Cultura microbiana pură şi izolarea ei

Cultura pură reprezintă o biomasă de celule rezultate prin reproducere dintr-o singură celulă aflată într-un
mediu nutritiv steril, cu volum limitat. Cultura pură este considerată şi colonia care se formează ca rezultat al
izolării unei celule sau a unei unităţi formatoare de colonii, atunci când aceasta este localizată pe un mediu
nutritiv solid. Puritatea unei culturi se poate obţine şi prin repicare, deci prin transfer de celule din eprubeta ce
conţine cultura pură, în alt vas cu mediu de cultură steril.

Metodele cunoscute şi practicate în laborator în scopul izolării culturilor pure pot fi clasificate în metode
fizico-mecanice şi metode biologice.

Metode fizice de izolare şi obţinere a culturilor pure

Metode prin răspândire – se folosesc pe scară largă, fiind uşor de executat, având ca principiu răspândirea
celulelor din medii naturale unde acestea se află în număr mare, prin diluare în medii lichide sau prin
diseminare mecanică pe suprafaţa mediilor sterile.

Metode scarificate. În placa Petri se repartizează un mediu de cultură adecvat, de exemplu MMA/BCA şi
după solidificarea mediului, cu firul metalic se recoltează celule din mediul natural şi se execută trasări pe
suprafaţa mediului, astfel încât diversele celule rămân distanţate între ele. Prin termostatare 48-72 ore, din
colonia care corespunde microorganismului ce trebuie izolat, se face repicare într-o eprubetă cu mediu solid
înclinat şi astfel se obţine o cultură pură.

Metoda în strii este similară, în schimb drept suprafaţă de răspândire se foloseşte mediul înclinat din 2-3
eprubete, prin transferul de celule din mediul natural, prin realizarea de striuri, în mod succesiv. Aceste metode
se folosesc şi în cazul în care o cultură pură este contaminată cu microorganisme străine în perioada de
păstrare a culturii şi aceasta trebuie să fie salvată.

Metoda culturală Koch este folosită în special pentru izolarea de drojdii. Ca mediu de răspândire se foloseşte
MMA repartizat în 3 eprubete, fluidificat şi menţinut la 40°C. Din mediul natural, de exemplu un must în
fermentaţie, se recoltează o ansă care se introduce succesiv în cele 3 eprubete, cu agitare, care să asigure
desprinderea celulelor. După inoculare şi uniformizare, conţinutul fiecărei eprubete se repartizează în câte o
placă Petri prin solidificare celulele rămân fixate în gel şi prin multiplicare vor forma colonii izolate. În funcţie de
densitatea celulelor recoltate iniţial în placa a 2-a sau a 3-a coloniile sunt suficient de distanţate (se preferă o
distanţă de circa 2 cm), pentru a putea face izolarea din colonia adecvată a culturii pure, prin repicare în
eprubetă cu MMA.

Metode prin diluare. În prima etapă, din mediul natural se execută diluţii decimale în ser fiziologic steril, astfel
încât numărul de celule într-o micropicătură din ultima diluţie să fie redus.

Metoda Lindner se foloseşte pentru izolarea de drojdii fermentative. Din diluţia convenabilă, cu ajutorul unei
peniţe topografice se plasează aprox. 9 picături pe suprafaţa unei lamele sterile. Lamela se amplasează cu
picăturile în jos pe o lamă cu excavaţie şi se studiază la microscop fiecare picătură. Se notează cu un marker
conturul picăturii în care se află o singură celulă. Se desprinde lamela şi cu ajutorul unei benzi sterile de hârtie
se absoarbe picătura notată. Odată cu lichidul se adsoarbe şi celula de izolat, apoi banda se introduce într-o
eprubetă cu mult lichid. Celula va da prin reproducere o cultură pură. Deşi este meticuloasă, metoda propusă
de Lindner este o metodă precisă, deoarece se face sub control microscopic.

Metoda Naumov este folosită pentru izolarea culturilor pure de mucegaiuri. Dintr-o diluţie convenabilă se
aplică distanţat micropicături peste care se adaugă picături de mediu MMA fluidificat (42°C) şi după 3-8 zile se
selectează din picătura cu o singură colonie cultura pură dorită.

O metodă simplificată pentru separarea sporilor fungici constă în inundarea unei plăci cu MMA cu 1-2 cm3 din
diluţia convenabilă. Sporii care au rămas ataşaţi de mediu vor da colonii izolate. În general mucegaiurile nu
ridică probleme la izolare deoarece cresc sub formă de colonii mari pe diverse alimente şi pentru obţinerea în
cultură pură se face repicarea de spori situaţi în centrul coloniei.

Metode de izolare cu ajutorul micromanipulatorului. Este o metodă precisă şi se realizează cu ajutorul unui
aparat prevăzut cu tuburi capilare cu care se poate face selecţia celulelor dorite din preparate studiate la
microscop. Cu ajutorul micromanipulatorului se poate face recoltarea de ascospori din celule ascogene şi este
folosit în dirijarea proceselor de fuziunea protoplaştilor, pentru conjugare etc.
 Metode biologice de obţinere a culturilor pure
Metodele biologice sunt foarte diverse şi se bazează pe proprietăţi fiziologice ale microorganismelor de izolat
care să se diferenţieze clar de cele ale microorganismelor însoţitoare din acelaşi biotop. Uneori prin aceste
metode se face izolarea unui grup cu caractere taxonomice apropiate şi apoi se face izolarea de culturi pure
prin tehnici de răspândire sau prin folosirea mediilor selective.

O metodă biologică clasică este metoda Burri prin care se face separarea microorganismelor în funcţie de
necesarul de oxigen pentru creştere. Dintr-un mediu natural se face inocularea în BCA termostatat la 42°C şi
după uniformizare acesta se introduce într-un tub de sticlă prevăzut la un capăt cu dop de cauciuc. Prin răcire
celulele sunt imobilizate în gel şi prin termostatare în funcţie de accesul oxigenului din aer, în zona tubului
prevăzut cu dop de cauciuc se vor dezvolta bacterii anaerobe, intermediar bacterii microaerofile, iar în stratul
de mediu la care aerul a pătruns prin dopul de vată al tubului, bacterii aerobe.

Prin metode biologice pot fi selectate bacteriile sporogene din medii naturale pe baza termorezistenţei
deosebite a endosporilor. De exemplu, Bacillus subtilis se poate izola din infuzie de fân, deoarece endosporii
rezistă la fierbere, în timp ce alte bacterii sunt distruse şi prin germinare trec în forme vegetative şi care prin
înmulţire prin sciziune rămân asociate formând în 24 ore un voal cutat.

Numeroase metode de izolare se bazează pe introducerea în medii de cultură a unor substanţe chimice cu
efect inhibitor asupra microorganismelor de care trebuie separată cultura dorită. De exemplu, prin introducerea
de 0,02% actidionă are loc inhibarea dezvoltării drojdiilor aflate în amestec cu bacterii. Metoda este folosită
pentru izolarea unor bacterii ce pot produce contaminarea drojdiilor folosite sub formă de culturi pure în
industriile fermentative.

Importanţa practică a culturilor pure

Izolarea şi obţinerea culturilor pure , cunoaşterea cineticii de creştere prezintă o importanţă practică
deosebită în următoarele domenii:

Identificarea, selecţionarea şi îmbunătăţirea proprietăţilor de biosinteză

Culturile pure sunt folosite pentru studiul proprietăţilor morfologie şi fiziologice, în scopul identificării,
caracterizării şi stabilirii domeniului de utilizare a culturii. Sub formă de culturi pure microorganismele pot fi
supuse unor tratamente fizico-chimice prin care se pot induce modificări genetice la nivelul acizilor nucleici, cu
obţinerea de culturi mutante, din rândul cărora se face din nou selecţia tulpinilor performante.

Obţinerea culturilor starter în procese fermentative industriale

Pornind de la cultura pură, în biotehnologii alimentare prin cultivarea în medii adecvate se obţine cantitatea
necesară de inocul/maia folosită drept cultură starter a procesului fermentativ.

Inoculul reprezintă un mediu nutritiv steril în care s-au înmulţit celule aparţinând unei culturi pure, aflată în
etapa finală a creşterii exponenţiale. Cantitatea de inocul trebuie astfel calculată încât prin introducerea sa în
mediul fermentativ steril, concentraţia în celule să asigure declanşarea rapidă a procesului. În funcţie de
specificul biotehnologic este obligatorie asigurarea continuităţii în transfer pentru aprovizionarea cu inocul activ,
la perioada solicitată de producţie.

Utilizarea culturilor pure în biotehnologii alimentare (la fabricarea berii, alcoolului, vinului, produse lactate
acide, panificaţie etc.) permite obţinerea unor produse cu calitate constantă.