrează cu un anticorp nou).
 Pentru a intensifica semnalul, se utilizează anticorpi secundari cuplați cu biotina.
 După incubarea cu anticorpul primar, membrana este spalată cu TBST.
 Atat blocarea, spălările, cât și incubarea cu anticorpi a membranei trebuie facute
cu suficient reactiv cât să spele bine membrana, pe un agitator. Membrana nu
trebuie în nici un caz să se usuce.
 Se adaugă anticorpul secundar (cuplat cu o enzimă, peroxidaza, HRP “horseradish
peroxidase” sau fosfataza alcalină, AP) detectabilă prin utilizarea unui substrat
care produce un semnal vizibil, sau un marker fluorescent.
 Notă: în cazul sistemului ce utilizează anticorpi biotinilați, se adaugă o enzimă
cuplată la streptavidină, care permite cuplarea la biotina de pe anticorp.
 Fig.7 Detecția proteinei de interes prin imunomarcare pe membrană: incubare cu
anticorpul primar specific; incubare cu anticorpul secundar cuplat cu o enzimă; vizualizarea
substanței de marcaj cu ajutorul unui substrat enzimatic.

7. Vizualizarea proteinei de interes.

Cea mai utilizată enzimă ca substanță de marcaj, legată de anticorpul primar, este HRP. HRP
este detectată când vine in contact cu o soluție cu substrat pentru aceasta enzimă, un reactiv
chimic cu care interactionează și produce un semnal vizibil, detectabil colorimetric sau
chemiluminiscent.
Substratul pentru HRP este DAB (diaminobenzidina), care produce o culoare maro. Detecția
durează de la cateva minute la cateva ore, pană apar benzile vizibile – unde se află proteina
țintă.
Alternative moderne: chemiluminiscența, ECL (enhanced chemiluminescence). Substratul
utilizat este luminolul, care este oxidat de HRP in prezența H2O2, producând lumina. Aceasta
este detectata prin expunera membranei unui film radiologic Timpul de detecție este scurt, de
la cateva secunde, la 30 minute (rareori mai mult). Filmul developat, poate fi păstrat
permanent, iar vizibilitatea este foarte bună.

Metoda WB aplicată in diagnosticul medical

Diagnosticul infecțiilor virale

- Confirmarea testelor HIV în cazuri neconcludente
- Hepatita B
 - Confirmarea testelor FIV la feline, în medicina veterinară
Diagnosticul infecțiilor bacteriene
- Boala Lyme
Diagnosticul infecțiilor parazitare
- Protozoare (exemple: Toxoplasma gondii, Plasmodium falciparum)
- Viermi (exemple: Trichinella spiralis, Fasciola hepatica, Capillaria sp.)
Diagnosticul unor boli prin detectarea proteinelor umane specifice acestora
- Encefalopatia spongiformă bovină (boala Creutzfeldt-Jakob)
- Distrofii musculare
- Unele forme de cancer

BIBLIOGRAFIE

Moore C - Introduction to Western Blotting, LIT CMr 2009 1 © MorphoSys UK Ltd 2009
All rights reserved Published by MorphoSys UK Ltd Endeavour House, Langford Business
Park, Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GE, UK
Bolt M and Mahoney P High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, Anal Biochem. (1997) 247, 185-
192
Burnette W N - “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium
dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection
with antibody and radioiodinated protein, Anal Biochem (1981) 112, 195-203
Hames B D and Rickwood D - Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach 3
Rd Edition, The Practical Approach Series, Oxford University Press, 1998.
Towbin H et al - Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to
nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc Natl Acad Sci U S A (1979) 76,
4350-4354
Towbin H and Gordon J - Immunoblotting and dot immunobinding--current status
and outlook, J Immunol Methods (1984) 72, 313-340