Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară

Facultatea de Biotehnologii

Ribonucleaze
-proiect-

Coordonator ştiinţific: Student:

Asist. Univ. Dr. Simion Vasilica Rusu Ionut-Cristian

Bucuresti 2017
Cuprins:
Introducere

Enzimele sunt substanţe chimice complexe de natură organică, proteine colidal-

solubile elaborate de plante, animale şi microorganisme, capabile să mărească
viteza reacţiilor chimice ce se desfăşoară în sistemele biologice, fără să se
consume în cursul lor. Ele reprezinta o clasă specială de proteine dotate cu
activitate catalitică si pentru ca actionează in sistemele vii se mai numesc şi
biocatalizatori .

Enzimologia, domeniu al biochimiei care se ocupă cu studiul enzimelor, s-a

dezvoltat exploziv pe baza unor cercetări ample privind structura enzimelor,
mecanismele de reacţie studiate la nivel electronic şi cuantic, reglarea proceselor
enzimatice în cadrul metabolismului intermediar. Ca urmare, enzimologia
constituie studiul bazelor moleculare ale vieţii.

Enzima a existat din cele mai vechi timpuri , dezvoltându-se pe baze empirice, pe
experienţa câştigată de generaţii. Sinteza chimică a unor enzime reprezintă una
din marile performanţe ale enzimologiei moderne – ce deschide calea unor
importante posibilităţi de aplicabilitate teoretică şi practică. S-au obţinut
preparate enzimatice înalt purificate (proteaza, pectinaze, amilaze, ribonucleaze,
celulaze etc.) în stare liberă sau imobilizate pe suporturi solide, care deschid
perspectiva obţinerii unor complexe multienzimatice, utilizate ca medicamente,
ca senzori enzimatici pentru poluare, în microbiologie, în industria alimentară, în
industria medico-farmaceutică, în menaj.

Identificarea unui număr tot mai mare de enzime a impus necesitatea unei
nomenclaturi şi clasificări a acestora, dar pentru că la majoritatea nu li se
cunoaştea precis structura, nu s-a făcut o clasificare pe baza structurii chimice. În
1961, Union of Biochemistry Commission of Enzymes (Comisia de Enzimologie a
Uniunii Internaţionale de Biochimie) a stabilit un sistem de nomenclatură şi
clasificare pentru enzime, denumirea acestor substanţe fiind compusă din trei
părţi: numele substratului; tipul de reacţie şi natura acceptorului. Pentru
hidrolaze s-a folosit denumirea substratului, la care s-a adăugat sufixul –ază.
Pentru alte enzime, cărora nu li se cunoştrea mecanismul de reacţie, s-au folosit
denumiri mai vechi (pepsină, papaină, tripsină). În funcţie de unele detalii privind
grupările chimice supuse transformării şi natura cofactorilor implicaţi în reacţia pe
care o catalizează, enzimele au fost clasificate în clase, subclase şi sub-subclase.

Aproape toate reacţiile enzimatice sunt reacţii de transfer al unor grupe de atomi
de la un donor la un acceptor. Astfel hidrolizele sunt reacţii de transfer al unor
grupe acil, glicozil etc. cedate de substrat, către apă ca acceptor iar reacţiile de
oxido-reducere sunt reacţii de transfer de hidrogen sau electroni; termenul de
transferare se foloseste însă, în nomenclatura curentă mai ales pentru
transaminări, transmetilări, transacetilări.

După clasificarea adoptată de Union of Biochemistry Commission of Enzymes

(1961) enzimele au fost împărţite în şase clase:

1.Oxido-reductaze

2.Tranferaze

3.Hidrololaze

4.Liaze

5.Izomeraze

6.Ligaze (sintetaze).
Capitolul I: Ribonucleaze

Aspecte generale:
 Capitolul II :
Metode de determinare a activitatii enzimatice.

1. Metoda lui Kalnitsky și colab. (1959)

Rata de hidroliză a ARN de drojdie la pH 5,0 este determinată prin măsurarea
cantității de oligonucleotidă solubilă acidă eliberată în condiții definite. O unitate
determină o creștere a absorbției de 1,0 la A260 la 37 ° C și la pH 5,0 în condițiile
specificate.

Reactivi
0,10 M tampon de acetat de sodiu, pH 5,0
25% acid clorhidric conținând 0,75% acetat de uranil

1% ARN de drojdie Worthington în acetat de sodiu 0,10 M, pH 5,0. Se echilibrează

la 37 ° C înainte de analiză.

Enzimă
Se prepară soluție stoc la 1 mg / ml în apă de calitate a reactivului. Imediat înainte
de analiză, se diluează în continuare până la 2, 4 și 6 micrograme pe mililitru în
acetat de sodiu 0,10 M, pH 5,0.

Procedură
Se pipetează câte un ml de diluție enzimatică respectivă în tuburi de centrifugare.
Includeți un semifabricat conținând un ml de tampon de acetat de sodiu 0,10 M,
pH 5,0. Incubați toate eprubetele la 37 ° C timp de 5-8 minute. La intervale de
timp, adăugați un ml de 1% ARN. Incubați fiecare tub timp de 4 minute și opriți
reacția prin adăugarea a un ml de soluție de acid uranil-acid percloric. Se transferă
într-o baie de gheață și se răcește timp de 5 minute. Se clarifică prin centrifugare
și se diluează 0,1 ml de supernatant limpede la 3,0 ml cu apă cu grad de reacție.
Calcul:
 2.1 Analiza spectrofotometrică a ribonucleazei pancreatice bovine prin
utilizarea cisteinei 2 ': 3'-fosfat

Materiale neccesare:
Cistidină 2 ': 3'-fosfat. Se utilizează sarea de potasiu monohidrat.
3'-fosfat de ctidină. Acesta a fost preparata conform metodei lui Harris, Orr, Roe
& Thomas (1953).
2-Amino-2-hidroximetilpropan-1: 3-diol (tris). Acest compus (L. Light și Co. Ltd.) a
fost dizolvat în metanol-apă (20: 3, v / v) fierbinte, soluția a fost filtrată și trisul a
fost lăsat să cristalizeze. Produsul a fost colectat prin filtrare, spălat cu puțin
metanol și recristalizat. Greutate echivalentă (prin titrare cu HCI): găsit, 120 * 7,
calculat, 121 * 1. Tampon Tris. Acesta a fost preparat prin dizolvarea a 3 x 0285 g.
De tris și 1 x 5725 g. De NaCI în apă, adăugând 23 * 0,55 moli de HCI și diluând
până la 250 ml. cu apă. PH (electrod de sticlă) la 25 °: 7'13. - log [H +] (calculat din
datele termodinamice ale lui Bates & Pinching, 1949): 7-00; I, 0-2; Tris total, 01M
Apă. Apa distilată a fost trecută succesiv prin coloane care au fost aburite
anterior, conținând De-Acidite FF, Zeo-Karb 225 și, în final, Bio-Deminrolit (The
Permutit Co. Ltd., Londra). Au fost luate măsuri de precauție pentru protejarea
efluentului final de contaminarea cu CO2 atmosferic. Puritatea a fost verificată
ocazional prin măsurători de conductivitate. Acid clorhidric. HCI cu punct de
fierbere constantă a fost preparată în conformitate cu Vogel (1951, metoda B); a
fost diluat la concentrația necesară.

Mod de lucru

Spectrul de citopirină 2 ': 3'-fosfat și 3'-fosfat de citină. Spectrul de 2 ': 3'-fosfat

(0,25 mg dizolvat în 2-5 ml tampon tris) a fost măsurat față de un semifabricat de
tampon tris (2,5 ml). S-a adăugat o soluție de enzime (0,01 ml, 8 mg / ml de
tampon tris) la ambele celule; După 2 ore, când reacția a fost terminată, spectrul
a fost din nou citit și presupus a fi cel al 3'-fosfatului de citină. Hârtia
cromatografică descrisă în documentul precedent a confirmat absența oricărui
fosfat ciclic nehidrolizat. Spectrele sunt prezentate în Fig. 1. Spectrul de diferență,
prezentat în fig. 2, a fost calculată, modificarea volumului mic cauzată de
adăugarea soluției de enzimă fiind neglijată. Maximele de absorbție pentru 2 ': 3'-
fosfatul și 3'-fosfatul de citîdină sunt, respectiv, la 268 și 271 mXt; Există un punct
isosbestic la 265 m, u. Diferența maximă a coeficienților de extincție este de 286
m, u, unde raportul dintre extincții este 1-495.