METODE DE EXTRACTIE SI

SEPARARE A CAROTENOIDELOR
DIN PLANTE

Consideratii generale
Dezvoltarea impetuoasa a tehnicilor de izolare si identificare a
compusilor naturali a avut ca rezultat o imbogatire rapida a numarului
pigmentilor carotenoidici. Pentru izolarea din amestecurile de produsi
naturali, se tine cont de proprietatile lor fizice si chimice.
Pigmentii carotenoidici sunt sensibili la lumina, caldura, oxigen,
acizi si baze alcaline. Din acest motiv, trebuie respectate anumite
conditii, pentru pastrarea materialului supus analizei. Prin expunerea
la lumina, in mod deosebit la lumina solara directa sau la lumina UV,
se realizeaza fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la
fotodistrugerea lor. De aceea, materialele biologice ce contin
carotenoide sau solutiile lor trebuie ferite de actiunea luminii.
Multe carotenoide sunt termolabile, in special xantofilele, incalzirea lor
realizandu-se doar in situatia cand este absolut necesar acest lucru.
Separarea carotenoidelor trebuie realizata la temperatura camerei, pana la
200C si la intuneric. In cazul saponificarii la cald, solutiile trebuie protejate
prin utilizarea solventilor cu puncte de fierbere nu foarte ridicate (30- 600C).
In prezenta oxigenului (aer) sau a peroxizilor, multe carotenoide pot fi oxidate,
ele fiind foarte sensibile la oxigen in stare adsorbita (in cromatograme, pe
coloana si pe strat subtire). Este necesar sa se lucreze in stare inerta (in
atmosfera de azot sau vacuum). Oxidarea in timpul extractiei si saponificarii
poate fi minima prin utilizarea unei atmosfere de azot.
Prin expunerea carotenoidelor sau a materialelor biologice actiunii
acizilor, au loc o serie de transformari, cum sunt descompunerile
oxidative, izomerizarea cis-trans si izomerizarea 5,6-epoxizilor la 5,8-
epoxizi. Inlaturarea acestor inconveniente se realizeaza prin
neutralizarea cu CaCO3, piridina sau dimetilalanina. De asemenea, se
lucreaza cu solventi purificati si proaspat distilati, indeosebi derivatii
clorurati, cum este diclormetanul, care contine in mod frecvent HCl.
Depozitarea pigmentilor carotenoidici se realizeaza la intuneric,
sub atmosfera de azot sau in vacuum, la o temperatura de .200C. Cel
mai bine se pastreaza in stare cristalina. Pastrarea sub forma de
solutie se realizeaza in eter de petrol, hexan sau benzen.
Determinarea unor constante fizice ca temperatura de topire,
temperatura de fierbere, densitatea, indicele de refractie, intensitatea
1
absorbtiei la anumite lungimi de unda etc., ofera date distincte care permit
individualizarea unui compus organic, caracterizarea lui. Totusi, in
cercetarile actuale se utilizeaza metodele spectrale, care ofera informatii
mai precise privind structura si proprietatile substantelor organice.
Metodele spectrale au avantajul, fata de metodele chimice de identificare,
ca furnizeaza date in timp mult mai scurt si sunt mai precise, necesita
cantitati mici de substanta si ofera posibilitatea analizarii continue, in
diferite etape ale prelucrarii compusului extras, fara modificarea
compozitiei substantei cercetate, ceea ce permite recuperarea sa.
In lucrarea de fata sunt prezentate principalele metode de
extractie, separare si identificare a compusilor organici, cu aplicatii
directe la pigmenti carotenoidici.

Metode de extractie
Generalitati privind metodele generale de extractie
Distributia intr- o mare varietate de materiale si lichide biologice a
compusilor biologic activi a facut sa nu se poata adopta o metoda general-
valabila de extractie care sa poata fi aplicabila in mod universal si adoptata
ca o tehnica standardizata. Acest lucru se datoreaza structurii diferite a
compusilor biologic activi, chiar si cei din aceeasi clasa deosebindu-se
intre ei prin lungimea catenei, prin grupari functionale specifice sau
configuratie, solubilizarii diferite in solventi etc. Metoda de extractie se
alege in de natura materialului d usurin extractiei
functie vegetal, e ta cu
solvent cantitat s proprietatile compusilor supusi
i, de ea i extractiei
(solubilitate, termolabilitate) etc.
[1]
Dupa natura substantei de extras, lichida sau solida, se aplica
extractia
solid-lichid, in marea cazurilo s extract lichid-
majoritate a r, i ia lichid,
s
adi extract un lichi a a principiilor active aflate intr-un
ca ia ui d u lichid
(rezultatul primei faze de extractie), cu ajutorul altui lichid
nemiscibil.
Produsul vegetal proaspat sau uscat se pulverizeaza sau se
zdrobeste
foarte fin pana la gradul de maruntire convenabil realizarii extractiei.
Aleger solventul es determina principiilo activ
ea ui te ta de natura r e,
proprietatile fizico-chimice ale selectivitatea solventului.
solventului, In
s
gener substante termolabile extrase la prin a
al, le sunt rece percolare u
agitar Pent extract l ca s folosesc mul meto i
e. ru ia a ld e mai te de n
functi d regim de s anu extract la reflux,
e e ul extractie, i me ia extractia
continua solid-lichid sau lichid-lichid. Cele mai bune rezultate se obtin
prin aplicarea extractiei in contracurent. O metoda eficace de extractie o
constituie ultrasonicarea materialului supus extractiei cu solventi.

2
 Metode de extractie a carotenoidelor
Extractia carotenoidelor din produsul vegetal se realizeaza cu
solventi organici nepolari, de regula eter etilic sau cloroform, prin
macerare, agitare mecanica sau prin refluxare pe baia de apa in fierbere.
Se impune un grad de maruntire avansat, deoarece solventul nepolar nu
patrunde prin membrana celulara pentru a dizolva carotenoidele.
Materialul vegetal supus extractiei poate fi in stare proaspata
sau uscata.
Daca materialul supus extractiei se afla in stare proaspata,
acest lucru implica si existenta apei in tesuturi, pentru indepartarea ei
fiind necesara uscarea prealabila a materialului vegetal prin extractia
cu solventi miscibili cu apa (acetona, metanol, etanol), materialul
trebuind sa fie suficient de deshidratat pentru a se preta extractiilor
ulterioare cu solventi neaposi. In cazul materialului uscat, extractia se
realizeaza cu solventi nemiscibilicu apa.
Solutia extractiva organica contine derivati carotenoidici nativi,
alaturi de numeroase substante balast, cum ar fi clorofila.

Extractia din tesuturile plantelor superioare

Schema generala de extractie a carotenoidelor din produse
vegetale este cea prezentata mai jos.[2] Pentru tesuturile plantelor
superioare se cunosc o multitudine de metode de extractie, in
continuare fiind prezentate doua, ce constituie variante simplificate
ale metodei generale de extractie. [1]

Metoda I
Materialul vegetal este maruntit foarte fin (din considerentele aratate
mai sus) si omogenizat cu acetona, timp de 1-2 minute, in atmosfera de
azot. Omogenatul este filtrat, iar reziduul este supus extractiei ulterioare cu
acetona, pana cand omogenatul devine incolor. Extractele acetonice se
reunesc si se concentreaza la volum mic prin evaporare la rotavapor.
Peste extractul acetonic se adauga un volum egal de eter etilic proaspat
distilat, omogenizand amestecul si spalandu-l apoi cu o solutie de NaCl
(pentru ca eterul etilic sa se indeparteze usor si pentru a se evita
emulsionarea amestecului), pana la indepartarea completa a acetonei.
Aceasta metoda este foarte utilizata in cazul in care se
realizeaza extractii ale tesuturilor verzi ale plantelor, flori si fructe.

3
 EXTRACTIA CAROTENOIDELOR DIN PRODUSE VEGETALE

PRODUS VEGETAL PULVERIZAT

-epuizare cu
eter(cloroform);macerare,agitare,percolare,refluxare

FAZA ORGANICA REZIDUU VEGETAL

-distilare volum redus;agitare
Na2CO3

FAZA ORGANICA
FAZA APOASA ALCALINA -saponificare KOH 10% in alcool(1-2 ore in baia de
(sapunuri ale acizilor grasi apa
liberi)

in fierbere);racire;epuizare cu eter

FAZA ALCALINA
FAZA ORGANICA (lipide
-anhidrizare cu Na2SO4 saponificate)
sicc.,filtrare,
distilare vid volum mic

Hidrocarburi FAZA
alifatice FAZA ORGANICA ORGANICA REZIDUU TOTAL

precipitat alb- o -evaporare CAROTENOIDIC

sidefos
-racire 5-10 C;filtrare reluari repetate cu
eter

SOLUTIE EXTRACTIVA ETERICA

REZIDUU
filtrare;evaporare reluari cu CH3OH
92%;

filtrare;evaporare
 TOTAL CAROTENOIDIC I TOTAL CAROTENOIDIC II
HIDROCARBURI CAROTENOIDICE XANTOFILE DIHIDROXILATE
ALTE CAROTENOIDE SUPERIOR
XANTOFILE MONOHIDROXILATE OXIDATE
Metoda II
Aceasta metoda este utila in cazul in care se
lucreaza cu cantitati mici de substanta. Tesutul este
maruntit si triturat cu Na2SO4 anhidru, pana se obtine o
pudra foarte fina, care este apoi supusa extractiei cu
acetona, urmata de eter etilic. Extractul se
centrifugheaza, precipitatul obtinut extragandu-se in
continuare pana la incolor, solutiile supernatante
reunindu-se si concentrandu-se, transferandu-se apoi
intr-un volum egal de eter etilic, ca si in cazul metodei I.
Pentru ambele metode este necesara saponificarea,
care permite
indepartarea substantelor balast, mai ales clorofile s hidroliz
a i, i a
esterilor xantofilei. Saponificarea se prin de
realizeaza adaugarea KOH

4
15% peste (1:10 v/v Aceas saponifica se poate realiza
extract , ). ta re in
doua moduri:
1- incalzirea amestecului alcalin timp de 10-15 minute pe baie
de apa, in atmosfera de azot,
la intuneric;
2- pastrarea la temperatura camerei sau la 50C, la intuneric,
timp de 10-15 ore.
Este de preferat utilizarea metodei de saponificare prin racire,
datorita faptului ca unii pigmenti carotenoidici (cum sunt xantofilele)
sunt labile termic, existand posibilitatea degradarii.

Extractia din alge

In cazul extractiei carotenoidelor din alge nu se mai aplica metoda
generala prezentata mai sus, datorita faptului ca, pentru o extractie eficienta,
este necesara o disruptie mecanica sau un pretratament. De asemenea,
extractia carotenoidelor din alge se realizeaza cu solventi mai polari decat
acetona (etanol sau amestec acetona:etanol), datorita faptului ca au polaritate
mare si permit efectuarea saponificarii pe extractul initial. [3]
Pretratamentul poate consta in suspendarea algelor in apa distilata
si racirea timp de 5-8 ore inaintea extractiei propriu-zise, apoi extractia cu
metanol. Un alt pretratament consta in decolorarea preliminara cu vapori
de apa sau tratarea cu apa fierbinte, timp de 2-3 minute, apoi racirea
rapida cu gheata. Acest ultim procedeu inlesneste extractia carotenoidelor,
dar are si un inconvenient, si anume posibilitatea distrugerii enzimelor care
actioneaza asupra carotenoidelor si clorofilelor.
Pentru o izolare eficienta a carotenoidelor din alge, acestea pot
fi supuse uscarii, desi, prin acest procedeu, unii compusi pot suferi
modificari, si pot exista diminuari ale randamentelor de extractie.
Un procedeu care implica uscarea prealabila a algelor a fost
utilizat la extractia carotenoidelor din Fucus serratus, cand algele sunt
uscate timp de cateva zile, macinate, apoi pudra este amestecata cu
apa (800 ml apa la 500 g pudra), dupa care amestecul este eluat intr-o
coloana prin percolare cu amestec benzen:metanol (1:10, v/v). Eluatele
de culoare verde se indeparteaza, iar zona bruta se elueaza cu mult
solvent, se concentreaza si se cromatografiaza pe coloana de CaCO3.

Cromatografia
Cromatografia este o metoda fizica de separare bazata pe distributia
componentelor dintr-un amestec intre doua faze: una fixa, denumita faza
stationara, si alta mobila, ce strabate faza stationara. Faza stationara
5
poate fi un adsorbant solid (cromatografie de adsorbtie), un lichid
depus pe suprafata unui suport solid (cromatografie de repartitie), un
schimbator de ioni (cromografie prin schimb ionic) sau un gel
(cromatografie prin excluziune sterica).[5]
Cromatografia se aplica in scopul izolarii unor componenti prin
separarea acestora la elutia coloanei (in cromatografia pe coloana),
prin razuirea spoturilor de pe cromatoplaci (cromatografia in strat
subtire) sau prin taierea spoturilor de pe hartie (cromatografia pe
hartie).[6] Termenul de cromatografie, care inseamna .scriere in
culori. (chrom=culoare in limba greaca) a fost dat de Tvet (1906), cu
ocazia separarii colorantilor din frunze verzi (clorofile, carotenoide),
prin adsorbtie lichid-solid.
Principiul metodei Tvet consta in stabilirea unui echilibru intr-un proces
cinetic de adsorbtie-desorbtie intre faza solida fixa si faza lichida mobila. Faza
stationara este alcatuita din material adsorbant, granular, plasat intr-o
coloana, iar faza mobila este o solutie a amestecului de separat intr- un
solvent potrivit. Solutia se deplaseaza in coloana prin cadere libera sau cu
ajutorul unei diferente de presiune. Pentru distantarea zonelor in care s-au
adsor diversi componenti ai amestecului se adauga un solvent
bit la
parte superioa a coloanei. Componentii migreaza cu viteze
a ra diferite,
datorita faptului ca sunt retinuti in mod diferit de catre faza stationara.
Procesul este denumit developarea cromatogramei.
Separarea completa a componentilor din coloana, numita elutia
cromatogram s realizea pri adaugar de diferi
ei, e za n ea solventi ti si
culegerea respecti in diferit Componen ie di
solutiilor ve vase e. tii s n
coloana in ordinea inversa adsorbabilitatii lor in faza
stationara.
Dintre metodele cromatografice, cromatografia in faza gazoasa
si
p
cromatografia gaz-lichid foart raspandit datorita faptului o
sunt e e, ca t
fi aplicate amest de componenti lichizi cu temperaturi joase
oricarui ec de
fierbere.
Pentru compusii c volatilita redusa, utilizea
organici u te se za
cromatografia in strat subtire si cromatografia pe hartie.
In cromatografia pe hartie, faza stationara este constituita
 dintr-o
foaie de hartie de filtru, pe care aplica la extremita picatur
se o te o a
di amestec d analiza Harti se introduce apoi extremitat
n ul e t. a cu ea
continand picatura intr-un eluent situat intr- un vas acoperit. Eluentul
urca prin capilaritate si antreneaza componentele in ordinea
crescanda a valorii Rf, ce reprezinta raportul dintre viteza de migrare
a componentului si viteza de migrare a eluentului:
6
 v c
Rf = v e

Practic se masoara distanta de migrare a solventului si distanta

de migrare a componentului.
Recunoasterea componentilor incolori se realizeaza cu ajutorul
unui reactiv specific cu care dau compusi colorati.
Cand se doreste separarea neta a componentilor unui amestec, se
realizeaza o cromatografie bidimensionala cand, dupa o prima developare,
hartia se usuca, se roteste cu 900 si se asaza intr-un nou eluent.
In cromatografia in strat subtire, faza stationara este un strat
adsorbant (de silicagel sau alumina) cu o grosime de fractiune de
milimentru, depus pe o placa de sticla.
Principiul separarii este acelasi ca la cromatografia pe hartie,
insa prezinta avantajul unei separari mai rapide si mai precise.

Metode de separare a carotenoidelor

Separarea carotenoidelor dintr-un amestec este dependenta de
natura lor, si anume de polaritatea moleculei si de gruparile functionale
din molecula, ce determina caracterul lor hidrofil. Datorita acestor
proprietati exista doua metode de separare a carotenoidelor, si anume:
1- repartitia intre doua faze lichide nemiscibile intre ele;
2- separare prin adsorbtie pe adsorbant.
Schema generala de separare implica urmatoarele etape:
- faza organica, obtinuta dupa saponificarea extractului, este
anhidrizata cu Na2SO4 sicc., se supune repartitiei intre eter de petrol-
metanol 92% pentru a separa hidrocarburile carotenoidice si xantofilele
monohidroxilate care trec in epifaza(eter), iar xantofilele dihidroxilate si
alte carotenoide superior oxidate trec in hipofaza (alcool);
- fiecare faza se supune cromatografierii pe coloana de oxid de
aluminiu (Al2O3 standardizat .Brockmann II-III) sau alt adsorbant,
utilizand ca eluanti eter, alcool etilic:eter (1:9, v/v), alcool etilic
absolut, acetona. Se retin fractiuni de 50-100 ml, carora li se
determina puritatea prin cromatografie in strat subtire, folosind drept
faza stationara silicagel, iar drept faza mobila un sistem de solventi.

7
 Separarea prin repartitia lichid-lichid
Dupa cum s-a aratat mai sus, un sistem de repartitie il constituie
eterul de petrol si metanolul. Prin aceasta metoda se pot separa
carotenoidele hidrocarburice de xantofile. Separarea este utilizata ca o
faza preliminara cromatografiei pe coloana sau in strat subtire.
Separarea prin repartitie intre doua lichide poate fi o alternativa a
saponificarii in vederea indepartarii clorofilei din extractele ce nu se pot
saponifica prin adaugare de baze, datorita existentei carotenoidelor
sensibile la aceste substante. Acest procedeu implica trecerea
xantofilelor in hipofaza metanolica, clorofilele trecand in epifaza. O alta
varianta este extractia unei solutii metanolice a unui pigment cu eter de
petrol, pana cand clorofilele sunt indepartate. In ambele cazuri,
xantofilele din hipofaza sunt trecute in eter etilic si apoi spalate cu apa.
Acest procedeu este din ce in ce mai putin utilizat datorita sensibilitatii
metodelor cromatografice, prin repartitie randamentul de separare fiind destul
de redus, carotenoidele, din cauza solubilitatii diferite, putandu-se gasi in
ambele fractiuni de repartitie. In cazul unei carotenoide ce poseda solubilitate
doar in unul din cei doi solventi (glicozid sau acid), acest procedeu se poate
aplica, preferandu-se, totusi, metodele cromatografice.

Separarea prin metoda distributiei contracurent

Acest procedeu consta in repartitie repetata intre cei doi solventi
descrisi mai sus, ajungandu-se la metoda denumita“distributia
contracurent”.[7] Dupa un numar suficient de mare de repartitii,
amestecul original este separat in fractiuni, avand fiecare o anumita
solubilitate: hidrocarburi carotenoidice, xantofile mono si dihidroxilate,
etc. Acest procedeu este urmat de o fractionare prin cromatografie pe
coloana, prin adsorbtie diferita datorata gruparilor specifice fiecarei
grupe de carotenoide. Acest procedeu este util in cazul separarii
xantofilelor foarte polare, care sunt puternic adsorbite.

Separea prin metode cromatografice

Pentru separarea carotenoidelor sunt foarte utilizate metodele
cromatografice, atat cea in strat subtire, cat si cea pe coloana.

Cromatografia in strat subtire

Cromatografia in strat subtire este o tehnica foarte utilizata in
separarea si purificarea carotenoidelor. Tehnica de baza a acestei metode
a fost descrisa de diferiti autori.[8] Gradul de purificare prin aceasta
metoda este mult mai mare, comparativ cu cromatografia pe coloana.
8
 In functie de natura carotenoidului se vor alege faza stationara,
precum si faza mobila si sistemul de eluare din placi.
In cromatografia in strat subtire a carotenoidelor trebuie luate
anumite precautii, si anume:
1- aplicarea rapida a probei;
2- aplicarea probei la lumina slaba;
3- developarea imediata a cromatogramei;
4- developarea la intuneric a cromatogramei;
5- utilizarea unei atmosfere de azot.
Materialele biologice ce contin carotenoide sau solutiile lor trebuie
ferite de actiunea luminii deoarece prin expunerea carotenoidelor la
lumina, in mod deosebit la lumina solara directa sau la lumina UV, se
realizeaza fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la
fotodistrugerea lor. Multe carotenoide sunt termolabile, in special
xantofilele, incalzirea lor realizandu-se doar in situatia cand este absolut
necesar acest lucru. Separarea carotenoidelor trebuie realizata la
temperatura camerei, pana la 200C si la intuneric. In cazul saponificarii la
cald, solutiile trebuie protejate prin utilizarea solventilor cu puncte de
fierbere nu foarte ridicate (30-600C). In prezenta oxigenului (aer) sau a
peroxizilor, multe carotenoide pot fi oxidate, ele fiind foarte sensibile la
oxigen in stare adsorbita (in cromatograme, pe coloana si pe strat subtire).

Alegerea fazei stationare

Pot fi utilizati drept faza stationara foarte multi adsorbanti, dupa
cum rezulta din tabelul 1.
Sistemele cele mai utilizate in cromatografia in strat subtire
cuprind separarea carotenoidelor pe strat cu silicagel si developarea cu
eter de petrol (+5% eter etilic) sau pe MgO si developare cu benzen:eter
de petrol (9:1, v/v). Cromatoplacile ce au drept sistem stationar ZnCO3,
developate cu amestec hexan- alcool, dau rezolutii foarte bune pentru
xantofile, in timp ce CaCO3, MgO si Ca(OH)2 sunt utile atat in
separarea hidrocarburilor carotenoidice, cat si a xantofilelor.

Alegerea solventului
Solventii utilizati in separarea carotenoidelor prin cromatografie in
strat subtire sunt eluanti slabi, cum ar fi eter etilic, benzenul, precum si
amestec de solventi acetona-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat de etil-
benzen etc. Solventii care dau o inalta rezolutie, datorita proprietatilor
lor, sunt alcoolii tertiari. Cloroformul este in general omis datorita
urmelor de acid clorhidric pe care le contine si care pot conduce la
9
transformari ale carotenoidelor. Acidul acetic este utilizat doar in cazul
carotenoidelor puternic adsorbite pe adsorbant.
Adsorbanti utilizati pentru cromatografia in strat subtire a
carotenoidelor (tabelul 1):
Nr.cr Adsorba
t nt
1. Al2O3
2. Celuloza
3. CaCO3:MgO:Ca(OH)2
(30:6:5, m/m/m)
4. Ca(OH)2
5. Ca(OH)2:silicagel (1:1,
m/m)
6. Kieselguhr
7. Manitol
8. MgO
9. MgO:celita(1:2, m/m)
10. MgO:silicagel
(1:1, m/m)
11. Silicagel
12. Zaharoza
13. ZnCO3

Detectarea carotenoidelor
Datorita faptului ca acesti pigmenti sunt colorati, se poate realiza si
identificarea vizuala a lor (se poate detecta vizual pana la 0,05 g - caroten).
Carotenoidele, insa, se decoloreaza rapid pe placa cromatografica, din acest
motiv fiind necesara stropirea cromatoplacii cu o solutie de parafina in eter de
petrol [8]. Unele carotenoide carbonilice sau produsii de descompunere
oxidativa pot fi identificati cu o solutie de rodamina 1% in acetona [9] sau prin
stropirea cu o solutie de SbCl3 in cloroform. Cea mai sensibila metoda
ramane totusi identificarea cu vapori de iod, cand se formeaza spoturi de
culoare bruna, prin aceasta metoda identificandu-se si eventualele impuritati.
Compusii incolori pot fi detectati prin vizualizarea fluorescentei verde
caracteristica la absorbtie in ultraviolet.

Eluarea carotenoidelor din cromatoplaci

Eluarea se face in functie de stratul adsorbant si de polaritatea
carotenoidelor. La cromatografiere pe silicagel G eluarea se face cu eter
10
etilic sau eter etilic +5-10% etanol (carotenoide polare), iar la
cromatografiere pe MgO eluarea se face cu acetona (hidrocarburi
carotenoidice si xantofile). Eluarea se face dupa scoaterea zonei
colorate de pe suport, urmatã de filtrare.

Cromatografia pe coloana
Cea mai importanta metoda de separare a carotenoidelor,
cromatografia pe coloana, a fost inlocuita recent cu cromatografia in strat
subtire prin caracteristicile sale de adsorbtie. Aceasta metoda este utilizata
prin imbunatatirea ei odata cu descoperirea cromatografiei in faza lichida
de inalta performanta, metoda care prezinta avantajele utilizarii cantitatilor
mici de substanta si vitezei de separare mari, dar limitata la o anumita
scara, neputand fi utilizatã in scopuri preparative [10].
In functie de natura carotenoidului se vor alege adsorbantul si
solventul de developare adecvat.
Dintre adsorbantii utilizati in cromatografia pe coloana pentru
separarea carotenoidelor, pot fi amintiti celuloza, Ca(OH)2 (utilizat mai ales
la separarea hidrocarburilor carotenoidice), zaharoza, amidon, silicagel,
Al2O3 (folosit la separarea monohidroxicarotenoidelor), CaCO3 si MgO
(acestia fiind utilaizaþi la separarea carotenoidelor cu polaritate
intermediara, cum este cazul xantofilelor). Pe aceeasi coloana se pot
utiliza si adsorbanti diferiti asezati in functie de puterea de adsorbtie, cel
mai adsorbant fiind asezat in partea superioara a coloanei.[11]
Solventii utilizati in cromatografierea pe coloana a carotenoidelor
sunt eluanti slabi. De obicei se lucreaza cu amestec de solventi, cum ar fi
acetona-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat de etil-benzen etc. Coloana de
adsorbtie trebuie incarcata cu adsorbant in proportie de ¾, o parte
ramanand pentru solvent si extract. Adsorbantul trebuie sa fie foarte bine
compactat in coloana, din acest motiv umplerea coloanei realizandu-se cu
portiuni mici de adsorbant ce trebuie apoi tasat. Extractul carotenoidic
trebuie sa fie foarte concentrat pentru a se putea adauga in coloana o
singura data. Dupa ce amestecul de pigmenti a fost introdus in coloana, se
incepe developarea cu solventi diferiti, incepand cu cel mai nepolar.[12]
In cromatografia pe coloana se disting trei procedee de baza
pentru separarea carotenoidelor, si anume :
1) cromatografia in zone;
2) cromatografia elutiei in trepte
c)cromatografia elutiei in gradient.

11
 Cromatografia in zone
Amestecul de carotenoide care se afla intr-un solvent nepolar se aplica
pe la partea de sus a coloanei. Pentru separarea zonelor pe coloana este
utilizat un solvent adecvat pentru developare. Zonele sunt scoase din
coloana, fiecare zona fiind apoi eluata individual cu un solvent polar.

Cromatografia elutiei in trepte

In aceasta metoda se aplica principiul general al cromatografiei
pe coloana, si anume introducerea amestecului carotenoidic in partea
superioara a coloanei, apoi aplicarea solventilor, in functie de polaritate.
Pigmentii sunt eluati in ordinea cresterii afinitatii lor de adsorbtie si
colectati. Fiecare zona eluata este apoi evaporata la sec, redizolvata
intr-un volum mic de solvent, in vederea spectrofotometrarii.

Concluzii
In perioada actuala, cand pe plan national si international se pune
un
accent deosebit pe superioara a plantelor de cultura si
valorificarea a
celor din flora spontana, surselor naturale in general, in functie
a de
compozitia lor chimica, cunoasterea substantelor biologic active se
impune
ca o cerinta de prima marime. Numai prin cunoasterea compozitiei
chimice a plantelor, a mecanismelor biochimice ce stau la baza
fenomenelor biologice se vor putea obtine hibrizi noi de plante, cu
continut ridicat in substante biologic active, care maresc valoarea
biologica a plantelor in care se gasesc.
Pentru stabilirea formulei moleculare, a structurii moleculare si
a proprietatilor fizico-chimice a unui compus biologic activ, este
necesara mai intai izolarea lui din amestecul de compusi naturali.
Metodele de extractie a compusilor biologic activi se aleg in functie
de proprietatile compusilor supusi extractiei. Extractia carotenoidelor din
produsul vegetal se realizeaza cu solventi organici nepolari (eter etilic,
cloroform), prin macerare, agitare mecanica sau prin refluxare baia
pe de
a
p i fierber impunandu-se un grad de avans datorit
a n e, maruntire at, a
faptul ca solventul nepolar nu patrunde prin celula
ui membrana ra
pentru
a dizolva carotenoidele.
 Metodele de separare se aleg de asemenea in functie de
proprietatile
fizice si chimice ale substantelor ce urmeaza a fi separate. Dintre
metodele utilizate frecvent la separarea carotenoidelor, o importanta
deosebita o prezinta metodele cromatografice, atat pe coloana cat si
in strat subtire, precum si separarile prin repartitia lichid-lichid si prin
metoda distributiei contracurent.
12
 BIBLIOGRAFIE

[1] V.Tamas, G.Neamtu-“Pigmenti carotenoidici si metaboliti”, vol 1,

Ed. Ceres, Bucuresti (1986)

[2] I.Ciulei, V.Istudor, M.Palade-“Analiza farmacognostica si fitochimica

a produselor vegetale”, Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti (1997)

[3] B.Amotz, A.Katz, M.Avron- J.Phycol., 18:529-37 (1982)

[4] I.Pogany, M.Banciu-“Tehnica experimentala in chimia organica”,

Ed.Stiint.Encicl.Bucuresti (1977)

[5] M.Iovu - Chimie organica, Ed Didactica si Pedagogica, Bucuresti (1982)

[6] E. Lederer, M.Lederer-“Chromatography. A Review of Priciples

and Applications”, Elsevier, Amsterdam (1979)

[7] I.A.Curl, G.F.Bailey - J.Agr.Food Chem., 9, 403 (1977)

[8] E.Stahl-“Thin-Laye Chromatography”, Springer-Verlag, N.Y.

(1979) [9]J.Avigan, D.Steinberg - J. Lipid Res., 4, 100 (1963)

[10] AB Barua, JA Olson- J.Chromat.Biomed.Sci.Appl., 707:1-2, 69-

79 (1998)

[11]J.Dietz Bryant, J.D.McCord, L.Knight Unlu, J.W.Erdman-

J.Agric.Food Chem.,vol.40, No.4, 545-549 (1992)

[12] P.Hugueney, S.Romer, M.Kuntz, B.Camara- J.Biochem., 209, 399-407

(1992) Butterworth, Londra (1964)

13

P DF to Wor