BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

LUCRAREA PRACTICĂ NR.8

GRUPA BACILILOR GRAM POZITIVI ASPOROGENI ACIDOREZISTENȚI

FAMILIA MYCOBACTERIACEAE
GENUL MYCOBACTERIUM

Bacteriile din acest gen au o caracteristic fundamentală: sunt rezistente la acizi, baze (alkali) și
alcooli. Această particularitate se datorează structurii peretelui celular care conține în proporție de
60% lipide din categoria cerurilor.
I. Istoric și taxonomie
În 1882 Robert Koch a izolat și descris pentru prima dată agentul tuberculozei la om iar Erlich
a semnalat acidorezistența acestei bacterii .
Genul Mycobacterium include peste 100 de specii clasificate în complexe și grupe de specii
bazate pe înrudiri antigenice și asemănări fenotipice, după cum urmează:
 specii necultivabile: M.leprae și M.lepremurium ( specii strict parazite intracelular);
 specii cultivabile, care se grupează în funcție de timpul de dezvoltare:
o specii cu dezvoltare lentă (peste 7 zile), facultative intracelular, include peste
15 specii, din care: - subsp. avium
 complexul M.avium - subsp.intracellulare
- subsp.paratuberculosis
- subsp.silvaticum

 complexul M.bovis - subsp. bovis

- subsp. africanum
- subsp.BCG

 M.tuberculosis (bacilul Koch)

o specii cu dezvoltare rapidă (sub 7 zile),peste 30 de specii, din care:
 saprofite - M.phlei
- M.smegmatis

75
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

- M.fortuitum
 ocazional patogene - M.kansasii
pentru animale cu sânge rece - M.ulcerans
- M.chelonei
- marinum
II. Ecologie
Micobacteriile patogene se multiplică numai în organismele bolnave, care elimină germenii
prin secreții și excreții, contaminând mediile naturale, în care rezistă o lungă perioadă de timp.
III. Infecția naturală
La animale, micobacteriile patogene determină tuberculoza și paratuberculoza. Tuberculoza,
boală comună omului și animalelor, evoluează obișnuit cronic, după o perioadă lungă de incubație, cu
o simptomatologie necaracteristică, polimorfă în funcție de specie și de localizarea procesului
infecțios (pulmonară, ganglionară, osoasă, mamară etc.). În forma cronică, leziunile sunt de tip
granulomatos.
Agenții etiologici ai tuberculozei la om și animalele cu sânge cald sunt: M. tuberculosis, M.
bovis subsp. bovis și M. avium subsp. avium. Receptivitatea la aceste specii diferă după cum urmează:
o omul este receptiv la M. tuberculosis (bacilul lui Koch), M. bovis și M.
africanum (în special, copiii);
o taurinele sunt receptive la M. bovis ; celelalte specii, inclusiv cele nepatogene,
nu produc boala, dar induc o stare de alergie, care generează reacții fals
positive la testul de tuberculinare.
o Ovinele și caprinele fac tuberculoză cu M. bovis și rar M. avium;
o Suinele și cabalinele se pot îmbolnăvi cu toate cele trei specii, dar sunt mai
receptive la M. bovis;
o Carnasierele se infectează cu M. tuberculosis (cu predilecție câinele, prin
coabitare cu omul bolnav) și cu M. bovis (pisica, prin consum de lapte provenit
de la vacile bolnave);
o Galinaceele sunt receptive la M. avium dar pot face boala și cu M.
intracellulare și M. silvaticum;
o Papagalii și canarii fac tuberculoză cu M. avium dar și cu M. tuberculosis (prin
coabitare cu omul bolnav).

IV. Conduita diagnosticului etiologic

 examenul bacterioscopic direct se face pe frotiuri colorate prin metoda Ziehl Neelsen
(fig.8.1., fig.8.2., fig.8.3.).
76
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

Examenul are valoare diagnostică la păsări și la animalele de blană, deoarece la aceste specii
leziunile tuberculoase sunt bogate în germeni; în frotiurile efectate prin strivirea granuloamelor, bacilii
apar grupați ,,în cuiburi" și adesea fagocitați .
La animalele mari, mai ales la bovine, materialele patologice sunt paucibacteriene (sărace în
germeni), aspect care impune efectuarea frotiurilor după o îmbogățirea prealabilă a acestora, prin
aplicarea unor metode adecvate prelevatului: centrifugarea probelor de lapte, microculturi pe lamă din
cazeum ș.a.

Fig. 8.1. Mycobacterium
tuberculosis- aspecte morfologice,
frotiu direct din material
patologic, col. Ziehl Neelsen, MO,
x1000
en.wikipedia.org
Fig. 8.2. Mycobacterium bovis -
aspecte morfologice, frotiu
direct din material patologic,
col. Ziehl Neelsen, MO, x1000
en.wikipedia.org
Fig. 8.3. Mycobacterium avium-
aspecte morfologice, frotiu direct
din material patologic, col. Ziehl
Neelsen, MO, x1000
med.utah.edu

 examenul bacteriologic propriu-zis

1. Condiții de cultivare
Micobacteriile sunt bacterii aerobe, cu excepția speciilor M. bovis și M. africanum care sunt
microaerofile.
Cultivarea se face numai pe medii speciale, obișnuit pe agaruri ce conțin ovalbumină
(Lowenstein, Lowenstein-Jensen, Petragnani).
Însămânțarea pe medii lichide (Sauton, Youmans, Dubos) se practică pentru producția de
tuberculină sau pentru testarea sensibilității tulpinilor față de antibiotice.
Dacă prelevatele sunt necontaminate cu alți germeni, însămânțarea se face direct, iar dacă sunt
contaminate (cazeumul din leziunile deschise, sputa, aspiratul bronșic sau gastric etc.), se realizează
mai întâi decontaminarea chimică a acestora prin metoda Saenz-Costil sau Petroff (tratare cu H2SO4
15%, timp de 15-20 minute, urmată de neutralizare cu NaOH 40% ) -vezi semestrul I.
Bacilii tuberculozei se dezvoltă optim la 35-370C (M. avium la 420C) și nu se dezvoltă la 25-
320C, criteriu de diferențiere față de micobacteriile saprofite și comensale.
Timpul de incubare necesar pentru obținerea culturilor variază în funcție de specie:

77
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

- 10-15 zile, pentru M. avium;

- 15-30 zile pentru M. tuberculosis;
- 30-90 zile, pentru M.bovis (specie disgonică).
2. Caractere culturale
În mediile de cultură lichide, bacilii tuberculozei formează la suprafață o peliculă groasă și
încrețită, din care se desprind expansiuni. Prin învechire, pelicula sedimentează și la suprafață se
formează o nouă peliculă.
Pe mediile solide, la izolare, tipul culturilor diferă în funcție de specie, constituind un important
criteriu taxonomic (fig.8.4. ):
 M. tuberculosis formează colonii de tip R- granulare, neregulate, greu omogenizabile,
galbene sau roz;
 M. bovis și M. avium formează colonii de tip S – rotunde, bombate sau crateriforme,
alb-gălbui .

Fig.8.4.Aspecte culturale pe mediul Lowenstein: Mycobacterium tuberculosis (stânga); Mycobacterium avium

(mijloc); Mycobacterium bovis (dreapta)
http://www.asbmb.org/; Sevilla, 2007, BMC Microbiology; wikimedia.org

3. Caractere morfologice
Micobacteriile sunt bacili fini, drepți sau ușor încurbați, nesporogeni, neciliați, necapsulați, cu
mici diferențe între specii privind dimensiunile:
- bacilii de tip uman au dimensiuni de 1-4/0,3-0,6µ;
- bacilii de tip bovin sunt mai scurți și mai groși;
- bacilii de tip aviar sunt mai lungi, uneori filamentoași, cu sau fără ramificații;
În frotiurile colorate prin metoda Ziehl-Neelsen, bacilii tuberculozei apar colorați în roșu pe
fond albastru, adesea grupați caracteristic în șuvițe sau corzi.
Caracteristicile tinctoriale se explică prin acidorezistența germenilor (capacitatea de a rezista la
decolorare cu soluții acide),conferită de cerurile din peretele celular, iar modul de grupare se datorează

78
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

unei glicolipide membranare (6,6,-dimycoltrehaloza), numită cord-factor, care are și rol antifagocitar.
Citoplasma micobacteriilor prezintă uneori granule metacromatice, numite granulele lui Much.

4. Caractere biochimice
În practica obișnuită de diagnostic, nu se determină caracterele biochimice decât atunci când
se impune diferențierea speciilor. În acest scop se efectuează: testul niacinei, hidroliza Tween 80,
producția de urează, catalaza, nicotinamidaza, reducerea nitraților ș.a.
5. Caractere antigenice și de patogenitate
Micobacteriile au o structură antigenică complexă; posedă antigene lipidice, poliglucidice și
proteice (proteina purificată constituie tuberculina utilizată în diagnosticul alergic).
Ele prezintă antigene proprii, de specie, dar și antigene comune. Înrudirile antigenice pot
genera reacții alergice nespecifice (paraalergii) în cazul diagnosticului alergic al tuberculozei prin
tuberculinare.
Bacilii tuberculozei au o virulență redusă și sunt lipsiți de toxicitate dar au o capacitate
crescută de sensibilizare. Patogenitatea lor se datorează rezistenței la digestie în fagocite datorată
lipidelor din peretele celular, astfel încât fagocitele, în citoplasma cărora bacilii se multiplică,
degenerează transformându-se în celule gigante de tip Langhans, care constituie factori de difuzare a
infecției în organism.
6. Infecție experimentală
Pentru diferențierea speciilor M.tuberculosis, M. bovis și M. avium se inoculează experimental
cobaiul, iepurele și găina:
 cobaiul este sensibil la M. tuberculosis și M. bovis;
 iepurele se infectează cu M. bovis și M. avium (inoculat i.v. cu doze mari face
tuberculoză septicemică, de tip YERSIN) ;
 găina este receptivă numai la M. avium.

V. Sensibilitatea față de factorii de mediu și substanțe antimicrobiene

Micobacteriile:
 sunt rezistente la factorii de mediu, în special la întuneric și umiditate: rezistă 4 luni în
spută, 40 minute la 600C și 5 minute la 800C. Lumina solară le distruge în 10-24 zile
iar razele UV , în 30 de ore.
 sunt rezistente la acizi, baze, alcooli și numeroase antibiotice;
 sunt natural sensibile la o serie de antibiotice și chimioterapice, cunoscute sub numele
de tuberculostatice: streptomicina, rifampicina, cicloserina, etanbutolul, pirazinamida,
79
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

izoniazida (HIN), acidul paraaminosalicilic (PAS). La ora actuală se izolează frecvent

mutante rezistente la majoritatea tuberculostaticelor, fapt care determină creșterea
alarmantă a mortalității prin tuberculoză, de la un an la altul.
VI. Imunoprofilaxie
La noi în țară nu se practică vaccinarea animalelor pentru a facilita depistarea animalelor
bolnave prin teste alergice și examene serologice, - investigații la care animalele vaccinate
reacționează identic cu cele bolnave.
La om, se utilizează vaccinul BCG (bacilul Calmette Guerin) preparat din tulpina bovină Lait
Nocard, atenuată de cei doi cercetători prin pasaje repetate pe mediu cu cartof glicerinat și bilă de bou
(198 de pasaje, în 11 ani).

FAMILIA NOCARDIACEAE
GENUL NOCARDIA

Genul grupează peste 85 de specii apropiate de actinomicete prin forma lor filamentoasă și
ramificată, care au un grad redus de acidorezistență și sunt aerobe.

NOCARDIA ASTEROIDES
I. Istoric și taxonomie
În 1891, Eppinger a izolat dintr-un abces cranian, o bacteria aerobă filamentoasă, pe care a
denumit-o Cladothrix asteroids. În 1896, Blanchard o redenumeşte Nocardia asteroids (Bergey’s
Manual of Systematic Bacteriology, vol.V).

II. Ecologie
Nocardiile sunt germeni ubicvitari, saprofiți ai solului, apei și materiilor organice în
descompunere. Ocazional contaminează pielea omului și animalelor. Din cele peste 85 de specii ale
genului, N.asteroides este considerată cea mai importantă pentru patologia veterinară.

III. Infecția naturală

Boala produsă se numește nocardioză și se caracterizată prin evoluție cronică și leziuni de tip
granulomatos-supurative.
La bovine – produce mastite (primul focar la noi în țară a fost descris de Țogoe în 1983).
La carnivore și alte specii de animale produce sporadic leziuni supurative localizate subcutanat
sau la nivelul limfonodulilor, prenumonii, mastite, peritonite etc.
80
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

La om – sunt descrise cazuri de nocardioză cutantă, pulmonară și forme diseminate la nivelul

creierului sau meningelui.

IV. Conduita diagnosticului etiologic

 examenul bacterioscopic direct este edificator pentru diagnostic.
Frotiurile se efectuează din granuloame etalate prin strivire sau din puroi și se colorează prin
metoda Gram sau/și prin metoda Ziehl-Neelsen. Diagnosticul este pozitiv când se pun în evidență
filamente ramificate Gram pozitiv, respectiv cu un oarecare grad de acidorezistență (fig.8.5.).

Fig. 8.5. Nocardia asteroids - frotiu din material patologic, col. Gram (stânga) și col. Ziehl-Neelsen (dreapta)
https://quizlet.com,

 examenul bacteriologic propriu-zis

1. Condiții de cultivare
Bacteria cultivă, în condiții de aerobioză, pe medii uzuale pentru bacterii, pe medii pentru
micobacterii (Loewenstein) și pe medii pentru miceți (Sabouraud, Czapeck). Cultura devine vizibilă
după 4-5 zile, la 370C.
Prelevatele contaminate cu floră de asociație pot fi însămânțate pe medii selective: agar DST
(Diagnostic Sensitivity Test Agar, Oxoid) suplimentat cu tetraciclina și un antifungic; mediul BCYE
(Bufferes Charcoal Yeast Extract, Oxoid) suplimentat cu polimixina și vancomicină.
2. Caractere culturale
Pe medii lichide formează o peliculă groasă, cutată la suprafață, mediul rămânând limpede.
Pe mediile solide formează coloni de tip R, opace, alb-cretacee, uneori pigmentate în
portocaliu sau roșu. Pe agar-sânge formează colonii mici, uneori înconjurate cu o discretă zonă de alfa-
hemoliză.
După 3 zile de incubare, coloniile de Nocardia asteroides cresc în dimensiuni și devin aderente
la mediu, ca urmare a formării hifelor submerse (fig.8.6., fig.8.7., fig.8.8.).

81
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

Fig.8.6.Nocardia asteroides- Fig.8.7.Nocardia asteroides- Fig.8.8. Nocardia asteroides-

cultură pe mediul lichid aspecte culturale pe mediul cultură pe agar sânge
Sabouraud glucozat http://genetical.ir/
http://www.lookfordiagnosis.com/

3. Caractere morfologice
Nocardia asteroides este un germen polimorf, cu predominanța formelor filamentntoase subțiri
și ramnificate în unghi drept, uneori cu extremitățile dilatate, neciliat, nesporulat, necapsulat, Gram
pozitiv (fig.8.9).

Fig. 8.9. Nocardia asteroides- frotiuri din culturi, col. Gram, MO, x1000
http://www.lookfordiagnosis.com/

4. Caractere biochimice
Nocardia asteroides este catalază pozitiv, hidrolizează ureea, nu degradează adenina, cazeina,
tirozina și xantina.
5. Caractere antigenice și de patogenitate
Pe baza structurii antigenice, au fost identificate 7 imunotipuri.
Virulența N. asteroids este dată de capacitatea de a se dezvolta facultativ intracelular, de
prezența glicolipidelor complexe din peretele celular.

V. Sensibilitatea față de factorii de mediu și substanțe antimicrobiene

Nocardiile sunt sensibile la aminoglicozide, tetracicline, sulfonamide (sulfadiazină, trimetoprim,
sulfametoxazolul).
Mai puțin eficiente sunt cefalosporine, penicilinele și glicopeptidele.
82
BACTERIOLOGIE SPECIALĂ - ÎNDRUMĂTOR DE LUCRĂRI PRACTICE 2015

83